入侵植物一年蓬基因組DNA提取方法優(yōu)化

基金項目 安徽省自然科學基金面上項目“入侵植物一年蓬的譜系分化格局與適應性進化研究”（1908085MC58）；安徽省高等學校省級質(zhì)量工程項目“《植物學》野外實習虛擬仿真實驗教學”（2021xnfzxm062）；安慶師范大學校級質(zhì)量工程項目（2022aqnujyxm45）。

作者簡介 王仕文（2003—），男，安徽安慶人，從事生物入侵與生態(tài)安全研究。

通信作者 童躍偉（1987—），男，安徽蕪湖人，博士，講師，從事生物入侵與生態(tài)安全研究。

收稿日期 2024-03-07

摘要 一年蓬為菊科飛蓬屬植物，是分布較廣、危害較重的一種外來入侵雜草。為優(yōu)選該植物基因組DNA的提取方法，本研究采取四因素三水平正交試驗設計，對一年蓬基因組DNA的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）提取方法進行優(yōu)化，并與常規(guī)的植物基因組試劑盒法進行對比。結果表明，一年蓬基因組DNA較優(yōu)的提取方法為改良CTAB法，即一年蓬的干燥葉片經(jīng)CTAB-free去除多糖，并加入β-巰基乙醇防止酚氧化，用氯仿∶異戊醇（24∶1）抽提3次。改良CTAB法提取的一年蓬基因組DNA質(zhì)量較高，微量分光光度計檢測的A260/A280數(shù)值接近1.8～2.0，且凝膠電泳DNA條帶清晰，無明顯拖帶。該方法為該植物的遺傳多樣性和入侵機制等研究提供參考。

關鍵詞 菊科；一年蓬；DNA提取方法；改良CTAB法；正交試驗

中圖分類號 Q949.783.5；Q75"" 文獻標識碼 A

文章編號 1007-7731（2024）13-0066-05

Optimization of DNA extraction methods from invasive plant Erigeron annuus

WANG Shiwen""" YANG Ziqiong""" WEI Shuya""" DING Tong""" GU Wanru""" CHEN Yubei""" QU Lili""" TONG Yuewei

（Research Center of Aquatic Organism Conservation and Water Ecosystem Restoration/

School of Life Science， Anqing Normal University， Anqing 246133， China）

Abstract Erigeron annuus， which belongs to the genus Suaeda of Asteraceae family， is one of the most widely distributed and seriously harmful alien invasive weeds. To select a better method for extracting genomic DNA of E. annuus， the CTAB method for extracting genomic DNA of E. annuus was optimized by orthogonal experiment with four factors and three levels， and compared with the common plant kit method. The results showed that the modified CTAB method was used to extract genomic DNA of E. annuus. This involved treating the dried leaves of E. annuus with CTAB-free to remove polysaccharides， adding β-mercaptoethanol to prevent phenol oxidation， and extracting with chloroform：isopentanol （24∶1） three times. The quality of the DNA extracted by the optimized scheme was good， with A260/A280 values measured by a microspectrophotometer close to 1.8 to 2.0， and the gel electrophoresis image band was clear without obvious drag. This method laid a foundation for studies on the genetic diversity and invasion mechanisms of E. annuus.

Keywords Asteraceae; Erigeron annuus; DNA extraction method; modified CTAB method; orthogonal test

生物入侵被認為是導致生態(tài)環(huán)境碎片化以及生物多樣性喪失的關鍵因子之一[1]，可能會給地方生物多樣性造成較大的危害，該問題現(xiàn)已演變?yōu)槿蛐缘闹卮蟓h(huán)境問題和經(jīng)濟問題[2]。菊科飛蓬屬植物一年蓬（Erigeron annuus）廣泛分布于野外次生演替群落中[3]。該植物是目前分布較廣、危害較重的外來入侵雜草之一[4]。該物種種子量大[5]，種子具冠毛[6]以及生態(tài)幅較寬[7]，易在入侵地區(qū)大面積擴散蔓延；而且其化感作用會抑制周圍植物的生長發(fā)芽[8]，在一定程度上影響區(qū)域生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。目前，對于一年蓬的研究主要集中于其自身的化學成分分析[9]、化感作用[10]等方面，而對其分子生物學及入侵機制等方面的研究相對有限。鑒于此，運用分子生物學對一年蓬群體遺傳多樣性和遺傳結構進行分析，探討其種內(nèi)譜系地理格局形成機制、系統(tǒng)發(fā)育關系以及入侵機制的研究十分必要，而高質(zhì)量的一年蓬基因組DNA的獲取尤為關鍵。

