蜂斗菜素調(diào)控circSETDB1/miR-345-5p對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

〔摘要〕 目的 本研究旨在評(píng)估蜂斗菜素對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞系2（hepatocellular carcinoma cell line 2， HepG2）的抗腫瘤活性，并探討蜂斗菜素通過調(diào)控環(huán)狀SET結(jié)構(gòu)域蛋白1（circular RNA SET domain bifurcated histone lysine methyltransferase 1， circSETDB1）和微小RNA-345-5p（microRNA-345-5p， miR-345-5p）的mRNA表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響。方法 將HepG2細(xì)胞分為多個(gè)處理組。對(duì)照組不做任何處理；蜂斗菜素處理包括蜂斗菜素L組（25 mol/L）、蜂斗菜素M組（50 mol/L）、蜂斗菜素H組（100 mol/L）、蜂斗菜素組（100 mol/L）；siRNA干擾包含環(huán)狀SET結(jié)構(gòu)域蛋白1小干擾RNA（small interfering RNA targeting circular SET domain bifurcated histone lysine methyltransferase 1，si-circSETDB1）組、小干擾RNA陰性對(duì)照（small interfering RNA negative control， si-NC）組；過表達(dá)環(huán)狀SET結(jié)構(gòu)域蛋白1過表達(dá)質(zhì)粒（overexpression vector for circular SET domain bifurcated histone lysine methyltransferase 1， pcDNA-circSETDB1）組和蜂斗菜素+pcDNA-circSETDB1組。采用qRT-PCR檢測(cè)肝癌組織及癌旁組織的circSETDB1和miR-345-5p的mRNA表達(dá)水平；CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖活性；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；Western blot檢測(cè)半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3（cleaved cysteinyl aspartate-specific proteinase-3， Cleaved-Caspase-3）蛋白表達(dá)水平；克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞集落形成；劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)細(xì)胞愈合率和遷移；雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證circSETDB1與miR-345-5p的靶向關(guān)系。結(jié)果 與癌旁組織相比，肝癌組織中circSETDB1 mRNA表達(dá)升高（Plt;0.05），miR-345-5p mRNA表達(dá)降低（Plt;0.05）。與對(duì)照組相比，蜂斗菜素各劑量組HepG2細(xì)胞的細(xì)胞活性、集落形成數(shù)降低（Plt;0.05），細(xì)胞凋亡率和Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)升高（Plt;0.05），且呈劑量依賴性（Plt;0.05）。與si-NC組相比，si-circSETDB1組HepG2細(xì)胞的circSETDB1表達(dá)、細(xì)胞活性、集落形成數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)和劃痕愈合率降低（Plt;0.05），miR-345-5p表達(dá)、細(xì)胞凋亡率和Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)升高（Plt;0.05）。與蜂斗菜素組相比，蜂斗菜素+pcDNA-circSETDB1組HepG2細(xì)胞中circSETDB1表達(dá)、細(xì)胞活性、集落形成數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)和劃痕愈合率升高（Plt;0.05），miR-345-5p表達(dá)、細(xì)胞凋亡率和Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)降低（Plt;0.05）。結(jié)論 蜂斗菜素可抑制肝癌細(xì)胞HepG2增殖和遷移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制circSETDB1表達(dá)而上調(diào)miR-345-5p表達(dá)有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 蜂斗菜素；肝癌；circSETDB1；miR-345-5p；細(xì)胞增殖；凋亡；遷移

〔中圖分類號(hào)〕R285.5" " " " "〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A" " " " " 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.11.011

Effects of petasin on the biological behaviors of hepatocellular carcinoma cells by regulating circSETDB1/miR-345-5p

