六盤山區(qū)幼齡蒙古櫟根系共生真菌的分離和鑒定

摘 要：" 為闡明幼齡蒙古櫟根系可培養(yǎng)共生真菌的群落結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化，該文從不同年齡的幼齡蒙古櫟（Quercus mongolica）根系分離可培養(yǎng)共生真菌，并通過菌落形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)的方法對(duì)其物種進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明：（1）從幼齡蒙古櫟根系中分離獲得249株真菌，經(jīng)鑒定隸屬于2門5綱7目 8科 15屬 18種，其中2種隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycetes），16種隸屬于子囊菌門（Ascomycota）。種水平上，以灰粉無(wú)柄盤孢菌（Pezicula pruinosa）分離頻率最高，占分離菌株總數(shù)的81.93%；托雷斯氏叢赤殼菌（Dactylonectria torresensis）、強(qiáng)壯土赤殼菌（Ilyonectria robusta）、北美黑盤菌（Atrocalyx nordicus）次之，分別占分離菌株總數(shù)的4.02%、2.01%和2.01%。（2）共生真菌種類和數(shù)量在不同樹齡的蒙古櫟中表現(xiàn)出較大差異，其中4～5年生植株分離頻率最高（44.98%），依次為3年生植株（29.32%）、2年生植株（19.68%）和1年生植株（6.02%）。綜上認(rèn)為，寧夏六盤山幼齡蒙古櫟根系可培養(yǎng)共生真菌種類豐富，隨樹齡增長(zhǎng)其種類和數(shù)量增加；灰粉無(wú)柄盤孢菌是六盤山幼齡蒙古櫟根系可培養(yǎng)共生真菌的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)物種。該研究結(jié)果為進(jìn)一步挖掘植物共生微生物資源，探索蒙古櫟與共生微生物互作在本地逆境的適應(yīng)機(jī)制提供了參考。

關(guān)鍵詞： 六盤山區(qū)， 蒙古櫟， 共生真菌， 分離培養(yǎng)， 鑒定

中圖分類號(hào)：" Q948.12

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：" A

文章編號(hào)：nbsp; 1000-3142（2024）10-1817-10

10期

鄧曉娟等： 六盤山區(qū)幼齡蒙古櫟根系共生真菌的分離和鑒定

收稿日期：" 2024-03-24 接受日期：" 2024-04-28

基金項(xiàng)目：" 國(guó)家自然科學(xué)基金（31960346，31660195）； 寧夏自然科學(xué)基金（2021AAC03202）； 寧夏重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目 （2022BBF03028）。

第一作者： 鄧曉娟（1983—），博士，副教授，主要從事菌根真菌生態(tài)功能方面研究，（E-mail）xiaojuantuber@163.com。

*通信作者：" 閆興富，博士，教授，主要從事植物生態(tài)方面研究，（E-mail）xxffyan@126.com。

Isolation and identification of symbiotic fungi in roots of

young Quercus mongolica on Liupan Mountain

DENG Xiaojuan1，2， LI Minqi1，2， LIU Jianli1， REN Yufeng1， ZHOU Libiao1， YAN Xingfu1，2*

（1. College of Biological Science and Engineering， North Minzu University， Yinchuan 750021， China; 2. Key Laboratory of Ecological Protection

of Agro-Pastoral Ecotones in the Yellow River Basin， National Ethnic Affairs Commission of China， Yinchuan 750021， China）

Abstract：" In order to elucidate community structures and dynamic changes of culturable symbiotic fungal colony in roots of Quercus mongolica， the symbiotic fungi in roots of young Q. mongolica at different ages were isolated directly. The isolated fungi were identified based on the morphological characteristics of colony and molecular analysis. The results were as follows： （1）A total of 249 fungal strains were isolated from the roots of young Q. mongolica， 18 species belonging to 15 genera， 8 families， 7 orders， 5 classes and 2 phyla were recognized. Among them， two species belonged to Basidiomycetes and 16 species belonged to Ascomycota. Pezicula pruinosa was the species with the highest isolation frequency （81.93%）， followed by Dactylonectria torresensis （4.02%）， Ilyonectria robusta （2.01%） and Atrocalyx nordicus （2.01%）. （2）Significant differences in species and quantities of symbiotic fungi demonstrated in different ages of young Quercus mongolica， with the highest frequency of isolation occurring in the 4-5 years old （44.98%） followed by the triennial （29.32%）， biennial （19.68%） and annual （6.02%）. To sum up， culturable symbiotic fungi in the roots of young Q. mongolica on Liupan Mountain are highly diverse. Species and quantities of isolates vary at different ages of trees， the diversity increases with the growth of tree， and" Pezicula pruinosa is the most dominant culturable symbiotic fungi in roots of young Quercus mongolica. The results provide the reference for further investigating symbiotic fungal resources and exploring the microbial symbiotic mechanism of Q. mongolica in adapting to local environment.

