一例鴨疫里默氏桿菌病的病原分離鑒定及治療

摘 要：為確診廣西田東縣某肉鴨場(chǎng)疑似鴨漿膜炎的發(fā)病原因，無(wú)菌采集發(fā)病鴨的腦、肝臟及心臟組織，開(kāi)展細(xì)菌分離培養(yǎng)與鑒定，并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)和致病性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，分離菌在鮮血瓊脂平板上呈表面平滑、略微凸起、邊緣規(guī)則整齊、具有光澤且半透明的奶油狀菌落；革蘭氏染色、鏡檢為陰性短小桿菌，瑞氏染色則呈現(xiàn)兩極濃染特征。生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果與鴨疫里默氏桿菌的生化特性相符，致病性試驗(yàn)表明其具有較強(qiáng)致病性，藥敏試驗(yàn)顯示該菌對(duì)氟苯尼考、多西環(huán)素、紅霉素高度敏感。試驗(yàn)結(jié)果表明，引發(fā)該鴨場(chǎng)發(fā)病的病原為鴨疫里默氏桿菌，通過(guò)采取相應(yīng)治療措施，病情得到了有效控制。

關(guān)鍵詞：鴨疫里默氏桿菌；分離鑒定；藥敏試驗(yàn)；治療

中圖分類號(hào)：S858.32 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：C 文章編號(hào)：1673-1085（2024）11-0016-05

鴨疫里默氏桿菌病又稱鴨傳染性漿膜炎，是一種由鴨疫里默氏桿菌（Riemerella" anatipestifer，RA）引起鴨、鵝的接觸性傳染性疾病，多發(fā)生于1～8周齡雛鴨，發(fā)病率和死亡率極高[1]。肉鴨感染RA后表現(xiàn)眼鼻有分泌物、頭頸歪斜、腿翅癱軟、走路搖擺、仰翻臥地、兩腿呈劃水狀、共濟(jì)失調(diào)和抽搐、腹瀉、肛門周圍羽毛粘有糞便等癥狀，剖檢可見(jiàn)典型的心包炎、肝周炎和氣囊炎的病變[2]。RA血清型眾多，全球已發(fā)現(xiàn)至少21種，國(guó)內(nèi)流行至少13種[3]，因不同血清型間缺少交叉免疫保護(hù)，疫苗保護(hù)效力有限，抗生素仍為治療RA感染的常用手段。但由于抗菌藥物的過(guò)度使用，導(dǎo)致RA對(duì)其它病原菌的耐藥性增加，并且RA在臨床上經(jīng)常與其它病原菌發(fā)生混合感染，已成為影響?zhàn)B鴨業(yè)的一種重要細(xì)菌性疾病。

2023年4月，田東縣平馬鎮(zhèn)某養(yǎng)鴨場(chǎng)飼喂的2 500只25日齡肉鴨突然發(fā)病，發(fā)病后每天死亡約65只，病死率高達(dá)53%。病鴨臨床上表現(xiàn)精神抑郁、走路不穩(wěn)、搖頭等癥狀，剖檢可見(jiàn)心包膜增厚、混濁，表面有灰黃色纖維素性滲出物，心包液增多。肝臟腫大，表面覆蓋略帶黃色纖維素性薄膜。氣囊混濁增厚，氣囊壁上附有纖維素性滲出物。根據(jù)以上臨床癥狀、病理變化，初步診斷為鴨疫里默氏桿菌病。為進(jìn)一步確診，無(wú)菌采集發(fā)病鴨的腦、心臟及肝臟等組織樣本，開(kāi)展RA的分離鑒定工作，并對(duì)RA的耐藥性及致病性進(jìn)行評(píng)估，以期為田東縣鴨疫里默氏桿菌病的治療和防控提供科學(xué)依據(jù)。

１" 材料與方法

1.1" 材料

1.1.1" 試驗(yàn)動(dòng)物" 5只發(fā)病鴨來(lái)自廣西田東縣平馬鎮(zhèn)某養(yǎng)鴨場(chǎng)，25日齡；12只14日齡健康雛鴨，購(gòu)于田東縣家禽交易市場(chǎng)。