WANG Duan1*， ZHOU Li2

1. Department of Pharmacy， Northwest University First Hospital， Xi'an， Shanxi 710043， China; 2. Pharmaceutical Science Research Laboratory， Hebei University of Chinese Medicine， Shijiazhuang， Hebei 050200， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To evaluate the anti-tumor activity of petasin on hepatocellular carcinoma cell line 2 （HepG2） and to investigate its effects on cell proliferation， apoptosis， and migration by regulating the mRNA expressions of circular RNA SET domain bifurcated histone lysine methyltransferase 1 （circSETDB1） and microRNA-345-5p （miR-345-5p）. Methods Except for control group which received no treatment， HepG2 cells were additionally divided into multiple treatment groups， including petasin L （25 μmol/L）， petasin M （50 μmol/L）， and petasin H （100 μmol/L） groups， as well as small interfering RNA targeting circular SET domain bifurcated histone lysine methyltransferase 1 （si-circSETDB1） group， small interfering RNA negative control （si-NC） group， overexp？鄄ression vector for circular SET domain bifurcated histone lysine methyltransferase 1 （pcDNA-circSETDB1） group， petasin+pcDNA-circSETDB1 group， and petasin group （100 μmol/L）. The mRNA expression levels of circSETDB1 and miR-345-5p in hepatic cancerous tissues and paracancerous tissues were measured by qRT-PCR. Cell proliferation activity was measured using CCK-8， and apoptosis was assessed by flow cytometry. The protein expression level of cleaved cysteinyl aspartate-specific proteinase-3 （Cleaved-Caspase-3） was determined by Western blot. Cell colony formation was assessed using the clone formation assay. Cell wound healing rate and migration were checked by wound healing assay and Transwell assay， respectively. A dual-luciferase reporter assay was performed to validate the targeting relationship between circSETDB1 and miR-345-5p. Results Compared with paracancerous tissues， the circSETDB1 mRNA expression was higher （Plt;0.05） while miR-345-5p mRNA expression was lower （Plt;0.05） in hepatic cancerous tissues. Compared with control group， the cell viability and number of colonies of HepG2 cells in the petasin L， M， and H groups were lower， while the apoptosis rate and Cleaved-Caspase-3 protein expression were higher （Plt;0.05）， in a dose-dependent manner （Plt;0.05）. Compared with si-NC group， the circSETDB1 expression， cell viability， number of cell colonies and migrated cells， and wound healing rate were lower （Plt;0.05）， while the miR-345-5p expression， apoptosis rate， and Cleaved-Caspase-3 protein expression were higher in the si-circSETDB1 group of HepG2 cells （Plt;0.05）. Compared with petasin group， the circSETDB1 expression， cell viability， number of cell colonies and migrated cells， and wound healing rate were higher （Plt;0.05）， while the miR-345-5p expression， apoptosis rate， and Cleaved-Caspase-3 protein expression were lower in the petasin+pcDNA-circSETDB1 group of HepG2 cells （Plt;0.05）. Conclusion Petasin can inhibit the proliferation and migration of HepG2 cells and induce the apoptosis， possibly by downregulating circSETDB1 expression and upregulating miR-345-5p expression.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 petasins; hepatocellular carcinoma; circular RNA SET domain bifurcated histone lysine methyltransferase 1; microRNA-345-5p; cell proliferation; apoptosis; migration

肝癌病情嚴(yán)重且預(yù)后極差，極大程度影響患者的生存質(zhì)量[1]。目前，肝癌的治療手段包括根治性手術(shù)、放化療及靶向藥物治療[2]。然而，肝癌細(xì)胞對(duì)化學(xué)藥物治療的敏感性極低，可能導(dǎo)致患者出現(xiàn)原發(fā)性耐藥。因此，探索高效且安全的新藥物對(duì)改善肝癌預(yù)后具有重要意義[3]。蜂斗菜素主要來源于蜂斗菜屬植物掌葉蜂斗菜（Petasites tatewakianus）和毛裂蜂斗菜（Petasites tricholobus）。蜂斗菜具有清熱解毒、活血化瘀的功效，其根莖提取物常用于治療偏頭痛、哮喘、變應(yīng)性鼻炎等疾病[4]?，F(xiàn)代研究表明，蜂斗菜素具有抗炎、抗腫瘤和抗過敏等生物活性，蜂斗菜素可能通過促進(jìn)細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)及抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinases 1/2，ERK1/2）磷酸化水平，從而抑制胃癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程及誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡[5]。蜂斗菜素可通過抑制蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（protein kinase B/mammalian target of rapamycin，Akt/mTOR）信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為[6]。目前，蜂斗菜素對(duì)肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為的影響尚未明確。