Key words： Liupan Mountain， Quercus mongolica， symbiotic fungi， isolation and culture， identification

蒙古櫟（Quercus mongolica）廣泛分布于我國(guó)的北方地區(qū)，具有耐嚴(yán)寒、耐干旱、耐貧瘠的特點(diǎn)，在山頂或者山脊附近常形成片狀成林或單優(yōu)勢(shì)群落，因此通常作為北方森林植被的主要建群種（張中惠等，2021；連俊華等，2022）。六盤山位于黃土高原的中西部，地處北方農(nóng)牧交錯(cuò)帶與暖溫半濕潤(rùn)帶向半干旱地區(qū)過渡的生態(tài)脆弱帶上，森林覆蓋率高達(dá)70%，被譽(yù)為黃土高原的“濕島”和關(guān)中平原的天然屏障。蒙古櫟次生林是六盤山區(qū)森林群落的優(yōu)勢(shì)種和頂級(jí)群落，對(duì)于維護(hù)當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)平衡具有重要的研究?jī)r(jià)值（王占印，2009）。

在自然界中，植物器官往往定殖有大量的互惠共生真菌，尤其以根系中的種類最為豐富，主要包括外生菌根真菌（ectomycorrhiza fungi， ECMF）、叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhiza fungi， AMF）和深色有隔內(nèi)生真菌（dark septate endophyte， DSE）等（劉潤(rùn)進(jìn)和王琳， 2018）。共生真菌對(duì)于維護(hù)植物生態(tài)系統(tǒng)的健康發(fā)展發(fā)揮著重要的生態(tài)功能，具有提高植物吸收水分和礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)、促進(jìn)植物生長(zhǎng)、增強(qiáng)植物抗逆的能力，尤其在逆境脅迫下植物恢復(fù)和生態(tài)重建過程中發(fā)揮著積極作用（王思佳等，2018；Zobel et al.， 2024）。菌根真菌通過向外延伸的菌絲網(wǎng)絡(luò)，將根與周圍的土壤連接起來(lái)，擴(kuò)大根系面積，從而促進(jìn)植物吸收、運(yùn)輸水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（Fors et al.， 2023）。DSE 大量存在于干旱、養(yǎng)分貧瘠和重金屬等脅迫環(huán)境中，通過調(diào)整內(nèi)含的超氧化物歧化酶、可溶性蛋白和黑色素等，DSE增強(qiáng)植物對(duì)干旱環(huán)境的適應(yīng)能力，提高植物體抗逆能力（González-Teuber et al.， 2018; Liu amp; Wei， 2019）；在重鎘環(huán)境中，DSE通過調(diào)整植物根的形態(tài)、限制重金屬離子的遷移來(lái)促進(jìn)植物生長(zhǎng)并限制對(duì)宿主的金屬毒性（Chen et al.， 2023）。

已有研究表明，蒙古櫟根系定殖有豐富的共生真菌，其群落結(jié)構(gòu)隨著樹齡的增長(zhǎng)表現(xiàn)出動(dòng)態(tài)變化。通過菌根形態(tài)特征和根尖ITS序列分析的方法，Wang等（2017）從中國(guó)北部太白山、子午嶺、靈空山、東靈山和香山5個(gè)典型蒙古櫟林的外生菌根真菌群落中共鑒定出220種外生菌根真菌，其豐富度與海拔高度和土壤有機(jī)質(zhì)呈正相關(guān)。Wang等（2012）采用分子生物學(xué)方法對(duì)不同樹齡的蒙古櫟外生菌根真菌群落進(jìn)行研究，共鑒定出66種外生菌根真菌，其中51種隸屬于擔(dān)子菌門，15種隸屬于子囊菌門，土生空球菌（Cenococcum geophilum）是優(yōu)勢(shì)真菌，樹齡顯著影響了蒙古櫟外生菌根真菌群落結(jié)構(gòu)。

