維生素D與冠心病因果關(guān)系的雙向兩樣本孟德爾隨機化研究

摘要 目的：探索維生素D與冠心病（CHD）的因果關(guān)系。方法：從一些廣泛的全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）中收集維生素D與CHD強相關(guān)的獨立單核苷酸多態(tài)性位點（SNP）作為工具變量。孟德爾隨機化估計采用逆方差加權(quán)法（IVW）、加權(quán)中位數(shù)法和 MR-Egger法。敏感性分析使用Cochran′s Q檢驗、MR-Egger 截距檢驗、MR-PRESSO、MR Steiger檢驗、leave-one-out分析和漏斗圖。結(jié)果：共篩選到69個維生素D的SNP，IVW分析法顯示維生素D和CHD之間存在因果關(guān)系［OR＝0.994，95%CI（0.988，0.999），P＝0.047 6］，Cochran′s Q顯示Q＝179.789 8，P＝1.76e-12，表明納入分析的SNP之間不存在異質(zhì)性，MR-Egger截距P＝0.746 114 4，表明篩選得到的SNP不存在基因多效性，MR-PRESSO未發(fā)現(xiàn)離群的SNP，leave-one-out敏感性分析顯示因果估計不會受到某些SNP效應(yīng)的影響。反向孟德爾隨機化分析結(jié)果IVW分析法OR＝0.416，95%CI（0.064，2.688），P＝0.357 056 10，Cochran′s Q顯示Q＝66.902 52，P＝1.022 131e-13，MR-Egger截距P＝0.850 615，表明維生素D和CHD不支持反向因果關(guān)系。結(jié)論：通過孟德爾隨機化研究證明維生素D對CHD存在因果關(guān)聯(lián)，但是反向因果關(guān)系是不可靠的，有助于提高對維生素D保護CHD機制的理解。

關(guān)鍵詞 冠心?。幻系聽栯S機化；維生素D；因果關(guān)系

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.21.001

A Two-way Two-sample Mendelian Randomization Study of the Causal Relationship Between Vitamin D and Coronary Heart Disease

RAN Qingzhi¹， LI Aoshuang²， MA Jingzhuo¹， CHEN Hengwen¹， ZHANG Yue¹

1. Guang′anmen Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100053， China; 2. Dongzhimen Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100070， China

Corresponding Author ZHANG Yue， E-mail： 13651311863@139.com

Abstract Objective：To explore the causal relationship between vitamin D and coronary heart disease（CHD）.Methods：Independent single nucleotide polymorphism（snp） loci strongly associated with vitamin D and CHD were collected from a number of extensive genome-wide association studies（GWAS） as instrumental variables.The inverse variance weighting（IVW），weighted median and MR-Egger method were used to estimate Mendelian randomization.Cochran′s Q test，MR-Egger intercept test，MR-PRESSO test，MR Steiger test，leave-one-out analysis，and funnel plot were used for sensitivity analysis.Results：A total of 69 SNPS of vitamin D were screened.IVW analysis showed a causal relationship between vitamin D and CHD（OR＝0.994，95%CI 0.988-0.999，P＝0.047 6）.Cochran′s Q showed Q＝179.789 8，P＝1.76e-12，indicating that there was no heterogeneity among the SNP in the analysis.The MR-Egger intercept was P＝0.746 114 4，indicating that there was no genetic pleiotropy in the SNP obtained from the screening.MR-PRESSO did not find any outlier SNP.Leave-one-out sensitivity analysis showed that causal estimation would not be affected by the effect of certain SNP.Reverse Mendelian randomization analysis IVW analysis，OR＝0.416，95%CI（0.064-2.688），P＝0.357 056 10，Cochran′s Q shows Q＝66.902 52，P＝1.022 131e-13，and MR-Egger intercept（P＝0.856 15），indicated that vitamin D and CHD did not support reverse causality.Conclusion：This Mendelian randomization study demonstrates some causal association between vitamin D and CHD，but reverse causality is unreliable and to helpful to understanding some the mechanisms that vitamin D protects CHD.

Keywords coronary heart disease; mendelian randomization; vitamin D; causality

基金項目 國家自然科學基金項目（No.82074396）；中國中醫(yī)科學院科技創(chuàng)新工程重大攻關(guān)項目（No.CI2021A05011）；中國中醫(yī)科學院科技創(chuàng)新工程創(chuàng)新團隊項目（No.CI2021B017-05）；中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院續(xù)航人才工程青年拔尖人才培養(yǎng)項目；新疆維吾爾自治區(qū)區(qū)域協(xié)同創(chuàng)新專項（上海合作組織科技伙伴計劃及國際科技合作計劃）項目“民族藥海外注冊與臨床國際科技合作與服務(wù)研究”（No.2022E01001）

作者單位 1.中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院（北京 100053）；2.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院（北京 100070）

通訊作者 張躍，E-mail：13651311863@139.com

引用信息 冉清智，李傲霜，馬靜卓，等.維生素D與冠心病因果關(guān)系的雙向兩樣本孟德爾隨機化研究［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（21）：3841-3849.

