射血分?jǐn)?shù)降低的心力衰竭病人中性粒細(xì)胞標(biāo)志物變化

摘要 目的：探討中性粒細(xì)胞CD_11b、CD_66b和CD₆₄在射血分?jǐn)?shù)降低的心力衰竭（HFrEF）病人中的表達(dá)。方法：選取2021年1月—2022年1月我院重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）收治的105例HFrEF病人作為HFrEF組，另選取43名健康受試者作為對照組。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測中性粒細(xì)胞活化/成熟標(biāo)記CD_11b、CD_66b和CD₆₄的平均熒光強(qiáng)度。采用Spearman相關(guān)性分析中性粒細(xì)胞表面標(biāo)志物與臨床、實(shí)驗(yàn)室參數(shù)的相關(guān)性；應(yīng)用COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析評估中性粒細(xì)胞活化/成熟參數(shù)與預(yù)定義終點(diǎn)之間的相關(guān)性。結(jié)果：HFrEF組CD₆₄表達(dá)高于對照組（P＜0.05），兩組CD_11b和CD_66b表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Spearman相關(guān)性分析顯示，CD_66b與年齡呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.181，P＝0.036），與BMI呈正相關(guān)（r＝0.243，P＝0.005）；CD₆₄與BMI呈正相關(guān)（r＝0.174，P＝0.005）；CD_11b和CD_66b表達(dá)均與NT-proBNP呈負(fù)相關(guān)（r值分別為－0.243，－0.250，P分別為0.005，0.004）；CD_66b與肌酐呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.215，P＝0.012）。在22（15，27）個(gè)月的隨訪期內(nèi)，10例HFrEF病人達(dá)到終點(diǎn)全因死亡。單變量Cox回歸分析顯示，中性粒細(xì)胞CD_11b、CD_66b和CD₆₄表達(dá)與終點(diǎn)全因死亡之間無關(guān)（P均＞0.05）。結(jié)論：中性粒細(xì)胞亞群是炎癥與心力衰竭的關(guān)鍵分子，強(qiáng)調(diào)了中性粒細(xì)胞在HFrEF中病理生理和危險(xiǎn)分級中的潛在作用。

關(guān)鍵詞 射血分?jǐn)?shù)降低的心力衰竭；流式細(xì)胞術(shù)；中性粒細(xì)胞

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.21.022

作者單位 1.山西醫(yī)科大學(xué)（太原 030001）；2.山西省心血管病醫(yī)院（太原 030024）

通訊作者 王仲朝，E-mail：313610514@qq.com

引用信息 王方，王仲朝，劉龍梅，等.射血分?jǐn)?shù)降低的心力衰竭病人中性粒細(xì)胞標(biāo)志物變化［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（21）：3974-3978.

炎癥過程調(diào)節(jié)心血管疾病的發(fā)生、進(jìn)展和結(jié)局。中性粒細(xì)胞是人體循環(huán)中較豐富的白細(xì)胞類型。研究表明，中性粒細(xì)胞在心血管疾病的炎癥和修復(fù)中發(fā)揮重要作用^［1-2］。中性粒細(xì)胞是終末分化的短壽命吞噬細(xì)胞，具有高周轉(zhuǎn)率。中性粒細(xì)胞的產(chǎn)生主要發(fā)生在骨髓，骨髓中的趨化因子、生長因子和黏附分子控制中性粒細(xì)胞釋放到血液中，此時(shí)中性粒細(xì)胞的半衰期約為12 h^［3］。然而，中性粒細(xì)胞在組織中的駐留時(shí)間相對較長，在炎癥和缺氧狀態(tài)下，壽命甚至可達(dá)到7 d^［4-6］。發(fā)生炎癥時(shí)，中性粒細(xì)胞通過級聯(lián)反應(yīng)從血流迅速募集到組織并造成組織損傷^［7］。然而，中性粒細(xì)胞也參與組織修復(fù)，如冠狀動(dòng)脈損的修復(fù)，以減輕心肌梗死后心力衰竭的發(fā)展^［8-10］。不同組織之間的分子模式不同，這為組織的特異性反應(yīng)和調(diào)節(jié)提供了可能性^［7］。中性粒細(xì)胞亞群具有表型和功能差異^［11］。中性粒細(xì)胞一旦被激活，就具有吞噬、趨化和氧化爆發(fā)的能力，并可上調(diào)受體和產(chǎn)生趨化因子^［12］。射血分?jǐn)?shù)降低的心力衰竭（heart failure with reduced ejection fraction，HFrEF）被定義為左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejectionfractions，LVEF）≤40%的心力衰竭，并伴有進(jìn)行性左心室擴(kuò)張和不良心臟重塑^［13］。CD_11b、CD_66b和CD₆₄是中性粒細(xì)胞活化標(biāo)志物，在靜息中性粒細(xì)胞中低表達(dá)，但在促炎刺激下過度表達(dá)。本研究探討有關(guān)循環(huán)中性粒細(xì)胞在HFrEF病人中的激活、成熟狀態(tài)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2021年1月—2022年1月我院重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）收治的105例HFrEF病人作為HFrEF組，所有HFrEF病人的住院治療均遵循常規(guī)指南進(jìn)行，包括給予袢利尿劑、血管擴(kuò)張劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）、血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑（ARB）、血管緊張素受體腦啡肽酶抑制劑（ARNI）。另選取43名健康受試者（無記錄的合并癥或藥物）作為對照組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號：2024WZ200）。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)

