?60Co-γ輻照處理對冬瓜種子影響初探?

摘要：為豐富冬瓜種質(zhì)資源，研究利用0、300、600、900 Gy劑量的60Co-γ射線對冬瓜干種子和提前浸泡12 h的濕種子進(jìn)行輻射誘變，處理后進(jìn)行催芽及播種，考察輻照處理對種子萌發(fā)及幼苗光合性能、抗氧化酶活等的影響。結(jié)果表明：中低輻射劑量可以促進(jìn)干、濕種子的早期萌發(fā)，且300 Gy輻射劑量的促進(jìn)效果最佳；輻照處理對種子芽的伸長和不定根的發(fā)育呈現(xiàn)出明顯的抑制效果；輻照處理會導(dǎo)致冬瓜幼苗真葉出現(xiàn)畸形，且其葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)、光合參數(shù)、過氧化物酶酶活和丙二醛含量與未經(jīng)輻照處理的葉片差異顯著。該研究初步獲得了冬瓜輻照處理的可行劑量和誘變子代，為后續(xù)冬瓜的輻射誘變劑量選擇提供參考。

關(guān)鍵詞：冬瓜種子；輻射誘變；種質(zhì)資源；性狀調(diào)查

中圖分類號：S642.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-060X（2024）07-0001-06

Effect of 60Co-γ Radiation on Seeds of Wax Gourd

MI Bao-bin1，LIU Dan1，XU Yuan-fang2，XIAO Wei1，XIE Ling-ling1

（1. Hunan Vegetable Research Institute， Changsha 410125， PRC; 2. Hunan Institute of Nuclear Agricultural Science and Space Mutation Breeding， Changsha 410125， PRC）

Abstract： To broaden the germplasm resources of wax gourd， we created new germplasm using 60Co-γ irradiation. The dry seeds and the seeds soaked for 12 h were irradiated with 60Co-γ at 0， 300， 600， and 900 Gy， respectively. The germinated seeds were sown， and the effects of irradiation on the germination of seeds and the photosynthetic performance and antioxidant enzyme activities of the seedlings were investigated. The results showed that low - and medium-dose irradiation promoted seed germination， and the irradiation at 300 Gy demonstrated the strongest promoting effect. Irradiation inhibited the bud growth and adventive root development. Irradiation treatments induced leaf deformity of the seedlings. Moreover， the leaf cell structure， photosynthetic parameters， peroxidase activity， and malondiadehyde content showed significant differences between irradiation treatments and the control. This study determined the optimal dose of irradiation for inducing mutagenesis and obtained the M1 generation， providing a reference for subsequent large-scale mutagenesis of wax gourd.

Key words： seeds of wax gourd; irradiation-induced mutagenesis; germplasm resources; trait investigation

引用格式：弭寶彬，劉丹，徐遠(yuǎn)芳，等. 60Co-γ輻照處理對冬瓜種子影響初探[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024（7）：1-6.

DOI：10.16498/j.cnki.hnnykx.2024.007.001

收稿日期：2024-05-28

基金項(xiàng)目：湖南省創(chuàng)新型省份建設(shè)專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)（2021NK1006）；湖南省科技人才支持項(xiàng)目（2022TJ-N15）；湖南省自然科學(xué)基金（2022JJ