維生素D作為脂溶性維生素調(diào)節(jié)機體鈣磷代謝的重要激素，主要通過日照條件下皮膚合成，少部分可經(jīng)飲食獲得^［1］。維生素D活性形式主要為1，25二羥維生素D₃［1，25（OH）₂D₃］，其通過與維生素D受體（VDR）結(jié)合而發(fā)揮生理作用^［2］。1，25（OH）₂D₃能夠誘導(dǎo)單核細胞分化為巨噬細胞，減少炎性細胞和趨化因子的釋放^［3］。研究表明，血液中維生素D代謝產(chǎn)物25-羥維生素D［25（OH）D］的濃度較低與冠心?。╟oronary heart disease，CHD）、腦卒中及全因死亡風險升高相關(guān)^［4］。

CHD主要由冠狀動脈供血不足引起。這種疾病通常是由于冠狀動脈被動脈粥樣斑塊阻塞或收縮引起的，導(dǎo)致心臟無法獲得足夠的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，臨床表現(xiàn)為胸痛或壓力感、呼吸困難、心悸等^［5］。我國城鄉(xiāng)居民疾病死亡構(gòu)成比中，心血管疾?。–VD）占首位，2020年分別占農(nóng)村、城市死因的48.00%和45.86%；CHD是我國心血管病死亡的三大主要原因之一^［6］。

維生素D是人體鈣磷代謝調(diào)節(jié)的必要組成部分，既往研究發(fā)現(xiàn)維生素D缺乏癥與心血管等疾病的發(fā)生及全因死亡風險升高有關(guān)^［7-8］。但有研究顯示，沒有結(jié)果表明補充維生素D可以降低心血管事件的發(fā)生率^［9］。這一矛盾現(xiàn)象可能源于多數(shù)隨機對照試驗（randomized controlled trial，RCT）并未考慮到受試者基線的維生素D水平^［10］。因此，維生素D與CHD關(guān)聯(lián)緊密但缺乏清晰的雙向因果關(guān)系。孟德爾隨機化（Mendelian randomization，MR）研究借助暴露的遺傳變異如單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymor phisms，SNPs）作為工具變量，來評估暴露和結(jié)局之間因果關(guān)系，與觀察性研究相比，孟德爾隨機化減少了潛在混雜因素和反向因果的影響，是一種相對精確的流行病學方法。孟德爾隨機化越來越多地用于評估暴露與結(jié)果之間的可信因果關(guān)系。孟德爾隨機化基于通過減數(shù)分裂隨機分類遺傳變異的原則，使用與暴露相關(guān)的遺傳變異作為工具變量（IVs）來推斷危險因素（如維生素D）與疾病結(jié)局（如CHD）之間的關(guān)聯(lián)^［11］。由于遺傳變異在疾病發(fā)作前是隨機分配的，孟德爾隨機化分析可以避免混雜因素和反向因果關(guān)系，進一步確定特定結(jié)果的因果決定因素^［12］。

1 資料與方法

1.1 研究設(shè)計

使用雙樣本的孟德爾隨機化分析評估維生素D對CHD之間的風險因果關(guān)系。孟德爾隨機化分析主要運用了逆方差加權(quán)法（IVW）對暴露與結(jié)局間的因果效應(yīng)作出推斷。孟德爾隨機化的基本原理是篩選暴露和結(jié)局有統(tǒng)計學意義的遺傳變異作為IVs，推斷兩者存在因果關(guān)聯(lián)與否^［13］。本研究以維生素D與CHD互相作為暴露因素與結(jié)果變量，篩選顯著相關(guān)的SNPs作為IVs。進行孟德爾隨機化研究需要滿足3個關(guān)鍵假設(shè)即相關(guān)性假設(shè)（工具變量與暴露密切相關(guān)）、獨立性假設(shè)（工具變量獨立于任何混雜因素）、排除限制假設(shè)（工具變量僅通過暴露而非其他方式影響結(jié)果）。詳見圖1。