雖然已有分子生物學(xué)技術(shù)為蒙古櫟共生真菌多樣性特征提供了大量的研究數(shù)據(jù)，但分離純化的菌絲體是解析共生菌與植物互作關(guān)系的前提。目前，蒙古櫟根系可培養(yǎng)共生真菌的多樣性特征還處于未知狀態(tài)。因此，本研究采用根段直接分離法，對(duì)六盤山區(qū)幼齡蒙古櫟根系共生真菌進(jìn)行分離和鑒定，旨在闡明蒙古櫟根系可培養(yǎng)共生真菌的群落結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為進(jìn)一步研究蒙古櫟與共生真菌間的互作機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究地區(qū)概況

六盤山區(qū)總面積90 071 hm2，海拔2 200～2 900 m，年均氣溫5.9 ℃，年均降水676 mm，年均相對(duì)濕度69%，屬暖溫帶半濕潤(rùn)區(qū)的大陸性季風(fēng)氣候（王香亭， 1988）。六盤山區(qū)蒙古櫟主要分布于海拔1 100～1 650 m之間的緩坡和陰坡、半陰坡、半陽(yáng)向溝坡地。

1.2 樣品采集

2022年7—9月，在六盤山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)秋千架景區(qū)，選取3個(gè)50 m × 50 m的蒙古櫟純林作為試驗(yàn)樣地。根據(jù)張婕等（2014）蒙古櫟種群徑級(jí)結(jié)構(gòu)的劃分標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合六盤山蒙古櫟種群的實(shí)際生長(zhǎng)情況，以4個(gè)不同樹齡（1年生、2年生、3年生和4～5年生）的幼齡蒙古櫟作為研究對(duì)象，依據(jù)5點(diǎn)采樣法原則，分別采集不同樹齡蒙古櫟植株的整個(gè)根系各5份，共60份樣品。采樣時(shí)，用鐵鍬除去植株基部周圍的地表覆蓋物，將整個(gè)植株完整挖出并剪下所有根系放入自封袋中，根系周圍保留少量土壤用于保鮮，采集的根樣于冰箱4 ℃冷藏，3 d內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)處理。

1.3 根系共生真菌的分離

在實(shí)驗(yàn)室將根樣置于培養(yǎng)皿內(nèi)，加入清水浸泡，待根樣表面土壤松軟后，用細(xì)小毛刷小心地移除根表面的土壤并剔除雜草等其他植物根系，蒸餾水沖洗根系3～5次。采用根段直接培養(yǎng)法進(jìn)行根系共生真菌分離，分離和純化采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、瓊脂粉16 g·L-1），待培養(yǎng)基常溫冷卻至45 ℃左右，加入終濃度50 mg·L-1氨芐青霉素抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。每份樣品挑取30個(gè)末端2 cm的根系，依據(jù)不同樹齡，采取不同的消毒方法。1年生、2年生的根系，采取2步消毒法，即先將準(zhǔn)備好的根系于70%的酒精中浸泡 2 min，再于0.1%氯化汞中浸泡40 s，每次浸泡后用無(wú)菌水漂洗3次，最后一次漂洗之后用無(wú)菌濾紙吸干水分。3年生、4～5年生的根段，在2步消毒的基礎(chǔ)上，再將根系置于70%的酒精中浸泡1 min，無(wú)菌水漂洗3次后吸干水分。將消毒后的根系切成0.2～0.3 cm的根段， 每個(gè)PDA平板放置4個(gè)根段，每份樣品接根段100個(gè)，生化培養(yǎng)箱25 ℃黑暗培養(yǎng)。菌落純化參照肉斯塔木·艾買提等（2022）的方法，菌落形態(tài)特征描述依據(jù)McLean等（1999）和Johansson（2001）的方法，詳細(xì)記錄菌落顏色、質(zhì)地、外形、是否有分泌物、邊緣顏色及形狀、直徑。分離純化后的所有菌株保藏于北方民族大學(xué)寧夏特殊生境微生物資源開發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的微生物菌種保藏中心。

1.4 根系共生真菌分子鑒定

1.4.1 真菌DNA提取 待純化的菌絲長(zhǎng)滿固體平板后，在無(wú)菌環(huán)境中，使用鐵絲制作成的三角形刮板刮取表面菌絲進(jìn)行收集，稱取菌絲體約0.5 g，按照上海生工 UNIQ-10柱式真菌基因組試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行DNA抽提。

1.4.2 真菌rDNA ITS序列PCR擴(kuò)增 采用真菌通用引物ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進(jìn)行菌落的PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系以50 μL為例：2×Hief PCR Mastr Mix 25 μL，F(xiàn)orward primer 10 μmol·L-1 2.5 μL，Reverse primer 10 μmol·L-1 2.5 μL，Template DNA 2 μL，ddH2O補(bǔ)足50 μL。反應(yīng)條件如表1所示，對(duì)檢測(cè)合格的樣品送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.4.3 ITS序列分析 對(duì)真菌測(cè)序結(jié)果的分析參照李敏奇等（2023）的方法進(jìn)行分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 根系共生真菌數(shù)量統(tǒng)計(jì)分析