參照指南推薦的藥物治療至少3個(gè)月^［13］；紐約心臟病協(xié)會(huì)（New York Heart Association，NYHA）心功能分級Ⅰ～Ⅳ級：LVEF≤40%；病人或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)

合并糖尿病酮癥酸中毒、惡性腫瘤、危及生命的重大疾??；嚴(yán)重感染；病歷資料不完善者。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 血清學(xué)指標(biāo)

采集所有受試者納入當(dāng)天靜脈血3 mL，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室化驗(yàn)分析，包括全血細(xì)胞計(jì)數(shù)、血尿素氮、N末端B型利納肽原（NT-proBNP）等。全血細(xì)胞計(jì)數(shù)使用日本Sysmex XN9000全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀測定，使用全自動(dòng)生化分析儀（普朗醫(yī)療，PUZS-300 X 型）檢測血尿素氮（BUN），采用cobas c702全自動(dòng)生化分析儀（瑞士羅氏公司）及配套試劑（酶法，貨號：05168589190）檢測血清肌酐，使用雷度米特ABL9血?dú)夥治鰞x檢測電解質(zhì)，采用雙抗體夾心法免疫層析技術(shù)測定血清C反應(yīng)蛋白，采用SUPERFLEX單人份化學(xué)發(fā)光平臺測定NT-ProBNP水平。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測中性粒細(xì)胞表面標(biāo)志物

采集外周血樣本5 mL，使用EDTA抗凝管收集。血樣采集后1 h內(nèi)進(jìn)行處理。將血樣分離成500 μL的等分試樣。選擇針對中性粒細(xì)胞表面標(biāo)志物CD₁₆、CD₁₀、CD₄₅、CD_11b、CD_66b和CD₆₄的熒光標(biāo)記單克隆抗體。具體抗體：抗人CD₁₆-PE單克隆抗體（BD 555407，BioLegend302007），抗人CD₁₀-FITC單克隆抗體（BD 555374，BioLegend 312202），抗人CD₄₅-APC單克隆抗體（BD 555485，BioLegend 304012），抗人CD_11b-APC單克隆抗體（BD 555374，BioLegend 312202），抗人CD_66b-FITC單克隆抗體（BD 555483，BioLegend 304008），抗人CD₆₄-PE單克隆抗體（BD 561303，BioLegend 302012）。取100 μL全血加入至5 mL圓底試管中，加入5 μL的抗體混合物，混合后在4 ℃避光孵育30 min。孵育結(jié)束后，向每個(gè)試管中加入2 mL裂解液，使用BD Pharm Lyse^TM紅細(xì)胞裂解液進(jìn)行紅細(xì)胞裂解，室溫避光孵育10 min。隨后，以300×g離心5 min棄上清，重復(fù)1次裂解過程。裂解后，向試管中加入2 mL 磷酸鹽緩沖液（PBS），以300×g離心5 min棄上清，重復(fù)洗滌1次。洗滌后，使用500 μL PBS重懸細(xì)胞，充分混勻。使用標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)珠對BD FACSCanto^TMⅡ流式細(xì)胞儀進(jìn)行每日校準(zhǔn)，確保儀器性能穩(wěn)定。設(shè)定適當(dāng)?shù)那跋蛏⑸涔猓‵SC）和側(cè)向散射光（SSC）參數(shù)，用于區(qū)分白細(xì)胞群體。使用激光器及對應(yīng)的濾光片設(shè)置，APC：紅色激光，濾光片660/20 nmFITC：藍(lán)色激光，濾光片530/30 nm：藍(lán)色激光，濾光片585/42 nm。每次上機(jī)前充分混勻樣本，取200 μL樣本進(jìn)行檢測。每個(gè)樣本至少采集10 000個(gè)事件。使用FlowJo^TM流式細(xì)胞分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。通過FSC/SSC圖譜設(shè)定門限，區(qū)分中性粒細(xì)胞亞群，分別分析CD_11b、CD_66b和CD₆₄的表達(dá)情況。用中位熒光強(qiáng)度（MFI）和陽性率表示每個(gè)標(biāo)志物的表達(dá)水平。