目前，關于植物基因組DNA的提取方法有很多，應用較多的有常規(guī)十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法[11]和植物試劑盒法（DP-320）。常規(guī)CTAB法因不同植物材料在化學成分、組織結構等方面存在差別，提取效果往往差異較大[12-14]，在應用上有一定的局限性；植物試劑盒法可以快速、有效提取植物基因組DNA，無需酚、氯仿抽提，避免了試劑污染，但成本較高。基于此，為建立一種高效且經(jīng)濟的一年蓬基因組DNA提取方法，本研究對常規(guī)CTAB法進行改良，設計四因素三水平正交試驗，并與植物試劑盒法進行對比，目的是篩選出該物種一年蓬基因組DNA的較優(yōu)提取方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料" 試驗所用一年蓬均采集自安慶師范大學校園內(nèi)，均選取幼嫩葉片作為試驗材料。將采集的植物樣本清洗干凈，使用變色硅膠對其進行快速干燥處理，并保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.1.2 試劑" 改良CTAB法所用試劑：Tris、EDTA、CTAB和瓊脂糖（上海生工生物工程有限公司）；loading buffer、核酸染料、50×TAE緩沖液（北京索萊寶公司）；液氮、β-巰基乙醇、氯仿、異戊醇和無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純。

植物試劑盒法所用試劑：DP-320新型植物基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）。

1.1.3 儀器" 移液槍、電泳儀、凝膠成像儀、微量分光光度計、恒溫水槽和水浴鍋等。

1.2 DNA提取方法

1.2.1 改良CTAB法" 設置樣品質(zhì)量（A）、CTAB-free劑量（B）、β-巰基乙醇劑量（C）和水浴時間（D）的L9（34）正交試驗，對比不同因素對DNA提取質(zhì)量的影響。DNA提取步驟如下。

（1）根據(jù)表1提供的樣品質(zhì)量，取相應質(zhì)量的樣品至2 mL無菌離心管中，加入兩顆直徑5 mm的鋼珠，在液氮中冷凍樣品，隨后快速研磨樣品1 min。（2）加入相應劑量的預熱CTAB-free溶液和β-巰基乙醇，置于65 °C恒溫水浴鍋中水浴，根據(jù)表1水浴相應時間，其間每隔10 min均勻搖晃離心管一次，水浴結束后12 000 r/min離心5 min，取上清液。（3）上清液加入等體積的氯仿和異戊醇，氯仿∶異戊醇體積比為24∶1。上下混勻成乳濁狀，室溫放置2～5 min，隨后12 000 r/min離心5 min。（4）重復步驟（3）3次。（5）取上層水相至干凈的離心管中，加入2倍體積的冰鎮(zhèn)無水乙醇，置于-20 °C冰箱30 min以上，以沉淀DNA；然后10 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入500 μL 75%乙醇，洗滌1～2次，棄上清液，置于超凈臺晾干水分；加入100 μL無菌水溶解、混勻，保存于-20 °C備用。

1.2.2 植物試劑盒法" 使用前先在緩沖液LP3和漂洗液PW中加入無水乙醇，加入體積參照標簽說明。提取步驟如下。

（1）取新鮮植物組織100 mg或干組織20 mg，加入液氮充分研磨，加入400 μL緩沖液FGA和6 μL RNaseA（10 mg/mL），旋渦振蕩1 min，室溫放置10 min；加入130 μL緩沖液LP2，充分混勻，旋渦振蕩1 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液至干凈離心管中。（2）上清液中加入1.5倍體積的緩沖液LP3（使用前先檢查是否已加入無水乙醇），立即充分混勻15 s，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀；將溶液和絮狀沉淀一并加入吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液。（3）向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液PW（使用前先檢查是否已加入無水乙醇），12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液。注意：如果吸附柱膜呈綠色，吸附柱CB3中加入500 μL無水乙醇，12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液。（4）重復操作步驟（3）。（5）將吸附柱CB3放回收集管中，12 000 r/min離心2 min，倒掉廢液，將吸附柱CB3置于室溫，以徹底晾干吸附材料中殘余漂洗液。（6）將吸附柱CB3轉入干凈的離心管中，向吸附膜中間部位懸空滴加50～200 μL洗脫緩沖液TB，室溫放置2～5 min，12 000 r/min離心2 min，收集濾液至離心管中。

1.3 DNA產(chǎn)率和質(zhì)量檢測方法

1.3.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測" 用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA的片段大小、降解情況。取2 μL DNA提取液，加3 μL無菌水、1 μL loading buffer混勻后滴入1%瓊脂糖凝膠，100 V電泳30 min，在紫外凝膠成像儀上觀察并記錄。

1.3.2 分光光度計檢測" 取2 μL樣品DNA溶液，用微量分光光度計測定樣品DNA的A260/A280值。根據(jù)分光光度計測定的吸光度（A）判斷DNA的提取質(zhì)量，A值在1.8～2.0，DNA的質(zhì)量較佳；A值小于1.8，說明樣品DNA中存在酚類或蛋白質(zhì)污染；A值大于2.0則說明樣品DNA中有RNA污染[15]。