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）和微小RNA（microRNA，miRNA）可靶向結(jié)合靶基因后抑制表達(dá)而影響靶基因功能，可調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、物質(zhì)代謝等多種生理反應(yīng)，在惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色[7-8]。環(huán)狀SET結(jié)構(gòu)域蛋白1（circular RNA SET domain bifurcated histone lysine methyltransferase 1，circSETDB1）是由1號(hào)染色體上的組蛋白賴氨酸N端甲基轉(zhuǎn)移酶SET結(jié)構(gòu)域分支型1（SET domain bifurcated histone lysine methyltransferase 1，SETDB1）形成的閉合環(huán)狀RNA，與多種惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。研究表明，肺腺癌患者血清circSETDB1含量升高，血清circSETDB1含量與疾病發(fā)展階段密切相關(guān)；低氧誘導(dǎo)的肺腺癌細(xì)胞外泌體中circSETDB1表達(dá)上調(diào)，敲低circSETDB1可抑制肺腺癌細(xì)胞的惡性表型，這可能與circSETDB1競(jìng)爭(zhēng)性吸附微小RNA-7（microRNA-7，miR-7）并正向調(diào)控特異性蛋白1（specificity protein 1，Sp1）表達(dá)有關(guān)[9]。目前，circSETDB1對(duì)肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響尚未明確。研究顯示，下調(diào)微小RNA-345-5p（microRNA-345-5p， miR-345-5p）的mRNA表達(dá)可以增強(qiáng)肝癌細(xì)胞生長、侵襲和遷移能力，并抑制肝癌細(xì)胞凋亡和自噬[10]。半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（cleaved cysteinyl aspartate-specific proteinase， Cleaved-Caspase-3）是細(xì)胞凋亡過程中關(guān)鍵的執(zhí)行酶之一，其激活標(biāo)志著細(xì)胞凋亡的發(fā)生[11]。研究發(fā)現(xiàn)，敲低胚胎發(fā)育相關(guān)基因2（engrailed homeobox 2，EN2）后，肝癌細(xì)胞的Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9蛋白水平顯著升高，伴隨細(xì)胞凋亡率的增加[12]。

因此，本研究旨在探討蜂斗菜素對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的增殖、凋亡和遷移的影響，進(jìn)一步研究其是否通過調(diào)控circSETDB1和miR-345-5p的表達(dá)發(fā)揮作用。通過系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)為蜂斗菜素作為肝癌治療的潛在藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1" 一般資料

選擇2020年1月至2022年1月收治于西北大學(xué)第一醫(yī)院的57例原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者為研究對(duì)象，樣本分為肝癌組織組和癌旁組織組。其中肝癌組織組57例（男性30例、女性27例；年齡48.6±7.2歲；Ⅰ～Ⅱ期36例，Ⅲ～Ⅳ期21例）；癌旁組織組57例（每例患者手術(shù)或病理過程中獲取的與肝癌組織配對(duì)的相鄰正常肝組織）。兩組樣本一般臨床資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05），具有可比性。本研究經(jīng)西北大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：LLSNCH20190024）。

1.2" 主要試劑

肝細(xì)胞癌細(xì)胞系2（hepatocellular carcinoma cell line 2， HepG2）（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號(hào)：2019023）；蜂斗菜素（陜西斯諾特生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：2018456）；CCK-8試劑盒、雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒（武漢科鹿生物科技有限責(zé)任公司，批號(hào)：2020115、2020121）；LipofectamineTM 2000試劑盒（武漢回盛生物科技股份有限公司，批號(hào)：2020231）；SYBR GreenER qPCR SuperMix通用試劑盒（賽默飛世爾科技公司，批號(hào)：A1158-C）；Cleaved-Caspase-3抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase primer，GAPDH）（武漢基因美生物科技有限公司，批號(hào)：2021344、2021045）。