30348）

作者簡介：弭寶彬（1987—），男，山東德州市人，副研究員，主要從事蔬菜遺傳育種及產(chǎn)業(yè)化研究。

通信作者：謝玲玲

冬瓜（Benincasa hispida Cogn.）是葫蘆科的重要蔬菜作物[1]，栽培歷史悠久[2]，現(xiàn)已成為中國的主要蔬菜品種之一[3-4]。中國是冬瓜的起源地之一，擁有較豐富的種質(zhì)資源，但隨著人工馴化的發(fā)展，冬瓜種質(zhì)遺傳背景越來越狹窄，綜合性狀優(yōu)異或某些性狀突出的種質(zhì)資源日漸匱乏。相較于黃瓜、西瓜、甜瓜等其他葫蘆科作物，冬瓜基因組的DNA含量最大且更接近原始基因組，因此冬瓜進(jìn)化地位比較特殊[5]，導(dǎo)致目前冬瓜種質(zhì)創(chuàng)新難度大。人工誘變是現(xiàn)階段常用的提高誘變率、實(shí)現(xiàn)遺傳改良的有效方法之一[6-7]。常見的誘變方式有物理誘變、化學(xué)誘變和生物誘變[8]。物理誘變因素主要有X射線、γ射線、紫外線和離子束等[9]，化學(xué)誘變因素主要有甲基磺酸乙酯、乙烯亞胺、疊氮化鈉和堿基類似物等[10]，生物誘變則主要是利用微生物、植物或動物體內(nèi)的生物活性物質(zhì)來誘發(fā)基因變異，通常涉及到基因重組、轉(zhuǎn)座子活動等生物學(xué)機(jī)制。

輻射誘變是利用各種高能射線使生物體遺傳物質(zhì)產(chǎn)生突變的一種物理誘變方法[11]。通過輻射誘發(fā)基因組變異，對變異株進(jìn)行篩選，從而獲得符合目標(biāo)性狀的種質(zhì)資源，可以實(shí)現(xiàn)對農(nóng)作物性狀的改良[12]。

目前，輻射誘變技術(shù)已廣泛應(yīng)用于高粱[13]、水稻[14-15]、玉米等作物的遺傳改良，并取得了顯著成果[16]。

研究團(tuán)隊(duì)前期通過甲基磺酸乙酯開展了冬瓜遺傳誘變工作，獲得了一系列的變異植株[17]，但甲基磺酸乙酯主要造成等位基因點(diǎn)突變[18]，且突變大多數(shù)是有害突變，生產(chǎn)上可用的有利突變資源較少。60Co-γ是目前最常用的輻射源，具有穿透力強(qiáng)、突變率高、變異譜大和成本低等優(yōu)勢[7]。該研究選擇60Co-γ對冬瓜干種子和提前浸泡12 h的濕種子進(jìn)行輻照處理，調(diào)查不同輻射劑量處理后種子的活力以及幼苗的光合參數(shù)、酶活性等指標(biāo)，以期為后續(xù)通過輻射誘變對冬瓜進(jìn)行遺傳改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

冬瓜種子為湖南省蔬菜研究所提供的優(yōu)良自交系，光籽，千粒重50.6～51.5 g。將正常的干種子和清水浸泡12 h的濕種子裝入紗網(wǎng)袋進(jìn)行輻照處理。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

60Co-γ輻照處理在湖南核農(nóng)學(xué)與航天育種研究所瀏陽輻照基地進(jìn)行。分別隨機(jī)選取50粒飽滿冬瓜種子進(jìn)行輻照，輻射劑量為0、300、600、900 Gy，每個處理設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，試驗(yàn)安排見表1。

1.3 性狀測定及統(tǒng)計(jì)

輻照結(jié)束后將種子置于32℃溫箱催芽，催芽3 d后統(tǒng)計(jì)出芽率；11 d催芽結(jié)束后用游標(biāo)卡尺測定芽長。將發(fā)芽后的種子及時播種至育苗穴盤，播種20 d后統(tǒng)計(jì)成苗率。根據(jù)公式（1）～（4）分別計(jì)算發(fā)芽率、成苗率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)（GI）。

發(fā)芽率=發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù)×100% " （1）

成苗率=成苗種子數(shù)/發(fā)芽種子數(shù)×100%" "（2）

發(fā)芽勢=3 d內(nèi)的發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù)×100%

（3）

發(fā)芽指數(shù)=（4）

式（4）中Dt為發(fā)芽天數(shù)，Gt表示對應(yīng)天數(shù)的發(fā)芽種子數(shù)。

用FluorPen手持式葉綠素?zé)晒鈨x對真葉進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈾z測；使用南京建成生物工程研究所有限公司試劑盒測定真葉中過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）的酶活和丙二醛（MDA）含量；使用蒽酮比色法測定可溶性糖含量；使用奧林巴斯BX43顯微鏡觀察真葉表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

