1株人獸魚共患病原菌嗜水氣單胞菌的分離鑒定

畢建飛，康元環(huán)，陳亨利，張海月，張冬星，姜劍峰，單曉楓，錢愛東（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春130118）

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1株人獸魚共患病原菌嗜水氣單胞菌的分離鑒定

畢建飛，康元環(huán)，陳亨利，張海月，張冬星，姜劍峰，單曉楓，錢愛東
（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春130118）

摘要：為了對長春市某養(yǎng)魚場病死魚致病菌進(jìn)行分離鑒定，對分離菌株進(jìn)行了生物學(xué)特性分析，16S rRNA和3種管家基因的序列測定與分析，并對其進(jìn)行鯉魚、昆明系小鼠致病性試驗及藥敏試驗。結(jié)果顯示，該細(xì)菌為革蘭陰性桿菌，培養(yǎng)特性、理化反應(yīng)與嗜水氣單胞菌基本相同；對左氧氟沙星、卡那霉素等18種抗菌藥物敏感，萬古霉素、苯唑西林等4種抗菌藥物耐藥；16S rRNA和dnaJ、rpoD、gyrB管家基因的均與GenBank上的嗜水氣單胞菌相應(yīng)基因有較高的同源性，同源性最高分別為99.6%、97.9%、99.9%。分離菌株對鯉魚、昆明系小鼠有較強的致病作用，其半數(shù)致死量分別為6.76×107CFU/只、1.39×106CFU/只，表明該菌可能是1株人獸魚共患病原菌。

關(guān)鍵詞：嗜水氣單胞菌；管家基因；系統(tǒng)發(fā)育分析；藥敏試驗

氣單胞菌廣泛存在于自然環(huán)境中，具有廣泛的致病性，能夠感染包括鰱、鳙、白鯽、團(tuán)頭魴、草魚、鱘魚、鯉魚等多種魚類，導(dǎo)致敗血癥或皮膚潰瘍等癥狀，是魚類最常見的致病菌。人食用了污染的蔬菜、水產(chǎn)品和畜禽產(chǎn)品后，可引發(fā)腹瀉、腦膜炎和敗血癥等，免疫力低下的患者甚至可能死亡［1］。本文從吉林省長春市某養(yǎng)魚場病死鯉魚病變組織分離獲得1株致病菌，經(jīng)致病性試驗，其對鯉魚與昆明系小鼠均有較強的致病性，通過生物學(xué)特性觀察、16S rRNA基因和3個具有代表性的管家基因dnaJ、rpoD和gyrB的鑒定顯示其為嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）。同時通過藥敏試驗對該致病菌的敏感藥物進(jìn)行了篩選，為該病的確診與防治提供了依據(jù)和參考。

1　材料與方法

1.1材料取自吉林省長春市某養(yǎng)魚場病魚。

1.2主要試劑RS鑒別培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂，購自北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，購自杭州天和微生物試劑有限公司；DL-2 000 Marker、Taq DNA聚合酶，購自寶生物工程（大連）有限公司；藥敏紙片，購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.3試驗動物供感染試驗魚為健康鯉魚，體重約80 g～90 g。昆明系小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，體重為20 g～25 g。

1.4病原菌分離無菌操作直接從肝臟組織樣進(jìn)行瓊脂平板劃線分離，所用培養(yǎng)基為普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，分別置于有氧和厭氧環(huán)境下30℃恒溫培養(yǎng)24 h～48 h，挑取占優(yōu)勢形態(tài)一致的單個菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，純化后的細(xì)菌用作感染和生理生化與分子鑒定。

1.5人工回歸感染試驗選取健康鯉魚，體重80 g～90 g，參考鄧國成等的方法［2］進(jìn)行人工回歸感染試驗。

1.6致病菌的鑒定

1.6.1常規(guī)生化鑒定純化后的細(xì)菌30℃培養(yǎng)24 h后做革蘭染色。按照微量生化反應(yīng)管說明書鑒定菌株的生化特性。

1.6.2 16S rRNA及管家基因dnaJ、rpoD、gyrB序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析采用菌落熱裂解法制備PCR模板，引物目標(biāo)基因dnaJ，dnaJF：5′-CGAGATCAAGAAGGCGTACAAG-3′，dnaJR3：5′-CACCACCTTGCACATCAGATC-3′；目標(biāo)基因rpoD，rpoD70-F*：5′-ACGACTGACCCGGTACGCATGTAYATGMGNGARATGGGNACNGT-3′，rpoD70R*：5′-ATAGAAATAACCAGACGTAAGTTNGCYTCNACCATYTCYTTYTT-3′；目標(biāo)基因gyrB，gyrB 3F：5′-TCCGGCGGTCTGCACGGCGT-3′，gyrB 14R：5′-TTGTCCGGGTTGTACTCGTC-3′；目標(biāo)基因16S rRNA，27F：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCA-3′，1411R：5′-GTGTGACGGGCGGTGTGTA-3′。PCR反應(yīng)程序參考文獻(xiàn)［3］。PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。將測序結(jié)果與GenBank中登錄的相關(guān)序列進(jìn)行相似性分析，并通過Blast程序多重比對，用Mega6.0軟件采用鄰接法進(jìn)行聚類分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.7致病性試驗