幼齡蒙古櫟根系不同共生真菌的分離數(shù)量采用分離頻率分析。分離頻率（%）=（分離的某種共生真菌的菌株數(shù)/分離的總菌株數(shù)）×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 根系共生真菌菌落特征觀察

從幼齡蒙古櫟根系中共分離純化得到249株真菌，依據(jù)菌落形態(tài)特征分為18個(gè)類型（圖1，表2）。菌落多為圓形，少數(shù)是橢圓形，顏色有白色、黃白色、灰色、灰黑色、棕黃色、黑色等，大部分菌落不產(chǎn)色素，不同菌落類型生長(zhǎng)速度差異較大， 多數(shù)生長(zhǎng)緩慢。其中，T5、T12、T15、T16菌落質(zhì)地為薄蠟狀，其余為絨氈狀；T1、T4、T5、T11的菌落邊緣為白色，T6菌落邊緣為乳白色，T18的菌落邊緣為黑色，T16菌落邊緣為深灰色；T11菌落上有棕褐色水滴狀分泌物，T12、T15菌落上有透明水滴狀分泌物，T8菌落上有淡黃色水滴狀分泌物，T3、T18菌落分泌物呈黑褐色水滴狀；T2、T14、T16生長(zhǎng)最快，純化30 d后菌落直徑分別為7.3～7.5 cm、7.2～7.5 cm、7.1～7.5 cm；T1和T10生長(zhǎng)最慢，純化30 d后菌落直徑分別是2.2～2.5 cm和2.5～2.6 cm。

2.2 分子鑒定結(jié)果

對(duì)分離獲得的249個(gè)菌株的rDNA ITS片段進(jìn)行拼接和質(zhì)控，GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)得到數(shù)據(jù)庫(kù)中的同源序列相似度為87.01%～100%（表3）。根據(jù)菌落形態(tài)型，從249個(gè)菌落中挑選39個(gè)代表菌株，參考模式菌株序列與同源序列共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），分離的菌株歸屬于2門5綱7目8科15屬18種（表4）。形態(tài)型T1、T2的代表菌株L2、L105聚集在分支Ⅴ上，隸屬于擔(dān)子菌門傘菌綱（Agaricomycetes），其余37個(gè)代表菌株均隸屬于子囊菌門（Ascomycota）。其中，L15、L54、L16、L100、L55、L21共6個(gè)菌株序列聚集在分支Ⅰ上，隸屬于座囊菌綱（Dothideomycetes）；L81、L107、L120、L8、L65、L108、L66、L167、L159、L145、L184、L47共12個(gè)菌株序列聚集在分支Ⅱ上，隸屬于錘舌菌綱（Leotiomycetes）；L176、L151共2個(gè)菌株聚在分支Ⅲ上，隸屬于散囊菌綱（Eurotiomycetes）；L128、L178、L69、L182、L133、L46、L126、L4、L43等共17個(gè)菌株的序列集聚在分支Ⅳ上，隸屬于糞殼菌綱（Sordariomycetes）。

2.3 分離頻率

不同種類的真菌其分離數(shù)量和分離頻率差別較大（表3），其中灰粉無(wú)柄盤孢菌、托雷斯氏叢赤殼菌、強(qiáng)壯土赤殼菌、北美黑盤菌分離頻率最高，依次為81.93%、4.02%、2.01%、2.01%。無(wú)柄盤孢菌屬（Pezicula）菌株是分離頻率最高的優(yōu)勢(shì)屬（81.93%），在蒙古櫟各個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段中均為優(yōu)勢(shì)屬。

蒙古櫟不同樹齡的根系可培養(yǎng)共生真菌數(shù)量和分離頻率明顯不同（表5）。從蒙古櫟1年生植株分離得到共生真菌15株，分離頻率為6.02%；從2年生植株分離得到49株，分離頻率為19.68%；從3年生植株分離得到73株，分離頻率為29.32%；從4～5年生植株分離得到112株，分離頻率為44.98%。