1.3" 主要儀器

PCR儀器（美國ABI公司，型號(hào)：HT9700）；Transwell小室（武漢艾美捷公司，型號(hào)：AMJ-TW-24）；流式細(xì)胞儀（美國BD公司，型號(hào)：FACSCanto Ⅱ）；分光光度計(jì)（美國安捷倫公司，型號(hào)：Cary 60 UV-Vis）。

2 方法

2.1" circSETDB1和miR-345-5p的mRNA表達(dá)檢測(cè)

采用qRT-PCR檢測(cè)肝癌組織和癌旁組織circSETDB1和miR-345-5p的mRNA表達(dá)。用Trizol試劑提取肝癌組織、癌旁組織和各組細(xì)胞總RNA，用miRcute miRNA提取分離試劑盒提取miRNA。然后用MLV逆轉(zhuǎn)錄酶或miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒從提取的RNA合成cDNA。

qRT-PCR反應(yīng)使用SYBR GreenER qPCR Supe？鄄rMix通用試劑盒，并在PCR儀上進(jìn)行。引物序列：circSETDB1正向引物5'-TCCTGTGAAGCCTGAAGGAC-3'，反向引物5'-TTAGTTGATGGCAGGCACAC-3'，引物長度145 bp；GAPDH正向引物5'-AAAATCAAGTGGGGCGATGC-3'，反向引物5'-GATGACCCTTTTGGCTCCCC-3'，引物長度224 bp；miR-345-5p正向引物5'-TGAGGGGCAGAGAGCGAGACTTT-3'，反向引物5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'，引物長度219 bp；U6小核RNA（U6 small nuclear RNA primer，U6）正向引物5'-ACCCTGAGAAATACCCTCACAT-3'，反向引物5'-GACGACTGAGCCCCTGATG-3'，引物長度187 bp。PCR體系為25 L，總共進(jìn)行28個(gè)循環(huán)，最后一輪延伸8 min。以U6為內(nèi)參，使用2-△△Ct法計(jì)算circSETDB1、miR-345-5p相對(duì)表達(dá)量。

2.2" HepG2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

HepG2細(xì)胞完全培養(yǎng)基成分為10%胎牛血清及90%DMEM。將對(duì)數(shù)生長期HepG2接種并完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑操作說明將環(huán)狀SET結(jié)構(gòu)域蛋白1小干擾RNA（small interfering RNA targeting circular SET domain bifurcated histone lysi？鄄ne methyltransferase 1， si-circSETDB1）、小干擾RNA陰性對(duì)照（small interfering RNA negative control，si-NC）、環(huán)狀SET結(jié)構(gòu)域蛋白1過表達(dá)質(zhì)粒（overexpression vector for circular SET domain bifurcated histone lysine methyltransferase 1，pcDNA-circSETDB1）分別轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染12 h后更換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，qRT-PCR檢測(cè)HepG2細(xì)胞中circSETDB1表達(dá)計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。

2.3" 細(xì)胞分組與處理

HepG2細(xì)胞在未轉(zhuǎn)染的情況下分為對(duì)照組和蜂斗菜素低劑量（L）、中劑量（M）、高劑量（H）組。對(duì)照組僅加入完全培養(yǎng)基，蜂斗菜素L、M、H組細(xì)胞分別用含25、50、100 μmol/L[5]蜂斗菜素的完全培養(yǎng)基處理24 h。

轉(zhuǎn)染si-circSETDB1、si-NC的HepG2細(xì)胞均用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，記為si-circSETDB1組、si-NC組。轉(zhuǎn)染pcDNA-circSETDB1的HepG2細(xì)胞分別用完全培養(yǎng)基或含100 μmol/L蜂斗菜素的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，記為pcDNA-circSETDB1組、蜂斗菜素+pcDNA-circSETDB1組。HepG2細(xì)胞用含100 μmol/L蜂斗菜素的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，記為蜂斗菜素組。

2.4" 細(xì)胞活性檢測(cè)