1.7.1鯉魚致病性試驗菌落計數(shù)法調(diào)整菌懸液濃度3.4×108CFU/mL～3.4×106CFU/mL，然后為鯉魚進(jìn)行胸鰭基部注射，每尾注射0.2 mL菌懸液，對照組注射相同劑量的無菌生理鹽水，每組10條鯉魚。記錄每組鯉魚死亡情況，改良寇氏法計算半數(shù)致死量。

1.7.2昆明系小鼠致病性試驗調(diào)整菌懸液濃度1.75×108CFU/mL～1.75×104CFU/mL，10倍稀釋，各稀釋度以0.2 mL/只腹腔注射昆明系小鼠，對照組注射0.2 mL/只無菌生理鹽水，每組5只小鼠。觀察小鼠癥狀，剖檢死亡小鼠，并從其肝臟、腎臟等部位再次分離細(xì)菌，進(jìn)行菌體形態(tài)觀察和生理生化鑒定。改良寇氏法計算半數(shù)致死量。

1.8藥物敏感性試驗采用紙片法，將純化培養(yǎng)24 h的細(xì)菌，均勻涂布于普通營養(yǎng)瓊脂平板上，同時粘貼藥敏紙片，培養(yǎng)24 h后觀察并記錄抑菌圈直徑，藥敏試紙購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司。

2　結(jié)果

2.1病原菌分離從病魚樣品中分離得到1株優(yōu)勢菌株，暫時命名為JL1021。菌株在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，兼性厭氧，形成邊緣整齊、表面濕潤、光滑的圓形菌落，菌落呈現(xiàn)半透明、灰白色至呈肉色略帶淡黃色不等，有特殊氣味。革蘭染色后，油鏡下觀察，為革蘭陰性菌，形狀大多呈短桿狀，略呈弧狀，兩端鈍圓，單個分散排列。經(jīng)生理生化鑒定，參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》初步判定菌株為嗜水氣單胞菌。

2.2細(xì)菌人工回歸感染試驗結(jié)果人工回歸感染試驗表明，菌株JL1021對鯉魚具有致病作用，試驗魚發(fā)病和死亡癥狀與自然病癥基本相同。而且從人工感染的病魚的肝、腎等組織和腹腔內(nèi)積水中又可分離到與試驗菌株形態(tài)特征、理化特性一致的菌株，表明菌JL1021是鯉魚細(xì)菌性敗血綜合征的致病菌。

2.3致病性試驗結(jié)果

2.3.1鯉魚致病性試驗結(jié)果菌株JL1021人工感染的魚也呈現(xiàn)體表潰爛、腹腔積有大量腹水、眼睛四周充血突出和爛鰓等癥狀，而且從人工感染的病魚的肝、腎等組織和腹腔內(nèi)積液中又可分離到與試驗菌株形態(tài)特征、理化特性一致的菌株。改良寇氏法計算菌株對鯉魚的LD50為6.76×107CFU/只。

2.3.2昆明系小鼠致病性試驗結(jié)果菌株對昆明系小鼠有明顯的致病性，1 d～2 d內(nèi)死亡，剖檢可見肝臟和肺出血嚴(yán)重，腎臟腫大。進(jìn)行病原分離培養(yǎng)，能夠分離到與JL1021形態(tài)和生理生化特征一致的菌株。改良寇氏法計算菌株對昆明系小鼠的LD50為1.39×106CFU/只。

2.4菌株16S rRNA基因以及管家基因dnaJ、rpoD、gyrB序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析菌株16S rRNA基因以及管家基因dnaJ、rpoD、gyrB基因PCR擴(kuò)增，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳（圖2）。采用Mega6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2-圖5）。菌株JL1021在系統(tǒng)發(fā)育樹中與A.hydrophila位于同一進(jìn)化分支。經(jīng)Mega6.0軟件計算，分離株與A. hydrophila的模式菌株同源性為99.9%。本研究對分離株JL1021的16S rRNA基因以及管家基因dnaJ、rpoD、gyrB進(jìn)行序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析，均與A. hydrophila位于同一發(fā)育分支。

