豬病毒性腹瀉滅活疫苗保存期試驗的研究

摘要：PEDV引起的產房仔豬腹瀉是目前危害養(yǎng)豬業(yè)的主要三大傳染?。ˋSF、PRRS、PED）之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經濟損失。疫苗免疫仍然是防控PEDV的主要手段。為保證豬病毒性腹瀉滅活疫苗在有效期內使用是安全、高效、穩(wěn)定的，將制備的腹瀉苗置2～8 ℃保存，選擇保存0、3、6、10、13個月的疫苗進行性狀及效力檢驗。結果表明，保存13個月內疫苗性狀穩(wěn)定，免疫PEDV雙陰性豬，血清PEDV ELISA 抗體和中和抗體效價均無明顯變化，且顯著高于競品苗。實際應用中，疫苗按規(guī)定條件儲存，在有效期內使用是有效的。

關鍵詞：PEDV；滅活疫苗；保存期

2010年底以來，由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diahorrea virus，PEDV）GⅡ群毒株引起的新生仔豬“頑固性腹瀉”，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經濟損失。目前已成為危害養(yǎng)豬業(yè)的三大傳染?。ˋSF、PRRS、PED）之一[1]。該病主要危害新生仔豬，臨床表現(xiàn)為嘔吐、水樣腹瀉、脫水、消瘦、死亡，以7日齡內仔豬發(fā)病最為嚴重，發(fā)病率與死亡率可高達100%[2]。生長育肥豬感染后也有發(fā)病，死亡率低[3]，但可長期排毒，是豬場發(fā)病的病毒來源之一。疫苗免疫仍然是防控PEDV的主要手段。本研究通過監(jiān)測腹瀉苗在2～8 ℃保存不同時間的質量情況，為疫苗在有效期內的有效使用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 疫苗

止瀉威0、止瀉威3、止瀉威6、止瀉威10、止瀉威13由廣東溫氏大華農生物科技有限公司提供。

競品1-6與競品2-5是從市場購買的同類產品，均在有效期內，分別保存6個月、5個月。

1.2 細胞及主要試劑

Vero細胞為本實驗室保存。DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清為Gibco公司產品。

1.3 試驗動物

3～5周齡PEDV抗原、抗體雙陰性斷奶仔豬（三元雜）。

2 方法

將腹瀉疫苗置2～8 ℃保存，選擇保存0、3、6、10、13個月的疫苗進行性狀及效力檢驗。

2.1 性狀檢驗

肉眼觀察，疫苗應未出現(xiàn)異常。

2.2 免疫效力檢驗

選3～5周齡PEDV抗原、抗體雙陰性斷奶仔豬40頭，平均分8個組，5頭/組。每個保存時間段的疫苗頸部肌肉注射5頭，免疫劑量2 mL/頭。14 d后，所有豬以相同劑量及免疫方式進行二免。所有豬每周分別采血，分離血清，測ELISA抗體效價和中和抗體效價。同時選擇兩個競品苗作為對照。

1）試驗分組及免疫方案見表1。

2）血清ELISA抗體檢測。采用奧睿特PEDV IgG抗體診斷試劑盒（購自國研科技）檢測血清PEDV IgG抗體，按照試劑盒說明書進行。

3）血清中和抗體檢測。測定PEDV病毒含量的具體操作步驟為：在EP管中用維持液將病毒液作10倍系列稀釋，從10-1至10-8，維持液為含5 ？滋g/mL胰酶的無血清DMEM；用維持液將96孔板中的vero細胞單層洗滌2次，取10-5至10-8稀釋度的病毒液接種到洗滌好的vero細胞孔中，每一稀釋度接種一列共8孔，每孔100 ？L；同時設8孔正常細胞對照，細胞對照孔的vero細胞單層同樣先用維持液洗滌2次，再在每孔中加入100 ？滋L維持液。將96孔板置37 ℃、含5％CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～7 d，每天觀察并記錄細胞病變。按Reed-Muench法計算TCID50。