使用Excel 2010、Origin 2022軟件整理數(shù)據(jù)和制圖，使用DPS 9.5軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同輻射劑量對冬瓜干、濕種子萌發(fā)的影響

2.1.1 發(fā)芽率 如圖1所示，對于冬瓜干種子，輻照處理可顯著提高種子的發(fā)芽率，7 d時發(fā)芽率均超過60%，而未輻照處理的種子發(fā)芽率僅為24%；其中輻射劑量為300 Gy時促進(jìn)效果最明顯。然而，對于最終發(fā)芽率，900 Gy輻射劑量下發(fā)芽率略低于其他處理，但各輻射劑量處理間差異并不顯著。對于浸泡12 h的濕種子，300和600 Gy輻射劑量下種子發(fā)芽率高于未經(jīng)輻照處理，而900 Gy輻照處理4 d后的發(fā)芽率低于未經(jīng)輻照處理；且處理結(jié)束時，各處理下濕種子的最大芽率僅為64.7%，遠(yuǎn)低于干種子。總體而言，中低輻射劑量有利于促進(jìn)干、濕種子的早期萌發(fā)且300 Gy輻射劑量下促進(jìn)效果最佳；60Co-γ輻射對干種子萌發(fā)的促進(jìn)效果更顯著。對不同輻射劑量和種子處理方式下的發(fā)芽率進(jìn)行擬合，各處理的種子發(fā)芽率模型方程如表2所示。

2.1.2 發(fā)芽指數(shù) 不同輻射劑量和處理方式對種子發(fā)芽指數(shù)的影響如圖2所示，輻照處理可顯著提高早期發(fā)芽指數(shù)，但最終發(fā)芽指數(shù)差異不明顯；且干、濕種子在300 Gy輻射劑量下發(fā)芽指數(shù)提升更明顯。

2.1.3 芽長 中低劑量的輻射對冬瓜種子的萌發(fā)具有促進(jìn)作用，但如圖3和圖4（a）所示，其對種子芽的伸長和不定根的發(fā)育卻呈現(xiàn)出明顯的抑制效應(yīng)；且隨著輻射劑量的增加，這種抑制效應(yīng)逐漸加強(qiáng)。相對干種子而言，低劑量輻射對提前浸種12 h處理的濕種子芽伸長的抑制效果更強(qiáng)。在0和300 Gy輻射劑量下，干種子與濕種子的芽長存在顯著差異，而在600和900 Gy輻射劑量下干種子與濕種子的芽長則無顯著差異。

2.1.4 發(fā)芽勢 如圖4（b）所示，輻照處理能夠提高種子的發(fā)芽勢。對于干種子，輻射劑量與發(fā)芽勢呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系；而對于濕種子，隨著輻射劑量的增大，其發(fā)芽勢先升高后降低。

2.1.5 成苗率 該研究中只有處理CK1、A1、CK2最終成苗，其余處理雖然種子可以正常發(fā)芽，但播種后根系出現(xiàn)褐化萎蔫，導(dǎo)致不能形成幼苗。如圖5所示，CK1、A1、CK2這3個處理的成苗率沒有顯著差異；而干、濕種子在600和900 Gy輻照處理下均未能獲得正常幼苗，表明輻射劑量過高，超過了該品種冬瓜種子所能承受的劑量，不適用于該冬瓜的誘變種質(zhì)創(chuàng)制。

2.2 低劑量輻射處理冬瓜干種子后幼苗表型的變化

對比CK1和A1處理冬瓜苗的表型發(fā)現(xiàn)，輻照處

理導(dǎo)致冬瓜苗真葉出現(xiàn)了嚴(yán)重的畸形（圖6）。這些畸形特征包括葉形不規(guī)整、葉緣刻裂加深以及葉面積減小等。觀察其表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)CK1與A1存在明顯差異。如圖7所示，CK1葉片的表皮細(xì)胞呈