1.1.2" 主要試劑" 巧克力培養(yǎng)基、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、鮮血瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白酶大豆肉湯（TSB）、革蘭氏染色試劑盒、瑞士染色試劑盒、抗菌藥敏紙片、生理生化鑒定試劑，均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.2" 方法

1.2.1" 病理剖檢" 解剖發(fā)病鴨，觀察腹腔內(nèi)器官的病理變化，同時(shí)填寫解剖記錄單。

1.2.2" 細(xì)菌分離純化及形態(tài)觀察" 剖檢發(fā)病鴨，無(wú)菌采集腦、肝臟、心臟組織各20 g，分別存放到無(wú)菌EP管中，冷藏保存?zhèn)溆?。鮮血瓊脂培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基分別劃線接種腦、心、肝組織，鮮血瓊脂培養(yǎng)基置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。挑取單個(gè)典型菌落，接種到巧克力瓊脂培養(yǎng)基中純化培養(yǎng)，隨后將純化后的單菌落接種到TSB進(jìn)行增菌培養(yǎng)，并保存菌種。

1.2.3" 分離菌的生化試驗(yàn)" 挑取分離菌的純化單菌落接種于乳糖、枸櫞酸鹽、七葉苷、蔗糖、甘露醇、麥芽糖、吲哚、葡萄糖、尿素、賴氨酸、硫化氫、氧化酶、M-R、V-P、觸酶15種生化鑒定管中，接種后的生化管置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，按照生化鑒定試劑說(shuō)明書對(duì)各種生化鑒定管的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定。

1.2.4" 藥敏試驗(yàn)" 按《獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[4]，取分離菌純化后的菌液150 L，均勻涂抹在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上，待菌液吸收后，無(wú)菌操作將氟苯尼考、慶大霉素、新霉素、卡那霉素、阿米卡星、頭孢噻肟、阿莫西林、紅霉素、復(fù)方新諾明、多西環(huán)素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、多黏菌素13種抗菌藥物的藥敏紙片貼在鮮血瓊脂培養(yǎng)基表面上，置37 ℃培養(yǎng)24 h。最后測(cè)量抑菌圈并記錄結(jié)果，按說(shuō)明書判定藥物敏感性。

1.2.5" 動(dòng)物回歸試驗(yàn)" 將分離菌接種于巧克力培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)36 h。然后刮取菌落，加入生理鹽水，制成細(xì)菌混懸液，調(diào)整菌濃度至10 CFU/mL。12只14日齡麻鴨分為2組，即試驗(yàn)組、對(duì)照組，每組6只。試驗(yàn)組鴨腹腔注射分離菌混懸液0.5 mL/只；對(duì)照組鴨腹腔注射生理鹽水0.5 mL/只。各組鴨分別飼養(yǎng)，密切觀察其發(fā)病及死亡狀況。剖檢死亡的雛鴨，無(wú)菌采集腦、肝臟、心臟組織，細(xì)菌分離培養(yǎng)與鑒定。

2" 結(jié)果

2.1" 病理剖檢

心外膜覆蓋一層黃白色的纖維素性包膜，見(jiàn)圖1A；肝臟體積明顯增大，表面有黃白色纖維素性滲出物，見(jiàn)圖1B；氣囊渾濁且增厚，氣囊壁上可見(jiàn)針尖大小類似蛋黃的物質(zhì)。除此之外，還有個(gè)別病例脾臟呈現(xiàn)斑點(diǎn)樣腫脹，腎臟間質(zhì)明顯可見(jiàn)，小腸壁較薄，腸腔內(nèi)有黃色液體聚集。