1.3.3 終點(diǎn)全因死亡

在進(jìn)行為期2年的隨訪，記錄全因死亡，包括突發(fā)心搏驟停、猝死、心肌梗死、心臟瓣膜功能嚴(yán)重受損、心律失常、急性肺水腫、缺氧、肺部感染、多器官衰竭、血栓形成、肺栓塞。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，采用t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的定量資料以中位數(shù)或四分位間距［M（Q₁，Q₃）］表示，采用非參數(shù)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。定性資料以例數(shù)、百分比（%）表示，采用χ²檢驗(yàn)。采用Spearman相關(guān)性分析中性粒細(xì)胞表面標(biāo)志物與臨床、實(shí)驗(yàn)室參數(shù)的相關(guān)性，應(yīng)用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析評估中性粒細(xì)胞活化/成熟參數(shù)與預(yù)定義終點(diǎn)之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示為每IQR和95%置信區(qū)間（CI）的風(fēng)險(xiǎn)比（HR）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料

本研究共納入105例HFrEF病人。年齡64（56，72）歲；男78例，女27例；體質(zhì)指數(shù)（BMI）28（24，31）kg/m²；收縮壓124（105，130）mmHg，舒張壓72（70，83）mmHg；心率65（61，80）次/min；NYHA心功能分級Ⅰ級9例，Ⅱ級46例，Ⅲ級50例；合并癥，心力衰竭的非缺血性病因?qū)W66例，高血壓87例，2型糖尿病52例，心房顫動(dòng)53例；實(shí)驗(yàn)室參數(shù)，血紅蛋白136（122，143）g/L；白細(xì)胞計(jì)數(shù)7.05（5.95，8.75）×10⁹/L；血清肌酐109.62（79.56，156.47）μmol/L；血尿素氮91.00（47.32，98.28）mmol/L；總膽固醇4.24（3.31，4.91）mmol/L；C反應(yīng)蛋白3.0（1.5，8.2）mg/L；丁酰膽堿酯酶6.87（5.49，8.65）U/L；NT-proBNP 2 107（745，4 407）ng/L；中性粒細(xì)胞標(biāo)志物，中性粒細(xì)胞CD_11b 30 118（23 099，39 710），中性粒細(xì)胞CD_66b 5 211（4 162，6 435），中性粒細(xì)胞CD₆₄ 5 244（4 461，6 039）；使用藥物，β受體阻滯劑128例，利尿劑67例，鹽皮質(zhì)激素拮抗劑107例，If抑制劑12例，ACEI 治療46例，ARB 17例，ARNI 61例；與接受ACEI/ARB的病人相比，接受ARNI治療的病人中性粒細(xì)胞CD_11b、CD_66b、CD₆₄表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P分別為0.801，0.053，0.539）。

2.2 兩組CD_11b、CD_66b和CD₆₄表達(dá)比較

HFrEF組CD₆₄表達(dá)高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），兩組CD_11b和CD_66b表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表1。

