基于SSR熒光標(biāo)記法的桃同名異物品種鑒定技術(shù)與應(yīng)用

摘 要：為高效鑒別桃種質(zhì)遺傳差異及區(qū)分同名異物品種，建立了基于SSR熒光標(biāo)記法的桃同名異物鑒定技術(shù)，利用10對(duì)SSR核心引物，通過(guò)SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳技術(shù)檢測(cè)擴(kuò)增條帶確定基因型，并對(duì)基因型進(jìn)行分析和賦值，構(gòu)建分子身份證。利用該鑒定技術(shù)進(jìn)行同名異物品種鑒定、苗木純度分析和種質(zhì)資源剔重，鑒定3對(duì)疑似同名異物桃品種、50份中油蟠9號(hào)桃苗木和102份新收集種質(zhì)資源，結(jié)果表明，突圍和春美、8D35和HBZZ10引物差異位點(diǎn)數(shù)目為0，分別判定為同名異物品種；50份中油蟠9號(hào)苗木差異位點(diǎn)數(shù)目為0，且與中油蟠9號(hào)相比差異位點(diǎn)數(shù)目為0，判定為同一品種，說(shuō)明苗木純度為100%；莎車(chē)白肉桃2號(hào)、莎車(chē)綠肉桃9號(hào)、莎車(chē)綠肉桃5號(hào)3份種質(zhì)差異位點(diǎn)數(shù)目為0，莎車(chē)白肉桃4號(hào)和莎車(chē)白肉桃6號(hào)差異位點(diǎn)數(shù)目為0，說(shuō)明上述5份種質(zhì)保存2份即可。該技術(shù)的應(yīng)用對(duì)知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)和種質(zhì)資源的高效保存具有重要意義。

關(guān)鍵詞：桃；種質(zhì)資源；SSR熒光標(biāo)記；分子身份證

桃（Prunus persica）是薔薇科李屬果樹(shù)，目前在全球范圍內(nèi)廣泛栽培，我國(guó)作為桃的起源與演化中心，種質(zhì)資源十分豐富，栽培范圍與產(chǎn)量總體呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)，目前在北京、南京和鄭州均建有國(guó)家級(jí)桃種質(zhì)資源庫(kù)[1-2]。近年來(lái)，我國(guó)桃產(chǎn)業(yè)技術(shù)取得長(zhǎng)足進(jìn)步，優(yōu)質(zhì)桃新品種的培育和推廣也得到了迅速發(fā)展，同時(shí)，部分桃品種間遺傳交流也日益增多，一些桃種質(zhì)的表型和果實(shí)品質(zhì)差別不大，易出現(xiàn)同名異物等問(wèn)題，亟待利用現(xiàn)代先進(jìn)的鑒別技術(shù)，為桃品種保護(hù)提供理論和技術(shù)上的支持，這對(duì)桃種質(zhì)資源的保存與生產(chǎn)育種等具有重要意義[3]。

基于桃表型特征的鑒別技術(shù)難以用于種質(zhì)資源的精準(zhǔn)鑒定，其結(jié)果易受外界因素的干擾，同時(shí)需要有較強(qiáng)的專(zhuān)業(yè)知識(shí)，否則在實(shí)際應(yīng)用中會(huì)受到極大限制，因此迫切需要建立一套快速、準(zhǔn)確的桃種質(zhì)鑒別技術(shù)。目前，以PCR為代表的分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用，為桃種質(zhì)資源的鑒別提供了良好的技術(shù)支撐[4-5]。利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)可以在植物DNA水平上進(jìn)行檢測(cè)，目前該技術(shù)較為成熟，不依賴表型特征，具有穩(wěn)定性好、可重復(fù)性高、多態(tài)性高、易操作、高效等優(yōu)點(diǎn)[6]，可實(shí)現(xiàn)大批量樣品的精準(zhǔn)檢測(cè)，近年來(lái)已廣泛應(yīng)用于蘋(píng)果[7]、梨[8]、棗[9]等果樹(shù)的分子身份證、分子指紋圖譜和品種鑒別研究[10]。