中和抗體檢測方法：在EP管中用DMEM將血清做連續(xù)2倍系列稀釋，從2-1至2-10；在EP管中加入500 μL不同稀釋度的血清，再加入500 μL 100 TCID50/0.1 mL的病毒液，混勻，37 ℃中和60 min；取長滿單層vero細胞的96孔板，倒去上清液，用維持液洗板2次，維持液為含5 μg/mL胰酶的DMEM；每孔加入200 μL中和液，每個血清稀釋度接4個孔，37 ℃吸附60 min；倒去吸附液，用維持液洗板2次，加入維持液100 μL/孔。放置37 ℃培養(yǎng)5～7 d觀察細胞病變情況并記錄。同時設病毒對照和陰性血清對照。根據(jù)細胞病變程度，用Reed-Muench法計算50%血清中和終點。

3 結果

3.1 性狀檢驗

將腹瀉滅活疫苗置2～8 ℃保存，保存0、3、6、10、13個月的疫苗未出現(xiàn)異常，性狀均符合要求。

3.2 免疫效力

1）血清ELISA抗體結果。將腹瀉疫苗置2～8℃保存，選擇保存0、3、6、10、13個月的疫苗進行效力檢驗。選用3～5周齡PEDV雙陰性斷奶豬，免疫劑量2 mL/頭，一免后14 d以相同劑量及免疫方式進行二免。所有豬在一免后7 d、14 d、二免后7 d、14 d采血，用奧睿特PEDV IgG抗體診斷試劑盒檢測血清PEDV IgG抗體。結果表明，13個月內不同保存時間段的腹瀉滅活苗的免疫血清的ELISA抗體未發(fā)生明顯變化，且顯著高于競品苗。具體見圖1。

2）血清中和抗體結果。將腹瀉疫苗置2～8 ℃保存，選擇保存0、3、6、10、13個月的疫苗進行效力檢驗。選用3～5周齡PEDV雙陰性斷奶豬，免疫劑量2 mL/頭，一免后14 d以相同劑量及免疫方式進行二免。所有豬在二免后14 d采血，用PEDV MJ株測中和抗體水平。結果顯示，2～8 ℃保存0、3、6、10、13個月的腹瀉滅活苗的免疫血清的中和抗體水平未發(fā)生明顯變化，且顯著高于競品苗。具體見圖2。

4 討論

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diahorrea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒引起的一種感染豬以嘔吐、腹瀉、脫水、厭食和迅速消瘦為主要特征的高度接觸性腸道傳染病[4]。在自然條件下，PEDV通過口鼻途徑進入豬體內，各種年齡和品種的豬都有易感性，但對哺乳仔豬和育肥豬的危害更大，尤其對哺乳仔豬危害最為嚴重，發(fā)病率可達100%，病死率為30%～80%。PED呈世界范圍性流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經濟損失。對于PED的防控，疫苗免疫是比較經濟實惠的手段。

本研究通過監(jiān)測腹瀉苗在2～8 ℃保存不同時間的質量情況，為疫苗在有效期內的有效使用提供數(shù)據(jù)支持。本研究將5批豬腹瀉滅活疫苗置2～8 ℃保存，選擇保存0、3、6、10、13個月的疫苗進行性狀及效力檢驗。結果表明，疫苗保存13個月時，性狀均符合要求；免疫斷奶仔豬后免疫效力無明顯變化。這些試驗結果也間接驗證了疫苗生產工藝的穩(wěn)定性。在實際應用中，疫苗按規(guī)定保存條件2～8 ℃儲存[5]，在有效期12個月內使用無任何質量問題，可放心使用。

參考文獻：

[1] 何玲，鐘采靈，王鳳國，等.豬病毒性腹瀉滅活疫苗對仔豬保護力研究[J].中國動物保健，2023，25（12）：108-109.

[2] WANG D， FANG L， XIAO S. Porcine epidemic diarrhea in China[J]. Virus Res， 2016， 226：7-13.

[3] 應碧云，朱利塞，向蕊，等.豬流行性腹瀉及其疫苗研究現(xiàn)狀[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技，2022，47（5）：35-39.

[4] 郭振剛，胡江鋒，王婷，等.豬流行性腹瀉病毒分離鑒定及其滅活疫苗的研制[J].動物醫(yī)學進展，2021，42（2）：26-33.

[5] 王艷慧.淺析獸用疫苗的保管與使用[J].飼料博覽，2019（4）：78.

收稿日期：2024-02-05

作者簡介：何玲（1983— ），女，碩士，主要從事動物疫苗研發(fā)與推廣工作。

*通信作者