2.3 中性粒細(xì)胞活化/成熟標(biāo)志物與臨床參數(shù)的相關(guān)性

Spearman相關(guān)性分析顯示，CD_66b與年齡呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.181，P＝0.036），與BMI呈正相關(guān)（r＝0.243，P＝0.005）；CD₆₄與BMI呈正相關(guān)（r＝0.174，P＝0.005）。

2.4 中性粒細(xì)胞活化/成熟標(biāo)志物與心力衰竭嚴(yán)重程度的相關(guān)性

Spearman相關(guān)性分析顯示，CD_11b和CD_66b表達(dá)均與NT-proBNP呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。詳見表2。

2.5 中性粒細(xì)胞活化/成熟標(biāo)志物與實(shí)驗(yàn)室參數(shù)的相關(guān)性

Spearman相關(guān)性分析顯示，CD_66b與肌酐呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.215，P＝0.012）。詳見表3。

2.6 中性粒細(xì)胞活化/成熟標(biāo)志物與終點(diǎn)全因死亡的關(guān)系

在22（15，27）個(gè)月的隨訪期中，10例HFrEF病人達(dá)到終點(diǎn)全因死亡。Cox回歸分析顯示，中性粒細(xì)胞CD_11b、CD_66b和CD₆₄表達(dá)與終點(diǎn)全因死亡無關(guān)（P均＞0.05）。詳見表4。

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，HFrEF組CD₆₄表達(dá)高于對照組（P＜0.05）。Spearman相關(guān)性分析顯示，CD_11b和CD_66b表達(dá)均與NT-proBNP呈負(fù)相關(guān)（r值分別為－0.243，－0.250，P分別為0.005，0.004），而與CD₆₄無相關(guān)性。中性粒細(xì)胞CD_11b和CD_66b與中性粒細(xì)胞CD₁₀（中性內(nèi)肽酶）表達(dá)呈正相關(guān)，已有研究表明較高的CD₁₀水平與更好的預(yù)后相關(guān)^［14］。在22（15，27）個(gè)月的隨訪期內(nèi)，10例HFrEF病人達(dá)到終點(diǎn)全因死亡。單變量Cox回歸分析顯示，中性粒細(xì)胞CD_11b、CD_66b和CD₆₄表達(dá)與終點(diǎn)全因死亡無關(guān)（P均＞0.05）。

慢性亞臨床炎癥在心力衰竭的發(fā)展和病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用^［15］。已知慢性心力衰竭激活免疫系統(tǒng)和炎癥反應(yīng)，其特征是血液循環(huán)中促炎細(xì)胞因子水平升高^［15-16］。炎癥和免疫細(xì)胞參與急性肌細(xì)胞損傷和心力衰竭^［17］。心力衰竭發(fā)生時(shí)，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素6和凝集素3等炎性因子增加^［18］。心肌炎和壓力超負(fù)荷的小動(dòng)物模型表明，心力衰竭期間存在免疫激活^［19］。

中性粒細(xì)胞是人體循環(huán)中含量豐富的白色細(xì)胞類型，具有巨大的周轉(zhuǎn)率。在慢性炎癥中，炎癥驅(qū)動(dòng)下會(huì)引起造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的功能障礙，以維持中性粒細(xì)胞數(shù)量。此外，脂質(zhì)和葡萄糖代謝以及衰老在本質(zhì)上調(diào)節(jié)骨髓生成和中性粒細(xì)胞功能。心血管風(fēng)險(xiǎn)因素，如高膽固醇血癥、高血糖、年齡和壓力會(huì)重新編程造血干細(xì)胞功能，以產(chǎn)生初級促炎中性粒細(xì)胞^［2］。壓力誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞增多可能導(dǎo)致中性粒細(xì)胞加速動(dòng)脈粥樣硬化病灶的浸潤，從而加速動(dòng)脈粥樣硬化并導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定^［20］。類似的，在小鼠模型中誘導(dǎo)心肌壓力超負(fù)荷導(dǎo)致中性粒細(xì)胞迅速進(jìn)入心臟；而誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞減少可減輕心臟肥大和功能障礙并減少炎癥^［21］。