采用CCK-8試劑檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。將HepG2細(xì)胞按照每孔1×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，接種體積100 μL，接種后培養(yǎng)24 h。每組加入不同濃度的蜂斗菜素或轉(zhuǎn)染特定的siRNA、質(zhì)粒處理24 h。處理完成后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，將培養(yǎng)板置于37 ℃的培養(yǎng)箱中孵育4 h。使用酶標(biāo)儀于450 nm波長下測(cè)量各孔的光密度（optical density，OD）值。OD值越高，細(xì)胞代謝活性越強(qiáng)，細(xì)胞增殖越活躍。

2.5" 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

HepG2細(xì)胞于完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，胰酶消化后4 ℃以1 000 r/min（離心半徑10 cm）離心5 min，收集細(xì)胞。棄上清液并將細(xì)胞重懸，用Annexin

V-FITC和PI室溫下避光孵育10 min，再次重懸細(xì)胞，立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

2.6" Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)檢測(cè)

采用Western blot檢測(cè)Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)。用蛋白提取試劑盒提取各組HepG2細(xì)胞總蛋白，BCA法定量后，取等量蛋白樣品經(jīng)凝膠電泳分離，用硝化纖維素膜進(jìn)行濕轉(zhuǎn)移。在脫脂乳中阻斷后，用Cleaved-Caspase-3、GAPDH一抗（1∶1 000）4 ℃孵育膜過夜，用二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h。用ECL檢測(cè)信號(hào)，以GAPDH為內(nèi)參，采用Image J圖像分析軟件計(jì)算Cleaved-Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.7" 細(xì)胞集落形成檢測(cè)

采用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞集落形成。HepG2細(xì)胞進(jìn)行藥物干預(yù)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，接種至6孔板（1 000個(gè)/孔），每天更換培養(yǎng)基，每2天換液1次，連續(xù)處理14 d后洗滌去掉培養(yǎng)基，采用結(jié)晶紫染色后顯微鏡下觀察，計(jì)算細(xì)胞集落形成數(shù)。

2.8" 細(xì)胞劃痕愈合率檢測(cè)

采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞劃痕愈合率。HepG2細(xì)胞接種在6孔板中（每孔2×105個(gè)細(xì)胞），用藥物干預(yù)或轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。當(dāng)細(xì)胞幾乎達(dá)到100%融合后，使用200 μL移液器槍頭劃線，測(cè)量劃痕間距（記為d0 h），用無血清培養(yǎng)基37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后，再次測(cè)量細(xì)胞間間距（記為d24 h），劃痕愈合率=（d0 h-d24 h）/d0 h×100%。

2.9" 細(xì)胞遷移檢測(cè)

采用Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移數(shù)目。HepG2細(xì)胞于完全培養(yǎng)基中培育24 h后，將1×105個(gè)細(xì)胞懸浮于無血清DMEM培養(yǎng)基中，并加入Transwell小室的上腔。下腔中加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，作為化學(xué)引誘劑。細(xì)胞在37 ℃條件下孵育24 h后，移去上腔未遷移的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定下腔細(xì)胞20 min，并用0.1%結(jié)晶紫染色30 min。在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞。

2.10" 雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

構(gòu)建circSETDB1野生型螢光素酶報(bào)告基因載體（wild-type circSETDB1 luciferase reporter vector， WT-circSETDB1）、circSETDB1突變型螢光素酶報(bào)告基因載體（mutant circSETDB1 luciferase reporter vector， MUT-circSETDB1）。HepG2細(xì)胞分別共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-circSETDB1與miR-345-5p mimics、WT-circSETDB1與微小RNA模擬對(duì)照序列（microRNA mimic negative control，miR-NC）、MUT-circSETDB1與miR-345-5p mimics、MUT-circSETDB1與miR-NC，48 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)螢光素酶活性，判斷circSETDB1與miR-345-5p靶向關(guān)系。

