D型肉毒毒素凍干劑的試驗

劉生財，張西云，胡國元，范玉霞，李生慶，李秀萍，王亭亭，李志寧，黃　榮，劉懷新（青海大學畜牧獸醫(yī)科學院，青海西寧810016）

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D型肉毒毒素凍干劑的試驗

劉生財，張西云，胡國元，范玉霞，李生慶，李秀萍，王亭亭，李志寧，黃榮，劉懷新
（青海大學畜牧獸醫(yī)科學院，青海西寧810016）

摘要：通過保護劑的選擇及凍干試驗研制了D型肉毒毒素新劑型-D型肉毒凍干劑。試驗確定30%蔗糖+10%明膠作為凍干劑的保護劑；室溫（13℃～18℃）的保存期為10個月，37℃的保存期為6個月；水分含量為≤5%。同時制定了D型肉毒毒素凍干劑凍干曲線。

關(guān)鍵詞：D型肉毒毒素；保護劑；保存期；凍干曲線

D型肉毒滅鼠劑是青海省畜牧獸醫(yī)科學院利用該院從動物體內(nèi)分離、鑒定的D型肉毒梭菌，經(jīng)透析培養(yǎng)、除菌過濾研制的一種生物滅鼠劑，經(jīng)試驗及使用證明，滅鼠效果良好，且具有不污染環(huán)境、無二次中毒及不傷害鼠類天敵的特點，但存在必須低溫保存、運輸及常溫下保存期短的弊端。

為增加劑型，擴大滅鼠范圍，延長常溫下的保存期，且便于運輸、保存、使用，我們進行了D型肉毒毒素凍干劑的試驗，并取得了較好的結(jié)果，報告于下。

1　材料與方法

1.1毒素的制備經(jīng)透析培養(yǎng)、離心過濾、無菌檢驗及毒價測定后，用無菌蒸餾水配制成2 000 萬MLD/mL毒素。

1.2保護劑的制備（1）50%蔗糖；（2）30%蔗糖+ 10%明膠；（3）30%蔗糖+ 10%脫脂乳粉；（4）30%蔗糖+10%可溶淀粉。按毒素量的1/5分別配制上述保護劑，充分溶解后，高壓10磅40 min，備用。

1.3自動灌裝機使用前經(jīng)無菌處理后，備用。

1.4塑料瓶，硅膠塞用前清洗，晾干水分后，高壓10磅40 min備用。

1.5凍干機日本產(chǎn)Blender冷凍機。

1.6水分測定儀。

1.7D型肉毒滅鼠劑凍干保護劑試驗凍干毒素按5份毒素+1份保護劑制備。將配制好的毒素液，分裝到25 mL瓶中，每瓶裝量6 mL。冷凍室放入各樣品和對照瓶（加水6 mL），按照說明放置好各探頭，關(guān)閉冷凍室門。打開電源，調(diào)最高溫度30℃，最低溫度-30℃。啟動冷凍機，先制冷到-30℃，持續(xù)3 h，然后進行抽真空，真空度達到100 μm以上時，升溫升華，直到30℃，完成一個周期。之后再重復制冷-升華全過程。（升華時從-30℃開始，制冷室溫度要達到-52℃、真空度為90～100 μm之間）。完成全部凍干需時16 h以上，待對照瓶內(nèi)水完全升華即結(jié)束。每瓶約抽2 min，真空度達300 μm時，用石蠟封口。根據(jù)毒素凍干后的性狀、溶解性及毒價，確定毒素凍干用保護劑的成分。

1.8D型肉毒滅鼠劑凍干試驗（1）配毒、分與凍干：按5∶1的比例將毒素與1.2選出的保護劑充分混合，每瓶裝量為1億MLD（6 mL）、2億MLD （12 mL）、4億MLD（24 mL），置于-15℃冷庫中凍結(jié)，將凍結(jié)好的毒素置于凍干機中，按凍干曲線圖進行凍干，凍干時間為24～48 h；（2）無菌檢驗：以4億MLD/瓶為例，加水40 mL，即為1 000萬MLD/mL毒素，取普通斜面普通肉湯，加生肝塊VF 各2支，每支接種0.2 mL，37℃培養(yǎng)7 d，觀察有無細菌生長；（3）毒價測定：用體重16～18 g小鼠，靜脈注射測定毒價，凍干后毒價有無變化。

1.9殘留水分測定將本室生產(chǎn)的D型肉毒凍干劑3批次（200901、201001、201002批），其中200901批供試樣品10瓶，201001、201002批供試樣品各5瓶，采用真空干燥法，測定殘留水分含量。

1.10保存期試驗取D型肉毒凍干劑（0801批），毒價為2億MLD/瓶）24瓶，分別放于37℃溫箱及室溫中（13℃～18℃），每個月測毒1次，共測12個月，凍干劑用明膠緩沖液稀釋，測毒用體重18～22 g小鼠靜脈注射，記錄測毒結(jié)果。