2 結果與分析

2.1 CTAB提取方法的優(yōu)化

設置樣品質(zhì)量（A）、CTAB-free劑量（B）、β-巰基乙醇劑量（C）和水浴時間（D）的L9（34）正交試驗，對比不同因素對DNA提取質(zhì)量的影響。由表2可看出，相較于處理7，處理9的DNA吸光度數(shù)值最低，為1.583。吸光度極差數(shù)據(jù)R顯示，4個因素對DNA吸光度的影響順序為Dgt;Agt;Cgt;B，其中樣品質(zhì)量、β-巰基乙醇劑量和水浴時間這3個因素對DNA的吸光度均影響較大。

由表3可知，處理7得到的DNA濃度最高，平均值為424.7 ng/μL；處理6的濃度最低，為104.7 ng/μL。說明樣品量、β-巰基乙醇及水浴時間對DNA提取濃度有明顯影響，極差數(shù)據(jù)R顯示，4個因素對一年蓬DNA提取濃度的影響順序為Agt;Dgt;Cgt;B。

綜合來看，處理7得到的DNA濃度最高，平均值為424.7 ng/μL，吸光度平均值為1.766。因此，一年蓬葉片DNA濃度最佳的提取條件為處理7，即樣品量0.03 g，CTABfree溶液700 μL，β-巰基乙醇50 μL，水浴時間30 min，在該條件下提取的一年蓬基因組DNA濃度最高，吸光度平均值接近1.8。4個影響因素中樣品質(zhì)量、β-巰基乙醇劑量和水浴時間對提取的DNA濃度和吸光度均有明顯影響。

2.2 改良CTAB法與植物試劑盒法提取效果對比

改良CTAB法提取的DNA，在電泳時加樣孔干凈，無拖帶降解現(xiàn)象，DNA濃度較高（圖1A）；而植物試劑盒法提取的DNA譜帶電泳時加樣孔干凈，無拖帶現(xiàn)象，但對比改良CTAB法其DNA濃度不高（圖1B）。

lt;G：＼農(nóng)學通報＼2024-13期農(nóng)學通-內(nèi)文＼Image＼A1303-1.tifgt;[（A）][M 1 2 3 4][（B）][M 1 2 3 4][5 000][5 000]

（A）改良CTAB法；（B）植物試劑盒法；M為Maker；1～4為DNA樣品。

圖1 一年蓬基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測

采用超微量分光光度計測定DNA的A260/A280比值，比較兩種提取方法提取的DNA樣品的純度。結果表明，改良CTAB法提取的DNA的A260/A280平均比值為1.769，接近1.8～2.0范圍，受酚類、蛋白質(zhì)和RNA物質(zhì)污染較少，DNA純度較高（表4）；而植物試劑盒法提取的DNA的A260/A280平均比值為1.569，距1.8～2.0范圍有一定差距，說明DNA樣品可能被酚類或蛋白質(zhì)等物質(zhì)污染，其提取的DNA純度較改良CTAB法低（表5）。

3 結論與討論

針對一年蓬植物，在常規(guī)的CTAB提取方法基礎上進行了改良：添加了β-巰基乙醇，以有效地抑制酚類物質(zhì)的氧化，從而減少了DNA降解[16]；在樣品研磨過程中采用液氮低溫研磨，減少了DNA降解；樣品研磨時使用無菌小鋼珠，在充分研磨樣品的同時避免了DNA污染[17]；為充分除去樣品中的蛋白質(zhì)和脂類物質(zhì)，用氯仿∶異戊醇（24∶1）抽提3次[18-19]。此外，對樣品質(zhì)量、CTAB-free溶液劑量、β-巰基乙醇劑量及水浴時間進行了定量試驗，通過設計正交試驗對比不同因素對DNA提取質(zhì)量的影響，改良CTAB法提取的一年蓬葉片基因組DNA濃度和純度較高，優(yōu)于植物試劑盒法。后續(xù)可考慮水浴溫度、抽提次數(shù)等因素，采用正交試驗設計分析這些因素對一年蓬葉片基因組DNA提取效果的影響，對該方法進行進一步優(yōu)化。改良CTAB法使用材料成本較低，相較于植物試劑盒法可以有效節(jié)約成本，獲得純度和濃度更高的一年蓬基因組DNA。

王軍等[20]對山葡萄（Vitis amurensis Rupr.）基因組DNA的提取方法，宋國立等[21]對棉花（Gossypium）基因組DNA的提取方法進行了與本研究類似的改良，均加入了β-巰基乙醇，增加了氯仿∶異戊醇（24∶1）抽提次數(shù)，提取的DNA凝膠電泳檢測加樣孔清晰，條帶無拖帶，且A260/A280值在1.8～2.0內(nèi)，即使用改良CTAB法均能提取到對應研究對象的高濃度、高質(zhì)量的基因組DNA。