中性粒細(xì)胞不具有成熟和多樣化細(xì)胞的同質(zhì)細(xì)胞群，而是具有表型和功能差異的多樣化中性粒細(xì)胞亞群^［2］。這些亞群的表達(dá)對于正確解釋其在心血管疾病中的作用是至關(guān)重要的。CD_11b也稱為整合素α-M和巨噬細(xì)胞-1抗原，是一種整合素家族成員，參與在炎癥部位黏附至活化的內(nèi)皮細(xì)胞和其他免疫過程。在活化后，整合素α-M/β₂結(jié)合細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）、纖維蛋白原和C3補(bǔ)體片段C3bi等配體，以介導(dǎo)吞噬細(xì)胞黏附、迀移和補(bǔ)體調(diào)理顆粒的攝取。CD_11b通過脂多糖刺激上調(diào)^［22］。中性粒細(xì)胞CD_11b表達(dá)被認(rèn)為是早發(fā)性新生兒感染的早期標(biāo)志物^［23］。CD₆₄也稱為Fcγ受體1，是人類髓細(xì)胞表面的膜受體。靜息中性粒細(xì)胞中CD₆₄表達(dá)水平很低；在中性粒細(xì)胞激活時(shí)，受感染或內(nèi)毒素暴露時(shí)產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子干擾素γ和粒細(xì)胞集落刺激因子會(huì)強(qiáng)烈上調(diào)CD₆₄^［24］。Jc受體CD₆₄在其表面上的表達(dá)已顯示與膿毒癥、感染性疾病和實(shí)體器官移植受體中的并發(fā)癥相關(guān)^［25-27］。CD_66b是一個(gè)單鏈糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白，是免疫球蛋白超家族的成員^［28］。CD_66b表達(dá)于人類粒細(xì)胞，并被認(rèn)為是粒細(xì)胞活化標(biāo)志物^［29］。在金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞功能障礙的背景下，中性粒細(xì)胞CD_66b過表達(dá)^［30］。因此，CD_11b、CD_66b和CD₆₄是嗜中性粒細(xì)胞活化標(biāo)志物，在靜息時(shí)嗜中性粒細(xì)胞的表達(dá)較低，但在促炎刺激后過度表達(dá)。本研究中并未觀察到CD_11b、CD_66b和CD₆₄與預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)；然而，隨著CD_11b表達(dá)的增加，生存率有所改善的趨勢。由于HFrEF的特征是低度慢性炎癥，心力衰竭病人中性粒細(xì)胞激活標(biāo)志物的水平增加是可以預(yù)期的。然而，心力衰竭中存在的低度炎癥不同于急性感染，可能對中性粒細(xì)胞的周轉(zhuǎn)和狀態(tài)產(chǎn)生不同的影響。CD_11b和CD_66b也可被視為成熟標(biāo)志物。低CD_11b表達(dá)是未成熟低密度中性粒細(xì)胞的一個(gè)標(biāo)志，這些細(xì)胞在炎癥疾病或惡性腫瘤病人的血液中發(fā)現(xiàn)^［31］。在嚴(yán)重全身性感染期間描述了未成熟中性粒細(xì)胞的大量動(dòng)員，其特征在于低CD₁₀表達(dá)，這可能與本研究中發(fā)現(xiàn)的CD_11b、CD_66b和CD₁₀表達(dá)之間的直接相關(guān)性一致。在本研究中，與對照組相比，HFrEF病人中CD₆₄的表達(dá)水平更高。近年來，CD₆₄作為炎癥標(biāo)志物受到了廣泛關(guān)注，可能為慢性炎癥性疾病的免疫調(diào)節(jié)靶點(diǎn)^［32］。

綜上所述，中性粒細(xì)胞活化/成熟標(biāo)志物CD₆₄在慢性心力衰竭病人中顯著升高，反映了中性粒細(xì)胞狀態(tài)的變化。CD₆₄可能反映了增強(qiáng)的低度促炎狀態(tài)，而CD_11b、CD_66b表達(dá)降低表明中性粒細(xì)胞成熟狀態(tài)改變。本研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了中性粒細(xì)胞在心力衰竭疾病病理生理和風(fēng)險(xiǎn)分層中的潛在作用，未來應(yīng)進(jìn)一步研究中性粒細(xì)胞亞群并尋找參與炎癥和心力衰竭過程的下游關(guān)鍵分子。

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（收稿日期：2023-05-31）

（本文編輯 鄒麗）