SSR分子標(biāo)記技術(shù)是區(qū)分鑒別植物不同品種的重要方法之一，吳仕蔓等[11]采用4對(duì)SSR引物構(gòu)建了22份柚類(lèi)種質(zhì)分子身份證，用于品種資源的鑒定；武志江等[12]以20對(duì)核心引物為基礎(chǔ)，通過(guò)數(shù)字和小寫(xiě)英文字母結(jié)合的方法，分別與其擴(kuò)增的不同帶型編碼進(jìn)行匹配，從而建立145個(gè)火龍果資源的分子身份證編碼，高效區(qū)分不同種質(zhì)的目的；唐玉娟等[13]用12對(duì)SSR熒光引物對(duì)145份杧果種質(zhì)進(jìn)行基因擴(kuò)增獲得分子身份證，認(rèn)為采用熒光標(biāo)記方法在種質(zhì)鑒定方面更占優(yōu)勢(shì)，鑒定效率顯著優(yōu)于傳統(tǒng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)技術(shù)。因此，通過(guò)建立桃種質(zhì)資源的分子身份證編碼，可對(duì)桃不同品種進(jìn)行高效的鑒別，從而實(shí)現(xiàn)桃種質(zhì)的合理開(kāi)發(fā)和保護(hù)。因此，筆者在本研究中通過(guò)多態(tài)性良好的10對(duì)SSR熒光引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳技術(shù)對(duì)擴(kuò)增帶型進(jìn)行分析，結(jié)合帶型編碼，構(gòu)建桃種質(zhì)資源的分子身份證，旨在從分子水平分別探討3對(duì)疑似同名異物桃品種、從10 000株中油蟠9號(hào)苗木中隨機(jī)選取的50棵苗木和102份新收集的桃種質(zhì)資源中是否存在同名異物現(xiàn)象，為桃品種的區(qū)分和鑒別提供科學(xué)依據(jù)。

1 基于SSR熒光標(biāo)記法的桃同名異物鑒定技術(shù)

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為：3對(duì)疑似同名異物桃品種、從10 000株中油蟠9號(hào)苗木中隨機(jī)選取的50棵苗木和102份新收集的桃種質(zhì)資源。于2024年7—8月采集嫩葉，用變色硅膠快速干燥，置于密封袋中室溫保存，作為試驗(yàn)材料保存?zhèn)溆?。具體信息見(jiàn)表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 桃葉片DNA提取及檢測(cè) 利用普樂(lè)海公司的植物基因組DNA提取試劑盒對(duì)桃葉片進(jìn)行基因組DNA提取，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)樣品DNA的質(zhì)量，微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度值并將所提取的基因組DNA質(zhì)量濃度稀釋至50 納克/微升，-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SSR-PCR擴(kuò)增及熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測(cè) 對(duì)所提取的所有試驗(yàn)材料總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳的PCR擴(kuò)增體系為25微升：ddH2O 10.5微升，2×plus PCR MasterMix 12.5微升，正、反向引物（10微摩爾·升-1）各0.5微升，DNA模板1.0 微升。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3分鐘；94 ℃變性10秒，55 ℃退火15秒，72 ℃延伸8秒，35次循環(huán)；72 ℃延伸5分鐘；4 ℃保存?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測(cè)。選用的核心引物來(lái)源于關(guān)利平[14]的研究，具體信息如表2所示。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入GeneMarker 2.2.0進(jìn)行基因型判讀并獲取不同樣品擴(kuò)增片段大小，構(gòu)建分子身份證，判斷供試材料中是否存在同名異物的重復(fù)種質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 3對(duì)疑似同名異物桃品種資源的分子身份證編碼