1.2 研究環(huán)境

兩位獨立的研究者開展數(shù)據(jù)整理工作，開展地點位于中國中醫(yī)科學院（蘇州校區(qū)），開展時間2023年9月1日—2023年10月31日；一位研究者通過全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）數(shù)據(jù)庫下載相關(guān)數(shù)據(jù)信息，另一位研究者通過R Studio軟件整理暴露與結(jié)局數(shù)據(jù)，本研究開展過程完全遵循孟德爾隨機化研究的報告規(guī)范（STROBE-MR）。

1.3 數(shù)據(jù)來源

因果關(guān)系中暴露組與結(jié)局變量數(shù)據(jù)均來源于全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）數(shù)據(jù)庫（https：//gwas.mrcieu.ac.uk/）收錄的數(shù)據(jù)，以上數(shù)據(jù)來源均來自歐洲^［14-15］。反向因果關(guān)系中暴露組數(shù)據(jù)及結(jié)局變量數(shù)據(jù)，與正向因果關(guān)系中數(shù)據(jù)來源相反，數(shù)據(jù)Dataset相同。詳見表1。

1.4 SNP的篩選和評估

首先，以P＜5×10^－8為篩選條件從GWAS數(shù)據(jù)庫中提取與暴露顯著相關(guān)的SNPs作為IVs，然后通過設(shè)置參數(shù)（r²＜0.000 1，kb＝10 000），排除連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）的干擾，以確保IVs的獨立性。剔除具有回文結(jié)構(gòu)的SNPs。剔除F＜10的SNPs，以排除弱工具。為避免弱IVs偏移，將F＞10定義為無弱IVs偏移，通過F＝β₂exposure/SE₂exposure，評估所選單個IVs的強度^［13］。F統(tǒng)計量評估IVs的強度，SE為維生素D的標準誤差^{［13，16］}。

1.5 孟德爾隨機化分析

本研究主要采用IVW等5種方法來計算維生素D遺傳變異與CHD之間的因果關(guān)聯(lián)。IVW是首要檢測，經(jīng)過元分析結(jié)合獨立SNP的Wald估計值，確定總體估計值，并且CHD效應(yīng)對維生素D效應(yīng)的加權(quán)回歸斜率為結(jié)果估計值（截距限制為零）^［17］。加權(quán)中位數(shù)法要求至少50%的權(quán)重來自有效的IVs，存在異質(zhì)性但不存在水平多效性時其為最佳選擇；MR-Egger回歸允許所有SNPs存在多效性，截距測試檢測水平異質(zhì)性，糾正多效性后提供估計結(jié)果^{［1，18］}。簡單模式法和加權(quán)模式可作為額外孟德爾隨機化分析，與敏感性分析檢驗中已經(jīng)開展的3種方法共同驗證，確定了評估結(jié)果穩(wěn)健性^{［1，19］}。IVW結(jié)果顯著（P＜0.05），且余下方法與IVW法方向一致時，可以認為存在因果關(guān)系。

1.6 質(zhì)量控制

質(zhì)量控制確保孟德爾隨機化結(jié)果的穩(wěn)健性：1）Cochran′s Q測定孟德爾隨機化分析中異質(zhì)性。若P＜0.05，表明SNP存在異質(zhì)性，則使用IVW完成最終孟德爾隨機化分析^［13］。2）MR-Egger-intercept測試判斷水平多效性，截距（P＞0.05）表示無水平多效性^［17］。3）MR-PRESSO檢驗離群SNP并刪除二次孟德爾隨機化分析。4）留一法（leave-one-out sensitivitytest）逐個剔除IVs，計算孟德爾隨機化結(jié)果，若剔除結(jié)局與整體結(jié)局差異大，表明該IVs是敏感的^{［17，20］}。本研究的雙樣本孟德爾隨機化分析是使用R軟件（版本4.3.2）和Two Sample MR（版本0.5.7）和MR-PRESSO軟件包（版本1.0.0）進行的，檢驗水準α＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1 對維生素D遺傳易感和CVD風險的因果關(guān)系估計

利用隨機效應(yīng)IVW方法，發(fā)現(xiàn)維生素D的遺傳易感性與CVD保護因素的增加有關(guān)。維生素D充足的CVD患病率僅為對照組的0.994倍［OR＝0.994，95%CI（0.988，0.999），P＝0.047］。通過加權(quán)中位數(shù)分析、MR-Egger回歸分析、加權(quán)模式分析和簡單模式分析以及MR-PRESSO方法（該方法可識別和處理異常值）得出的一致結(jié)果支持了穩(wěn)健性。