2　結(jié)果

2.1D型肉毒滅鼠劑凍干保護劑的選擇

2.1.1物理性狀凍干后取出，觀察不同配方的保護劑凍干后的性狀，蔗糖明膠的外觀最好，呈棕黃色疏松塊狀；蔗糖淀粉次之；單用蔗糖有泡狀突起；蔗糖奶粉最差。

2.1.2溶解情況加蒸餾水于各樣瓶內(nèi)，觀察瞬間溶解情況，根據(jù)溶解的快慢及完全與否依次為:蔗糖明膠-蔗糖-蔗糖淀粉-蔗糖奶粉。

2.1.3測毒情況分別取各個配方組1瓶，加10 mL蒸餾水（使每毫升含毒素為1 000萬MLD），溶解后取1 mL毒素液用明膠緩沖液進行適當稀釋后靜脈注射小鼠測含毒量。試驗結(jié)果見表1。

表1　保護劑試驗結(jié)果

根據(jù)毒素凍干后的性狀、溶解性及毒價，確定毒素凍干用保護劑的成分為30%蔗糖+10%明膠，毒價穩(wěn)定，凍干效果良好。

2.2D型肉毒滅鼠劑凍干試驗

2.2.1物理性狀為棕褐色，疏松塊狀。

2.2.2無菌檢驗以4億MLD/瓶為例，加水40 mL，即為1 000萬MLD/mL毒素，取普通斜面普通肉湯，加生肝塊VF各2支，每支接種0.2 mL，37℃培養(yǎng)7 d，無任何細菌生長。

2.2.3毒價測定用16～18 g小鼠，靜脈注射測定毒價，凍干后毒價未發(fā)生變化。

按上法共凍干4批，生產(chǎn)D型肉毒凍干劑25.152萬mL，凍干情況見表2。

表2　D型肉毒凍干劑凍干情況

采用該凍干方法制備D型肉毒毒素凍干劑可行，達到了凍干劑企業(yè)標準的要求。

2.3殘留水分測定經(jīng)3批次的殘留水分含量測定，D型肉毒凍干劑的平均殘留水分含量在

3.45%～4.62%之間，達到了凍干劑企業(yè)標準中殘留水分含量在5%以內(nèi)的質(zhì)量要求。詳見表3。

表3　D型肉毒凍干劑中殘留水分含量測定

2.4保存期試驗D型肉毒凍干劑室溫保存10個月毒力未發(fā)生變化，11個月后由2億MLD/瓶降至1億MLD/瓶，見表4。

表4　D型肉毒凍干劑在室溫和37℃的保存期試驗結(jié)果

37℃保存6個月毒力未發(fā)生變化，7個月毒力由2億MLD/瓶降至1億MLD/瓶。

2.5D型肉毒毒素凍干劑凍干曲線圖通過凍干試驗，將隔板溫度、冷凝器溫度、產(chǎn)品溫度及真空度與時間的關(guān)系，繪制了凍干曲線圖（圖1）。

3　討論

3.1根據(jù)D型肉毒毒素凍干后的性狀、溶解性及毒價，確定毒素凍干用保護劑的成分為30%蔗糖+ 10%明膠，毒價穩(wěn)定，凍干效果良好。

3.2采用該凍干方法制備D型肉毒毒素凍干劑可行，凍干毒素物理性狀、無菌檢驗、毒價測定及殘留水分含量均符合產(chǎn)品標準。

圖1　D型肉毒毒素凍干劑凍干曲線（單位：溫度℃，真空度Pa，時間h）

4　結(jié)論

4.1研制的D型肉毒毒素凍干劑在室溫（13℃～18℃）可保存10個月，37℃可保存6個月，遠遠超出水劑室溫（13℃～18℃）可保存2個月，37℃可保存7 d的保存期，且便于運輸、保存和使用。為我國的草原鼠害防治領(lǐng)域增加了一種新的劑型。

4.2采用該方法試生產(chǎn)D型肉毒毒素凍干劑25.152萬mL，完成草原鼠害防治200萬畝，滅效均在90%以上。通過毒理、安評和藥效試驗，取得了農(nóng)藥生產(chǎn)許可證和農(nóng)藥臨時登記證。

參考文獻：

［1］王明俊.獸用生物制品學［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1997：346-368.

Study on Freeze- dried Agent of Typeof D Botulinum Toxin

LIU Sheng-cai，ZHANG Xi-yun，HU Guo-yuan，F(xiàn)AN Yu-xia，LI Sheng-qing，LI Xiu-ping，WANG Ting-ting，LI Zhi-ning，HUANG Rong，LIU Huai-xin
（Animal Sciences and Veterinary Medicine，Qinghai University，Xining 810016，China）

Abstract：The freeze-dried agent of type of D Botulinum，a new type of D Botulinum Toxin was developed based on the choice of protective agent and freeze-dried test.type D new dosage forms，Botulinum toxin type.30%of sucrose + 10%of gelatin as the protective agent of freeze-dried agent was determined.Under room temperature（13～18℃），it can be stored for 10 months. It can be stored for 6 months in37℃.Moisture content was less than 5%.The freeze-drying curve was made. Key words：Type of D Botulinum toxin；Protective agent；Storage period；Freeze-drying curve

中圖分類號：R 378.91

文獻標志碼：A

文章編號：0529- 6005（2016）03- 0113- 03

收稿日期：2014-05-23

作者簡介：劉生財（1968-），男，副研究員，本科，從事預防獸醫(yī)學研究工作，E-mail：Liushc315@163.com