按表2所示的引物順序，將每對(duì)引物在不同樣品上擴(kuò)增得到的帶型按照由少至多的順序排列并將其編碼進(jìn)行串聯(lián)，對(duì)應(yīng)位置編碼相同則表明該引物在不同樣品上得到了相同的擴(kuò)增帶型。比如桃種質(zhì)突圍的分子身份證編碼為2341142212，即10對(duì)熒光引物標(biāo)記擴(kuò)增的結(jié)果依次是SSR73（158/170）、SSR93（172/172）、SSR96（139/141）、SSR107（155/155）、SSR125（136/136）、SSR152（251/251）、SSR169（237/237）、SSR179（223/249）、SSR181（189/191）、SSR184（239/262）。

結(jié)果表明（表3），在供試的3對(duì)疑似同名異物桃種質(zhì)資源中得到了4個(gè)不同類(lèi)型的分子身份證編碼，其中，突圍和春美、8D35和HBZZ共2對(duì)桃種質(zhì)共用同一個(gè)分子身份證編碼。中桃緋玉和極早紅毛桃的分子身份證編碼不同，說(shuō)明二者屬于不同桃種質(zhì)。通過(guò)分子身份證編碼，將供試的桃種質(zhì)進(jìn)行了合理的區(qū)分。其結(jié)果狀見(jiàn)圖1～圖6。

2.2 苗木純度鑒定

從供試的10 000株中油蟠9號(hào)苗木中隨機(jī)選取50棵苗木構(gòu)建分子身份證，通過(guò)10對(duì)引物的擴(kuò)增，供試的50棵中油蟠9號(hào)苗木的分子身份證編碼均是1111111111（表4），說(shuō)明這50棵苗木的分子身份證都是相同的，屬于同一個(gè)桃種質(zhì)，判定苗木純度為100%，因此通過(guò)構(gòu)建桃的分子身份證可以進(jìn)行批量苗木純度的鑒定應(yīng)用。

2.3 種質(zhì)資源的保存依據(jù)

本課題組在2023年新收集了102份新疆特色土桃資源，為高效入圃保存，需要剔除重復(fù)種質(zhì)。經(jīng)過(guò)10對(duì)SSR引物的擴(kuò)增，建立出99份不同的新疆土桃分子身份證編碼（表5）。其中莎車(chē)白肉桃2號(hào)和莎車(chē)綠肉桃9號(hào)共用一個(gè)分子身份證，莎車(chē)綠肉桃5號(hào)、莎車(chē)白肉桃4號(hào)和莎車(chē)白肉桃6號(hào)共用一個(gè)分子身份證，2組桃資源分別屬于同一個(gè)種質(zhì)，上述5份種質(zhì)保存2份即可。因此，分子身份證的構(gòu)建可以作為不同桃種質(zhì)資源的保存依據(jù)。

3 討 論

分子身份證是在DNA指紋圖譜的基礎(chǔ)上對(duì)電泳圖譜進(jìn)行數(shù)字轉(zhuǎn)化，基于SSR熒光標(biāo)記和毛細(xì)管電泳結(jié)合，將桃品種特征賦值后獲得特殊字符串，得到的身份證編碼可以簡(jiǎn)便高效地區(qū)分不同桃品種的特征，具有穩(wěn)定準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，便于記錄和比較各桃品種[15]。