綜上，本研究采取四因素三水平正交試驗設計，對一年蓬基因組DNA的CTAB提取方法進行優(yōu)化，并與常規(guī)的植物基因組試劑盒法進行對比。結果表明，一年蓬基因組DNA較優(yōu)的提取方法為改良CTAB法，即一年蓬的干燥葉片經(jīng)CTAB-free去除多糖，并加入β-巰基乙醇防止酚氧化，用氯仿∶異戊醇（24∶1）抽提3次。改良CTAB法提取的一年蓬基因組DNA質(zhì)量高，微量分光光度計檢測A260/A280值接近1.8～2.0，且凝膠電泳檢測DNA條帶清晰無明顯拖帶。該改良CTAB法為獲取高質(zhì)量的一年蓬基因組DNA提供了方法，為一年蓬的遺傳多樣性和入侵機制等研究奠定了基礎。

參考文獻

[1] 楊力鳳，楊楠，付海濱，等. 環(huán)境DNA技術在生物入侵研究中的應用進展[J]. 植物保護學報，2023，50（1）：1-10.

[2] PIMENTEL D. Environmental and economic costs associated with nonindigenousspecies in the United States[M]//Biological invasions. Boca Raton：CRC Press，2002：285-303.

[3] 王哲，田勝尼，張永梅，等. 巢湖派河口灘涂植物群落特征研究[J]. 生態(tài)環(huán)境學報，2022，31（9）：1823-1831.

[4] 王瑞，王印政，萬方浩. 外來入侵植物一年蓬在中國的時空擴散動態(tài)及其潛在分布區(qū)預測[J]. 生態(tài)學雜志，2010，29（6）：1068-1074.

[5] 周巍，楊俊杰，王海燕. 南灣湖濕地外來入侵植物種多樣性調(diào)查研究[J]. 信陽農(nóng)林學院學報，2019，29（2）：79-82.

[6] 范建軍，乙楊敏，朱珣之. 入侵雜草一年蓬研究進展[J]. 雜草學報，2020，38（2）：1-8.

[7] 張茹春，蔣紅軍，孟赫男，等. 石家莊市園林綠地外來入侵植物種類及分布特征[J]. 雜草學報，2023，41（1）：18-26.

[8] 方芳，茅瑋，郭水良. 入侵雜草一年蓬的化感作用研究[J]. 植物研究，2005，25（4）：449-452.

[9] 宋楷，鄭曉珂，張靖柯，等. 一年蓬的化學成分研究[J]. 中國藥學雜志，2016，51（17）：1462-1466.

[10] 譚永欽，胡兵，熊程，等. 紫莖澤蘭和一年蓬浸提液化感作用的對比研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學，2011，50（11）：2250-2253.

[11] PAHLICH E，GERLITZ C. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue[J]. Phytochemistry，1980，19：11-13.

[12] 吳晟昊，楊麗，向松竹，等. 珍稀瀕危樹種金錢槭的基因組DNA提取方法研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2024，52（3）：91-94.

[13] 許源升，陳宏夏，田慧，等. 壯藥白花蛇舌草不同部位總DNA提取方法的比較研究 [J]. 壯瑤藥研究，2023（2）：150-153，386-387.

[14] 潘映秋，洪亮，盧啟寰，等. 石斛基因組DNA提取方法比較研究[J]. 中國食物與營養(yǎng)，2023，29（7）：26-30.

[15] 占塔鵬，黃舒婷，喬柱，等. 山豆根基因組DNA高效提取方法的建立與優(yōu)化[J]. 分子植物育種，2020，18（8）：2585-2590.

[16] 朱高倩，王麗，殷子喻，等. 含燈盞花中成藥DNA提取及其分子鑒定[J]. 中國現(xiàn)代中藥，2023，25（9）：1878-1886.

[17] 趙曉彤，梁文達，沈風嬌，等. 微量苔蘚樣品DNA提取實驗方案改良[J]. 河北師范大學學報（自然科學版），2023，47（5）：515-521.

[18] 黃永會，朱英，劉永翔. 適于植物愈傷組織DNA提取的改良CTAB法[J]. 農(nóng)技服務，2014，31（9）：46-47.

[19] 單志，吳宏亮，李成磊，等. 改良SDS法提取多種植物基因組DNA研究[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學，2011，38（8）：113-115.

[20] 王軍，賀普超. 山葡萄基因組DNA提取及RAPD鑒定[J]. 果樹科學，2000，17（2）：79-82.

[21] 宋國立，崔榮霞，王坤波，等. 改良CTAB法快速提取棉花DNA[J]. 棉花學報，1998，10（5）：50-52.

（責編：何 艷）