2.11" 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Sigmaplot 12.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以“ｘ±s”表示，符合正態(tài)分布的兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間的比較采用單因素方差分析，并進(jìn)行最小顯著差異法事后檢驗(yàn)。不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。采用Spearman秩相關(guān)系數(shù)分析circSETDB1與miR-345-5p之間的表達(dá)關(guān)系。以Plt;0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1" 肝癌組織和癌旁組織circSETDB1、miR-345-5p的mRNA表達(dá)比較

與癌旁組織組比較，肝癌組織組中circSETDB1 mRNA表達(dá)升高（Plt;0.05），miR-345-5p mRNA表達(dá)降低（Plt;0.05）。詳見表1。

3.2" 蜂斗菜素對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2增殖和凋亡的影響

與對(duì)照組比較，蜂斗菜素各劑量組肝癌細(xì)胞HepG2的細(xì)胞活性和集落形成數(shù)降低（Plt;0.05），細(xì)胞凋亡率和Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)升高（Plt;0.05）。蜂斗菜素L、M、H組肝癌細(xì)胞HepG2的細(xì)胞活性、集落形成數(shù)的降低以及細(xì)胞細(xì)胞凋亡率、Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)的升高呈劑量依賴性（Plt;0.05）。詳見圖1—2、表2。

3.3" 蜂斗菜素對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2遷移能力的影響

與對(duì)照組比較，蜂斗菜素各劑量組的遷移細(xì)胞數(shù)和劃痕愈合率降低（Plt;0.05）。蜂斗菜素L、M、H組肝癌細(xì)胞HepG2的遷移細(xì)胞數(shù)和劃痕愈合率降低呈劑量依賴性（Plt;0.05）。詳見圖3、表3。

3.4" 蜂斗菜素對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2中circSETDB1和miR-345-5p的mRNA表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組比較，蜂斗菜素各劑量組circSETDB1的mRNA表達(dá)水平降低（Plt;0.05），miR-345-5p表達(dá)升高（Plt;0.05）。與蜂斗菜素L、M、H組circSETDB1表達(dá)降低和miR-345-5p mRNA表達(dá)升高呈劑量依賴性（Plt;0.05）。詳見表4。

3.5" 下調(diào)circSETDB1表達(dá)對(duì)HepG2增殖、凋亡和遷移水平的影響

與si-NC組比較，si-circSETDB1組circSETDB1 mRNA表達(dá)、細(xì)胞活性、集落形成數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)和劃痕愈合率降低（Plt;0.05），miR-345-5p mRNA表達(dá)、細(xì)胞凋亡率、Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)升高（Plt;0.05）。詳見圖4—5、表5。

3.6" 上調(diào)circSETDB1表達(dá)對(duì)蜂斗菜素處理的HepG2增殖、凋亡和遷移水平的影響

與對(duì)照組比較，蜂斗菜素組circSETDB1的mRNA表達(dá)、細(xì)胞活性、集落形成數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)和劃痕愈合率降低（Plt;0.05），miR-345-5p mRNA表達(dá)、細(xì)胞凋亡率、Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)升高（Plt;0.05）。與蜂斗菜素組比較，蜂斗菜素+pcDNA-circSETDB1組circSETDB1 mRNA表達(dá)、細(xì)胞活性、集落形成數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)和劃痕愈合率升高（Plt;0.05），miR-345-5p mRNA表達(dá)、細(xì)胞凋亡率、Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)降低（Plt;0.05）。與蜂斗菜素+pcDNA-circSETDB1組比較，pcDNA-circSETDB1組的circSETDB1 mRNA表達(dá)、細(xì)胞活性、集落形成數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)和劃痕愈合率升高（Plt;0.05），miR-345-5p的mRNA表達(dá)、細(xì)胞凋亡率、Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)降低（Plt;0.05）。詳見圖6—7、表6。

3.7" circSETDB1與miR-345-5p的靶向調(diào)控關(guān)系

共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-circSETDB1與miR-345-5p mimics的細(xì)胞螢光素酶活性低于共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-circSETDB1與miR-NC的HepG2細(xì)胞（Plt;0.05），而共轉(zhuǎn)染MUT-circSETDB1、miR-345-5p mimics與共轉(zhuǎn)染MUT-circSETDB1、miR-NC細(xì)胞螢光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。詳見表7。