2.2 孟德爾隨機化的敏感性分析

首先，在異質(zhì)性檢驗中，根據(jù)Cochran′s Q統(tǒng)計量計算出的P＜0.05，表明SNPs之間存在異質(zhì)性。隨后，在孟德爾隨機化分析中，采用了IVW隨機效應(yīng)法作為主要分析技術(shù)。同時，MR-Egger回歸截距檢驗沒有發(fā)現(xiàn)與維生素D和任何CVD相關(guān)的IVs存在水平多向性。此外，Leave-one-out方法表明，維生素D與CVD風險之間的潛在因果關(guān)系不受任何單個SNP的顯著影響。

2.3 維生素D與CHD的孟德爾隨機化分析

2.3.1 工具變量

刪除存在連鎖不平衡的IVs后，本研究將維生素D作為暴露納入69個SNP作為IVs，所選單個IVs的強度，其F統(tǒng)計值范圍為34.475～2 448.336，納入的每個SNP的F統(tǒng)計量均大于經(jīng)驗閾值10，表明所有SNPs 與維生素D強相關(guān)，受到弱工具偏倚影響較小。所有SNP 均符合連鎖不平衡獨立且達到全基因組顯著性水平（P＜5×10^－9）。詳見表2。

2.3.2 孟德爾隨機化因果推理

維生素D與CHD因果推斷中，IVW法顯示OR＝0.994（0.988，0.999），遺傳多效性不影響結(jié)果（截距＝－4.573543e-05，S＝0.000 140 670 1，P＝0.746 114 4）。另外4種方法結(jié)果相似，均可表明基因預(yù)測的維生素D與CHD存在因果關(guān)系，詳見表3、圖2。

2.3.3 質(zhì)量控制

異質(zhì)性檢驗：維生素D對CHD，Cochran的Q檢驗結(jié)果顯示，Q＝179.788，P＝1.76e-12，表明納入分析的SNP之間不存在異質(zhì)性。水平多效性檢驗：MR-Egger回歸分析顯示，截距項無統(tǒng)計學意義，維生素D對CHD的P＞0.05，提示選定維生素D的IVs中無顯著水平多效性的存在。敏感性分析：Leave-one-out法敏感性分析結(jié)果顯示，對維生素D與CHD的因果推斷中，各組孟德爾隨機化分析的結(jié)果均穩(wěn)健。因此，孟德爾隨機化分析結(jié)果支持維生素D與CHD之間的因果關(guān)系。詳見圖3～圖5。

2.4 CHD與維生素D的反向孟德爾隨機化分析

結(jié)果表明，CHD與維生素D之間無因果關(guān)聯(lián)。

2.4.1 IVs

本研究剔除了存在連鎖不平衡的SNP，去除了1個與混雜因素相關(guān)的SNP，并根據(jù)MR-PRESSO結(jié)果剔除0個離群的SNP。最終共納入8個SNP IVs進行孟德爾隨機化分析，所有SNP的F統(tǒng)計量36.270～192.038。

2.4.2 兩樣本孟德爾隨機化研究結(jié)果及質(zhì)量控制

CHD與維生素D因果推斷中，Cochran′s Q顯示Q＝66.90252，P＝1.022131e-13；IVW法顯示P＝0.35705610，遺傳多效性不影響結(jié)果（截距＝0.001 694 685，S＝0.008 437 55；P＝0.850 615）。另外4種方法也得到了基本一致的結(jié)果，P均＞0.05，說明維生素D可減輕CHD的發(fā)生風險，但反之，CHD對維生素D的發(fā)生無因果關(guān)聯(lián)。詳見圖6～圖8。

3 討 論

本研究采用孟德爾隨機化方法進行分析，觀察到在維生素D與CHD存在正相關(guān)關(guān)系，這意味著維生素D作為保護因素而影響CHD。此外，基于5種孟德爾隨機化方法（IVW、MR-Egger、加權(quán)中位數(shù)法、水平多重性檢驗和Cochran′s Q異質(zhì)性檢驗），本研究從GAWS中初步篩選了維生素D暴露下CHD的69個SNP，從遺傳學的角度探究了維生素D與CHD之間潛在的雙向因果關(guān)聯(lián)，結(jié)果提示，維生素D可保護CHD，但反向CHD與維生素D的發(fā)生無因果關(guān)聯(lián)。