關(guān)于桃種質(zhì)SSR引物的研究將有助于桃種質(zhì)資源鑒別的開(kāi)展。關(guān)利平[14]基于桃全基因組變異信息開(kāi)發(fā)了15個(gè)高多態(tài)性SSR標(biāo)記。王璐偉等[16]利用SSR熒光標(biāo)記構(gòu)建了79份桃種質(zhì)的居群遺傳結(jié)構(gòu)圖，篩選出可用于桃種質(zhì)鑒定的核心引物。殷紀(jì)偉等[17]基于10個(gè)SSR引物對(duì)154份桃品種進(jìn)行指紋采集，共檢測(cè)出140個(gè)等位變異和304個(gè)基因型。迄今為止，桃品種存在引種不規(guī)范的問(wèn)題，導(dǎo)致同名異物等現(xiàn)象的產(chǎn)生。若種苗流通市場(chǎng)不重視這些問(wèn)題，將造成部分種苗品種的不真實(shí)性，導(dǎo)致農(nóng)戶、生產(chǎn)企業(yè)和科研單位的損失，因此急需一套高效鑒別桃品種的技術(shù)體系作為支撐[18]。目前，通常采用構(gòu)建DNA分子身份證的方法鑒定種質(zhì)資源，本研究結(jié)果顯示突圍和春美，8D35和HBZZ，莎車(chē)白肉桃2號(hào)和莎車(chē)綠肉桃9號(hào)，莎車(chē)綠肉桃5號(hào)、莎車(chē)白肉桃4號(hào)和莎車(chē)白肉桃6號(hào)共4組桃種質(zhì)各自共用同一個(gè)分子身份證編碼，4組桃種質(zhì)分別屬于重復(fù)種質(zhì)。

不同的研究采用分子身份證的構(gòu)建方法也不同[19-21]，本研究通過(guò)將引物擴(kuò)增的帶型按照從小到大的順序排列并進(jìn)行編碼，得到各品種的分子身份證編碼。本研究得到的分子身份證編碼信息可以用于品種資源的區(qū)分和分類(lèi)。優(yōu)異種質(zhì)的精準(zhǔn)鑒定是桃新品種保護(hù)的基礎(chǔ)，因此分子身份證的構(gòu)建是桃基因種質(zhì)資源鑒別和新品種保護(hù)的重要手段，本研究初步構(gòu)建了3對(duì)疑似同名異物桃品種、從10 000株中油蟠9號(hào)苗木中隨機(jī)選取的50棵苗木和102份新收集的桃種質(zhì)資源的分子身份證，對(duì)高效區(qū)分桃品種資源具有重要意義。

4 結(jié) 論

本研究采用SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測(cè)技術(shù)構(gòu)建了3對(duì)疑似同名異物桃品種、50棵中油蟠9號(hào)苗木和102份新收集的桃種質(zhì)資源分子身份證，通過(guò)構(gòu)建其分子身份證編碼，區(qū)分出突圍和春美，8D35和HBZZ，莎車(chē)白肉桃2號(hào)和莎車(chē)綠肉桃9號(hào)，莎車(chē)綠肉桃5號(hào)、莎車(chē)白肉桃4號(hào)和莎車(chē)白肉桃6號(hào)共4組桃種質(zhì)各自共用同一個(gè)分子身份證編碼，分別屬于同一個(gè)桃品種。因此，基于SSR熒光標(biāo)記法的桃同名異物鑒定技術(shù)即構(gòu)建不同桃的分子身份證編碼可用于同名異物品種鑒定、苗木純度分析和種質(zhì)資源剔重。

參考文獻(xiàn)

[1] 周平，林志楷，郭瑞，等.低溫處理對(duì)桃樹(shù)葉片基因表達(dá)及類(lèi)黃酮合成代謝的影響[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2021，29（7）：1283-1294.

[2] 周媛媛，張苗，佟丙辛，等.冀中地區(qū)桃樹(shù)養(yǎng)分投入、土壤養(yǎng)分狀況及其與產(chǎn)量的關(guān)系[J].土壤通報(bào)，2019，50（3）：683-690.

[3] 關(guān)利平，王玲玲，曹珂，等.桃品種鑒定的SSR核心引物篩選及其應(yīng)用[J].中國(guó)果樹(shù)，2021（6）：33-38.