3 討論

研究結(jié)果表明，幼齡蒙古櫟根系可培養(yǎng)共生真菌種類豐富，以子囊菌為優(yōu)勢(shì)類群。前人采用分子生物學(xué)方法研究發(fā)現(xiàn)蒙古櫟根系共生真菌的優(yōu)勢(shì)類群是以擔(dān)子菌為代表的外生菌根真菌，本研究是在方法和結(jié)果上對(duì)已有研究的重要補(bǔ)充，完善了蒙古櫟根系共生真菌物種多樣性特征，為共生真菌與植物間的共生互作機(jī)制研究提供了基礎(chǔ)，也為后期真菌在蒙古櫟育苗、造林和生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)等被運(yùn)用提供了科學(xué)依據(jù)。

不同生長(zhǎng)階段的蒙古櫟根系分離獲得的共生真菌數(shù)量和分離頻率具有顯著差異，植株生長(zhǎng)年限越長(zhǎng)，根系定植的共生真菌種類和數(shù)量越多。共生真菌的群落結(jié)構(gòu)隨著植物的生長(zhǎng)出現(xiàn)動(dòng)態(tài)的變化，但在不同的研究中表現(xiàn)出了不同的變化特征。肉斯塔木·艾買提等（2022）從不同樹齡的青海云杉根系分離得到的共生真菌的種類和數(shù)量差異較大，其中幼樹階段分離頻率最高，幼苗階段次之，成樹階段最低；鄭叔召等（2022）對(duì)1～5年生的毛竹莖稈內(nèi)生真菌多樣性進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，3年生毛竹的內(nèi)生真菌多樣性最高，4年生最低，竹齡會(huì)顯著改變內(nèi)生真菌群落組成；樹蓼成樹菌根真菌的多樣性和豐度都明顯高于幼苗（Séne et al.， 2016），但墨西哥楓的幼苗和成樹之間的外生菌根群落結(jié)構(gòu)并沒有明顯差異（Corrales et al.， 2016）。共生真菌群落動(dòng)態(tài)受到植被類型、植物器官和土壤等不同條件的共同制約，探討其變化特征時(shí)需要綜合考慮多種生態(tài)因子的影響去揭示其變化規(guī)律。

本研究首次在蒙古櫟根系中分離出無(wú)柄盤孢菌屬真菌且該屬真菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位。Zheng和Zhuang（2022）通過對(duì)分離得到的無(wú)柄盤孢菌屬的211個(gè)菌株進(jìn)行分離鑒定和統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)約有1/3的菌株是從裸子植物（如松樹、云杉、落葉松和冷杉）中分離出來(lái)，而在被子植物中的分離頻率較低。本文研究發(fā)現(xiàn)，蒙古櫟根系中定殖有大量的無(wú)柄盤孢菌屬菌株，說(shuō)明該屬真菌的宿主植物范圍比已知的更為廣泛。雖然無(wú)柄盤孢菌普遍定植于植物的不同器官，但從根系中分離出的頻率最高（Yuan amp; Verkley， 2015; Ma et al.， 2021）。

無(wú)柄盤孢菌具有顯著的生物防治和抑菌能力，產(chǎn)生的多種活性物質(zhì)如棘球菌素，具有保護(hù)植物不受病原真菌侵害的功能，而其本身由于獨(dú)特的自抗性遺傳機(jī)制而不受殺菌劑的影響（Yue et al.， 2018; Xu et al.， 2019）。無(wú)柄盤孢菌屬真菌產(chǎn)生的多種抗生素相互作用，合成揮發(fā)性化合物，降低植物病原真菌菌核病和大斑病菌的發(fā)病率，并抑制這兩種病菌的發(fā)育（Zhang et al.， 2018）。Wang等（2014）對(duì)連翹中分離得到的無(wú)柄盤孢菌屬真菌進(jìn)行體外抗菌實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)灰霉病菌和黃萎病具有很強(qiáng)的抑制作用。我們推測(cè)蒙古櫟作為西北地區(qū)的主要建群種，根系大量定殖的無(wú)柄盤孢菌可能對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育及抵抗病蟲侵害方面存在積極影響。

4 結(jié)論

幼齡蒙古櫟根系可培養(yǎng)共生真菌豐富，以子囊菌為優(yōu)勢(shì)類群；1年生蒙古櫟根系可培養(yǎng)共生真菌分離頻率最低（6.02%），4～5年生植株分離頻率最高（44.98%），真菌物種和數(shù)量隨樹齡增長(zhǎng)呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)；灰粉無(wú)柄盤孢菌是幼齡蒙古櫟根系中分離頻率最高的優(yōu)勢(shì)種（81.93%），作為六盤山幼齡蒙古櫟根系可培養(yǎng)共生真菌的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)類群，其與蒙古櫟互作關(guān)系值得進(jìn)一步分析研究。

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（責(zé)任編輯 周翠鳴）