孟德爾隨機化設(shè)計基于自然隨機分配方法，因果關(guān)系通過SNP評估有效地降低混雜因素的影響，因為遺傳變異通常不受環(huán)境和行為因素的干擾^［21］。冠心病組血清25-羥維生素D水平明顯低于對照組（冠狀動脈健康人群），冠心病組中有84.0%的病人存在維生素D缺乏現(xiàn)象，維生素D缺乏與冠心病發(fā)病率之間存在相關(guān)性^［22］。Boucher等^［23］研究提出，低水平25-羥維生素D人群患心血管疾病的風險更高。上述研究間接證明了維生素D與CHD之間的正相關(guān)關(guān)系。并且研究采用孟德爾隨機化分析方法，增強了所觀察到的關(guān)聯(lián)性；這種方法利用IVs，可以更可靠地評估因果關(guān)系。利用遺傳信息能夠減少潛在的混雜因素，并建立起維生素D與CHD之間更具因果性的關(guān)系。

前期大量研究發(fā)現(xiàn)，維生素D保護CHD的機制主要從以下4個方面開展，維生素D是一種脂溶性維生素，對心血管健康具有重要的保護作用。1）鈣和磷代謝調(diào)節(jié)：維生素D能夠促進鈣的吸收和轉(zhuǎn)運，以及調(diào)節(jié)磷的排泄。這對于維持鈣磷平衡以及骨骼健康至關(guān)重要。高血鈣和低血磷水平與CHD風險增加相關(guān)，而維生素D可以幫助維持正常的血液鈣磷水平，從而降低CHD風險^［24］。2）抗炎作用：維生素D具有抗炎作用并可以抑制促炎性細胞因子的釋放，并增加抗炎性細胞因子的產(chǎn)生^［25］。3）心臟肌肉細胞保護：維生素D可以通過調(diào)節(jié)心臟肌肉細胞的功能來保護心血管系統(tǒng)。其可改善心肌收縮力和心肌細胞的存活能力，減少心肌缺血、缺氧和纖維化等心血管病變^［26］。4）血管保護：維生素D對血管內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞具有保護作用。通過增加一氧化氮（NO）的合成和釋放，促進血管舒張，降低血壓，減輕動脈硬化^［27］。

本研究首次使用孟德爾隨機化識別維生素D與CHD結(jié)局的孟德爾隨機化，該研究利用了迄今為止最大的公開可獲得的GWAS數(shù)據(jù)。通過兩個大型隊列中復(fù)制了孟德爾隨機化結(jié)果，需要基因在兩個GWAS隊列中達到顯著性，驗證結(jié)果的穩(wěn)健性并明顯降低假陽性的可能性，這可以進一步提高臨床試驗的成功率。盡管此次研究結(jié)果為維生素D與CHD之間的正相關(guān)提供了有力的證據(jù)，但本研究也存在一些局限性。1）CHD作為復(fù)雜的病理過程受到多種因素影響，包括年齡、遺傳、性別、生活習慣等，綜合分析其與腦卒中之間的相互作用是更科學的。2）本研究發(fā)現(xiàn)維生素D作為保護因素與CHD存在正向因果關(guān)系，仍需要前瞻性大規(guī)?？v向隊列研究去進一步臨床驗證，也需要對維生素D和CHD的保護機制進行更深入的研究；3）本研究所涉及的參與者均為歐洲人，其他族群結(jié)果或有差異。

鑒于研究的局限性，本研究團隊將針對未來研究給出一些研究建議。首先，未來的研究應(yīng)旨在通過將高劑量短期暴露實驗與孟德爾隨機化分析相結(jié)合，彌合孟德爾隨機化與真實世界臨床試驗之間的差距。這種方法將提高對孟德爾隨機化中觀察到的藥物作用與臨床結(jié)果之間關(guān)系的理解，并增強研究結(jié)果向?qū)嶋H醫(yī)學應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。其次，為了解決潛在的偏見和提高結(jié)果的普遍性，未來的研究應(yīng)包括代表不同種族背景的不同人群隊列。在具有不同遺傳背景的個體中驗證結(jié)果可以增強研究結(jié)果對更廣泛病人群體的適用性。最后，通過孟德爾隨機化并不能保證其在臨床環(huán)境中的有效性。因此，進一步的實驗驗證和嚴格的臨床試驗是必要的，以確認這些目標的治療潛力，并評估其在真實世界情況下的安全性和有效性。通過將這些建議納入未來的研究工作中，研究者可以促進對維生素D保護CHD關(guān)聯(lián)的理解，發(fā)現(xiàn)新的治療可能性，并最終提高相關(guān)疾病的臨床療效。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)維生素D對CHD之間存在正相關(guān)因果關(guān)系的保護作用，但反向孟德爾隨機研究并不成立。了解維生素D與CHD之間的關(guān)系，可以幫助制定預(yù)防策略；維持健康的維生素D水平可能有助于保護心臟功能。

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（收稿日期：2023-11-15）

（本文編輯 鄒麗）