[4] 劉偉，李淼，李桂祥，等．應(yīng)用SSR熒光標(biāo)記法構(gòu)建山東地方桃種質(zhì)資源分子身份證[J]．山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2022，54（2）：6-13．

[5] 秦宇，郭榮琨，農(nóng)惠蘭，等．利用SSR熒光標(biāo)記構(gòu)建山楂種質(zhì)分子身份證[J]．園藝學(xué)報(bào)，2024，51（6）：1227-1240．

[6] SCHUELKE M．An economic method for the fluorescent labeling of PCR fragments[J]．Nature Biotechnology，2000，18（2）：233-234．

[7] 李慧峰，王濤，冉昆．利用SSR熒光標(biāo)記構(gòu)建41份山東省蘋(píng)果資源分子身份證[J]．沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，51（1）：70-77．

[8] 冉昆，隋靜，王宏偉，等．利用SSR熒光標(biāo)記構(gòu)建山東地方梨種質(zhì)資源分子身份證[J]．果樹(shù)學(xué)報(bào)，2018，35（增刊1）：71-78．

[9] 包文慧，包杭蓋，武陽(yáng)，等．基于SSR分子標(biāo)記的棗品種鑒定及DNA分子身份證構(gòu)建[J]．中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2024，（6）：175-185．

[10] 張明惠．當(dāng)歸不同品種（系）遺傳多樣性分析及分子身份證構(gòu)建[D]．蘭州：甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，2024．

[11] 吳仕蔓，婁兵海，陳傳武，等．應(yīng)用SSR熒光標(biāo)記法構(gòu)建22個(gè)柚類(lèi)品種的分子身份證[J]．果樹(shù)學(xué)報(bào)，2023，40（4）：605-614．

[12] 武志江，鄧海燕，梁桂東，等．利用熒光標(biāo)記SSR構(gòu)建火龍果種質(zhì)資源分子身份證[J]．中國(guó)南方果樹(shù)，2020，49（4）：20-28．

[13] 唐玉娟，羅世杏，黃國(guó)弟，等．基于SSR熒光標(biāo)記的杧果種質(zhì)資源遺傳多樣性分析及分子身份證構(gòu)建[J]．熱帶作物學(xué)報(bào)，2023，44（11）：2292-2304．

[14] 關(guān)利平．基于桃全基因組變異信息的SSR和SNP標(biāo)記開(kāi)發(fā)及應(yīng)用[D]．武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2020．

[15] 陳昌文，曹珂，王力榮，等．中國(guó)桃主要品種資源及其野生近緣種的分子身份證構(gòu)建[J]．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44（10）：2081-2093．

[16] 王璐偉，沈志軍，李賀歡，等．基于SSR熒光標(biāo)記的79份桃種質(zhì)遺傳多樣性分析[J]．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2022，55（15）：3002-3017．

[17] 殷紀(jì)偉，韓貝貝，馬瑩雪，等．基于SSR分子標(biāo)記的154份桃品種遺傳多樣性分析[J]．江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2023，51（16）：18-26．

[18] 張成才，王亞萍，王開(kāi)良，等．利用SSR構(gòu)建薄殼山核桃主要品種的分子身份證[J]．植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2022，23（6）：1835-1846．

[19] 張金煒，林立，張椿芳，等．81個(gè)鐵線蓮品種的SSR指紋圖譜構(gòu)建與遺傳多樣性分析[J]．分子植物育種，2024，22（14）：4630-4640．

[20] 蔡露瑩，劉松，聶興華，等．基于SSR構(gòu)建中國(guó)主栽草莓品種指紋圖譜[J]．北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2024，39（1）：7-12．

[21] 馮立娟，程云，王傳增，等．基于SSR標(biāo)記的石榴品種遺傳多樣性分析和指紋圖譜構(gòu)建[J]．山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2023，55（12）：26-33．

基金項(xiàng)目：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（1610192023310）；農(nóng)業(yè)農(nóng)村部物種保護(hù)項(xiàng)目（2016NWB041）。

*通信作者：王力榮，研究員，博士生導(dǎo)師。E-mail：wanglirong@caas.cn。