圖1　16S RNA基因以及管家基因gyrB；rpoD；dnaJ基因的PCR擴(kuò)增M：Marker DL-2 000；1：16sRNA；2：gyrB；3：rpoD；4：dnaJ

圖2　根據(jù)16s rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3　根據(jù)dnaJ基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5藥敏試驗結(jié)果經(jīng)以22種抗菌類藥物對JL1021進(jìn)行藥敏測定，結(jié)果表明，該分離株對左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、磺胺甲基異噁唑、復(fù)方新諾明、頭孢曲松、慶大霉素、妥布霉素、米諾環(huán)素、卡那霉素、克拉霉素、呋喃妥因、四環(huán)素、氟苯尼考、氯霉素、多粘菌素B、大觀霉素、羅紅霉素18種藥物敏感；對桿菌肽、萬古霉素、萘啶酸、苯唑西林4種藥物耐藥。

圖4　根據(jù)rpoD基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5　根據(jù)gyrB基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3　討論

嗜水氣單胞菌對淡水魚類具有很強的致病性，病魚主要以出血、腹水和爛鰓等癥狀為主，且近年來由嗜水氣單胞菌引發(fā)的淡水魚暴發(fā)性出血病有增多的趨勢。除感染鯉魚外，嗜水氣單胞菌也可感染其他養(yǎng)殖魚類及水生動物［4-5］。此外，本試驗也證實該菌株對昆明系小鼠也具有一定的致病性，暗示其可能是1株人獸魚共患病原菌。

16S rRNA基因序列的測定分析已成為細(xì)菌分類研究的金標(biāo)準(zhǔn)，被用于細(xì)菌屬水平的分析，但對親緣關(guān)系比較近的種分辨率不高，往往需采用其他方法補充鑒定。因此國際細(xì)菌分類委員會建議對染色體不同位點、單拷貝形式存在的管家基因進(jìn)行序列分析，尋找合適的序列相似性水平用于種群的確定［6］。本研究利用dnaJ、gyrB和rpoD 3個管家基因?qū)λ蛛x的菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示，各管家基因具有良好的一致性，且與16S rRNA基因序列結(jié)果相符。

關(guān)于嗜水氣單胞菌對抗生素敏感性的試驗，已有不少報道，，但各地分離菌株耐藥狀況因時間、來源不同而存在一定差異［7-9］，本試驗的結(jié)果也證實了這點；此外，，本研究分離的嗜水氣單胞菌對左氧氟沙星、羅紅霉素、卡那霉素等高度敏感，結(jié)合臨床上選擇治療藥物的相關(guān)原則，可以選用獸用左氧氟沙星進(jìn)行治療。

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Isolation and identification of man- animal- fish Pathogenic Aeromonas hydrophila

BI Jian-fei，KANG Yuan-huan，CHEN Heng-li，ZHANG Hai-yue，
ZHANG Dong-xing，JIANG Jian-feng，SHAN Xiao-feng，QIAN Ai-dong
（College of animal science and technology，jilin agricultural university，Changchun 130118，China）

Abstract：In order to identify a bacteria isolated from fish tissue in a fish farm，we used the phylogenetic strategy，the morphology，physical and chemical characteristics，16S rRNA sequence analysis，pathogenicity，and drug sensitivity test.The results showed that the bacteria isolate was gram-negative and the culture，physical and chemical characteristics were identical with Aeromonas hydrophila，except sucrose and acetate reaction .The drug sensitivity test revealed that the isolate was sensitive to 18 kinds of drugs such as Ofloxacin，and kanamycin，and was resistant to 4 kinds of drugs such as Penicillin G，ampicillin.In additionally，phylogenetic analysis based on 16S rRNA also indicated that the isolate was clustered in the genus Aeromonas，with the highest similarity to Aeromonas hydrophila.Artificial infection test showed that the isolate was pathogenic to Carp，and Kunming mice with a LD50of 6.76ici7CFU，and 1.39 ici6CFU，respectively.And the results also revealed that the bacteria could be a man-animalfish zoonotic pathogen.

Key words：Aeromonas hydrophila；housekeeping gene；phylogenetic analysis；drug sensitivity test Corresponding authors：QIAN Ai-dong；SHAN Xiao-feng

中圖分類號：S941

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0529- 6005（2016）03- 0118- 03

收稿日期：2015-05-29

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（31201927）；吉林省重點科技攻關(guān)項目（20150204065NY）

作者簡介：畢建飛（1990-），男，碩士生，從事動物微生物學(xué)研究，E-mail：jianfeibi@163.com

通訊作者：錢愛東，E-mail：qianaidong0115@163.com；單曉楓，E-mail：sxf1997@163.com