2.2" 細(xì)菌分離純化及形態(tài)觀察

在麥康凱平板和普通平板未見(jiàn)菌落生長(zhǎng)，在鮮血瓊脂平板上生長(zhǎng)表面平滑、略微凸起、邊緣規(guī)則整齊、具有光澤且呈現(xiàn)半透明的奶油狀菌落。挑取單菌落進(jìn)行染色、鏡檢，可見(jiàn)革蘭氏陰性的單個(gè)存在或呈鏈狀排列的無(wú)芽胞短小桿菌；瑞士染色兩極濃染，符合RA形態(tài)特征。將成功分離出的菌株命名為TDRA-01。

2.3" 生化試驗(yàn)

生化試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌對(duì)尿素、氧化酶和觸酶反應(yīng)陽(yáng)性，不分解任何糖類，見(jiàn)表1。分離菌的生化反應(yīng)結(jié)果均與RA的生化特征一致。結(jié)合培養(yǎng)特性、菌體形態(tài)和生化反應(yīng)結(jié)果，初步判定該株分離菌為RA。

2.4" 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。13種抗生素中，分離菌株對(duì)氟苯尼考、紅霉素、多西環(huán)素3種藥物高度敏感（3/13），對(duì)慶大霉素、新霉素、卡那霉素、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星5種藥物中度敏感（5/13），對(duì)阿米卡星、阿莫西林、復(fù)方新諾明、恩諾沙星、多黏菌素5種藥物耐藥（5/13）。

2.5" 分離菌的動(dòng)物回歸試驗(yàn)

接種后1～3 d，試驗(yàn)組的雛鴨表現(xiàn)出與發(fā)病鴨相似的臨床癥狀，精神沉郁、食欲減退或廢食，眼、鼻有漿液性的分泌物、呼吸困難、斜頸、轉(zhuǎn)圈、倒退、扎堆聚集，排黃色或黃綠色糞便等，一般2～3 d內(nèi)就會(huì)死亡，而對(duì)照組雛鴨未發(fā)現(xiàn)異常。解剖病死鴨，可見(jiàn)心臟有石灰樣的纖維素性滲出物包裹；肝臟腫大且質(zhì)地脆弱，表面有纖維素性滲出物；氣囊渾濁，脾臟略腫大，呈紅灰色斑駁狀，表面有灰白色壞死點(diǎn)；腦膜及腦實(shí)質(zhì)血管擴(kuò)張、淤血。這與發(fā)病鴨的剖檢變化極為相似。病死雛鴨的腦、肝、脾組織無(wú)菌接種于巧克力瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h后，經(jīng)染色鏡檢和生化試驗(yàn)，所得結(jié)果均與接種菌株一致。

3" 防治措施

根據(jù)診斷及藥敏試驗(yàn)結(jié)果，采取以下防治措施：（1）按照發(fā)病前每天350 kg飼料量計(jì)算用藥劑量，10%多西環(huán)素700 g與10%氟苯尼考700 g聯(lián)合拌入飼料中飼喂，持續(xù)5 d；（2）瀕死鴨、病死鴨作深埋無(wú)害化處理，防止感染假定健康鴨群；（3）加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，認(rèn)真做好衛(wèi)生清潔和消毒，確保通風(fēng)良好，防止扎堆，降低鴨群應(yīng)激反應(yīng)。用藥第5天，鴨群再無(wú)發(fā)病，病情得以有效控制。