現(xiàn)相互間嵌套、結(jié)構(gòu)緊密的特征，而300 Gy輻照處理（A1）葉片的表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)則表現(xiàn)出氣孔開度明顯變小的特征。此外，與CK1相比，A1處理的葉綠體數(shù)量顯著減少，推測其光合產(chǎn)物可能受到影響。

2.3 低劑量輻射處理冬瓜干種子后幼苗真葉生理生化指標(biāo)的變化

葉綠素?zé)晒鈨x中OJIP和NPQ3是用于研究光合作用的參數(shù)。OJIP代表光合作用的快速轉(zhuǎn)變過程中葉綠素?zé)晒獾男盘?，NPQ3是非光化學(xué)淬滅的一種形式，用于評估植物在光合作用過程中對光能的利用效率。由圖8（a）可知，A1的葉綠素光化學(xué)效率比CK1低，表明其可能在光合作用過程中受到一定程度的限制，而CK1可能具有更強(qiáng)的光合作用保護(hù)機(jī)制，在處理時間內(nèi)能夠保持較高的光能利用水平。由圖8（b）可知，CK1的葉綠素?zé)晒庑盘柺冀K高于A1，且隨處理時間增加，兩者都呈持續(xù)增加趨勢，表明輻照處理可能降低了葉片的光合作用效率，或使得其抵御光脅迫的能力下降。

過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）在植物細(xì)胞中起抗氧化防御作用。對CK1與A1真葉的CAT、POD、SOD等氧化酶活進(jìn)行測定，由圖9可知，CAT和SOD酶活在不同處理間均無顯著性差異，而POD酶活差異顯著（P＜0.05）。A1的POD酶活顯著高于CK1，表明A1受到輻射脅迫從而提高了抗氧化能力。

對CK1與A1真葉的可溶性糖和丙二醛（MDA）含量進(jìn)行測定，由圖10可知，CK1與A1真葉在可溶性糖含量上無顯著性差異，而A1的丙二醛含量顯著

高于CK1，表明輻射對真葉細(xì)胞造成了一定的損傷。

3 討論與結(jié)論

60Co-γ射線對不同作物的影響取決于輻射劑量和作物的敏感程度[13]。一般來說，輻射劑量越高，對

作物的影響越大[19-20]。此外，輻照處理的部位也會影響作物的生長和發(fā)育，一般選擇種子、花粉、幼胚、

枝條等不同組織或部位[19]。研究表明，中低劑量的輻射能夠促進(jìn)種子的早期萌發(fā)，但對幼苗生長和發(fā)育可能產(chǎn)生抑制作用。300 Gy的輻射劑量處理在促進(jìn)早期萌發(fā)方面表現(xiàn)出良好效果，且輻照處理后植株的真葉形態(tài)異常，表明300 Gy劑量足夠引起該品種冬瓜種子的變異。在生理生化水平上，輻照處理可能影響了冬瓜葉片的光合性能和抗氧化能力，從而影響其生長發(fā)育過程，但具體變異類型或者變異的遺傳穩(wěn)定性需要后續(xù)繼續(xù)觀察。

該研究中600和900 Gy輻射劑量可能超出了該品種種子所能承受的范圍，導(dǎo)致幼苗發(fā)育受阻，后期研究可縮小輻射劑量梯度，將其設(shè)置在0～300 Gy。提前浸種能促進(jìn)冬瓜種子的早期萌發(fā)，但會降低其對輻射的耐受度，因此試驗(yàn)中浸泡12 h的濕種子在輻照處理下均未能獲得幼苗，表明對于濕種子而言，目前處理輻射劑量過高，后續(xù)如果需要探索浸泡過的冬瓜種子的最佳輻射劑量，最高劑量最好不超過300 Gy。下一步可以繼續(xù)探究輻照處理誘導(dǎo)冬瓜種子遺傳變異的規(guī)律及其對性狀的影響機(jī)制，為冬瓜育種提供更多的遺傳變異種質(zhì)資源。

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（責(zé)任編輯：王婷）