4" 討論

養(yǎng)鴨業(yè)在田東縣發(fā)展庭院經(jīng)濟(jì)模式中占據(jù)著重要地位，為群眾帶來(lái)了明顯的增收效果。但隨著鴨養(yǎng)殖密度不斷增大，養(yǎng)殖環(huán)境差等問(wèn)題日益凸顯，鴨疫里默氏桿菌病等細(xì)菌性疾病頻繁發(fā)生。鴨疫里默氏桿菌（RA）屬于革蘭氏陰性菌，有莢膜，不形成芽孢，無(wú)內(nèi)孔且不能運(yùn)動(dòng)，歸屬于黃桿菌科里默氏桿菌屬，它能通過(guò)呼吸道和皮膚傷口水平傳播，也可垂直傳播[5]。當(dāng)前，多種病原微生物混合感染的情況極為常見(jiàn)，且臨床癥狀和病理變化極為相似甚至相同，臨床上區(qū)分RA與大腸桿菌、沙門氏菌和多殺性巴氏桿菌感染十分困難[5]，因此對(duì)病原微生物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)很有必要。現(xiàn)階段，細(xì)菌分離純化、形態(tài)觀察、生化試驗(yàn)是基層獸醫(yī)工作者對(duì)臨床分離菌株初步鑒定的常用實(shí)驗(yàn)室診斷方法。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)發(fā)病鴨剖檢、細(xì)菌分離鑒定與生化試驗(yàn)，初步判斷分離菌株TDRA-01為鴨疫里默式桿菌。需要注意的是，已有研究表明不同來(lái)源的RA在生化特性上存在部分差異，大部分RA不發(fā)酵碳水化合物，只有少數(shù)菌株能夠發(fā)酵葡萄糖、果糖和麥芽糖等[6]，單靠生化試驗(yàn)結(jié)果診斷會(huì)出現(xiàn)偏差。這提示基層獸醫(yī)工作者面臨實(shí)驗(yàn)室條件限制時(shí)，對(duì)病例的診斷除結(jié)合臨床癥狀、細(xì)菌分離鑒定、生化實(shí)驗(yàn)等常用方法外，還可以利用動(dòng)物回歸試驗(yàn)、商品化的PCR診斷試劑盒等方法確診。

RA血清型較多，國(guó)際已報(bào)道有21種，且各種血清型之間不產(chǎn)生交叉保護(hù)，投喂抗菌藥物是當(dāng)前普遍采用的防治手段[7]。使用抗生素防治RA感染的同時(shí)，也增加了耐藥菌株的出現(xiàn)和傳播，這給鴨疫里默氏桿菌病的防治帶來(lái)很大困難。從RA耐藥性來(lái)看，不同地方不同時(shí)間分離的RA耐藥性差異較大[8]。本次藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌對(duì)5種抗生素產(chǎn)生了耐藥性，高度敏感藥物僅有氟苯尼考、紅霉素、多西環(huán)素3種。由此可見(jiàn)，分離菌TDRA-01耐藥性較強(qiáng)、耐藥范圍比較廣泛。目前臨床上用于治療RA的常規(guī)藥物種類相對(duì)有限；一些藥物在較低濃度時(shí)，其療效作用已經(jīng)微乎其微，這也使得臨床藥物防治該病的難度進(jìn)一步增加。穿梭用藥、聯(lián)合用藥和高價(jià)藥品的使用，不僅導(dǎo)致畜禽養(yǎng)殖成本的上升，也將進(jìn)一步加劇RA對(duì)個(gè)別藥品產(chǎn)生耐藥性。因此，建議將敏感藥物選為該病例的臨床治療藥物，避免因耐藥性帶來(lái)經(jīng)濟(jì)損失。

鴨傳染性漿膜炎是鴨的一種接觸性、急性或慢性、敗血性傳染病，其主要對(duì)1～8周齡雛鴨影響較大，以2～3周齡的雛鴨最易感。本病的發(fā)生、流行與環(huán)境因素有著極為緊密的關(guān)聯(lián)。衛(wèi)生條件較差、飼養(yǎng)密度過(guò)高、飼料營(yíng)養(yǎng)不均衡或缺乏維生素、微量元素等，都易造成本病的繼發(fā)或并發(fā)病毒性肝炎、大腸桿菌等混合感染。養(yǎng)殖過(guò)程中，應(yīng)認(rèn)真做好飼養(yǎng)管理工作，這是預(yù)防鴨疫里默氏桿菌病的重要關(guān)鍵環(huán)節(jié)[9]。

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收稿日期：2024-05-09

第一作者：陸璐（1970—），男，本科，獸醫(yī)師，從事動(dòng)物疫病防控和畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣工作，E-mail：LZF18977635113@163.com

通信作者：班雪花（1975—），女，本科，高級(jí)獸醫(yī)師，從事動(dòng)物疫病防控工作，E-mail： 1071511569@qq.com