4 討論

肝癌發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，目前因缺乏高效安全的藥物而導(dǎo)致其療效較差。在中醫(yī)理論中，蜂斗菜具有清熱解毒、活血化瘀的功效。其用于治療因熱毒引發(fā)的疾病，如咳嗽和咽喉腫痛等，能夠有效減輕炎癥反應(yīng)[13]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，血液循環(huán)不暢是多種疾病的根源，蜂斗菜素通過促進(jìn)血液循環(huán)，有助于緩解疼痛并改善相關(guān)癥狀[14]。此外，基于現(xiàn)有的研究推測(cè)，細(xì)胞凋亡與多種基因調(diào)控密切相關(guān)，circSETDB1及miR-345-5p具有調(diào)控細(xì)胞增殖及凋亡功能[15]，蜂斗菜素可能對(duì)肝癌細(xì)胞具有一定的抑制作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌組織中，circSETDB1的平均表達(dá)量高于癌旁組織。相反，miR-345-5p在肝癌組織中的表達(dá)量低于癌旁組織，表明circSETDB1和miR-345-5p在肝癌發(fā)展中呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。Caspase-3受到上游信號(hào)激活后可磷酸化激活產(chǎn)生Cleaved-Caspase-3，激活下游靶基因而產(chǎn)生細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，蜂斗菜素處理可降低HepG2細(xì)胞的OD值，且呈劑量依賴性，說明蜂斗菜素可抑制肝癌細(xì)胞HepG2增殖和遷移，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，其具有治療肝癌的潛在價(jià)值。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，蜂斗菜素可促進(jìn)肝癌細(xì)胞中Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)，推測(cè)蜂斗菜素可能通過促進(jìn)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡并死亡。研究表明，circ102209、circ100084和circHIPK3等多種circRNA在肝癌中異常表達(dá)，參與調(diào)控肝癌細(xì)胞惡性表型，為肝癌的治療提供潛在分子靶點(diǎn)[16-17]。circSETDB1是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種circRNA，其在高級(jí)別漿液性卵巢癌患者血清中表達(dá)上調(diào)，且與患者Figo分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及生存期密切相關(guān)，可作為高級(jí)別漿液性卵巢癌診斷的生物標(biāo)志物[18]。

此外，本研究通過蜂斗菜素對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的作用，進(jìn)一步驗(yàn)證了circSETDB1與miR-345-5p的關(guān)系。結(jié)果表明，蜂斗菜素能夠顯著抑制HepG2細(xì)胞的增殖和遷移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且呈現(xiàn)劑量依賴性。在蜂斗菜素作用下，肝癌細(xì)胞中circSETDB1的表達(dá)顯著降低，而miR-345-5p的表達(dá)顯著升高，表明circSETDB1可能通過調(diào)控miR-345-5p影響肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。通過沉默circSETDB1，本研究進(jìn)一步探討了其在肝癌中的具體作用。結(jié)果顯示，circSETDB1的沉默顯著抑制了HepG2細(xì)胞的增殖和遷移，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，表明circSETDB1可能通過調(diào)控多條信號(hào)通路參與肝癌的發(fā)生發(fā)展。此外，上調(diào)circSETDB1表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)蜂斗菜素對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用，證明circSETDB1在肝癌中具有促癌作用。研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-345-5p表達(dá)可引起動(dòng)力相關(guān)蛋白1的激活，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移[15]，過表達(dá)miR-345-5p可靶向抑制扭轉(zhuǎn)相關(guān)蛋白1的表達(dá)阻礙膽管癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及血管生成，同時(shí)誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞凋亡[19]。甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）組織中的miR-345-5p表達(dá)降低，轉(zhuǎn)染miR-345-5p模擬物的PTC細(xì)胞活力及集落形成能力降低，而凋亡加劇，這與miR-345-5p靶向抑制PTC細(xì)胞中含SET域賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶7（SET domain containing lysine methy？鄄ltransferase 7， SETD7）表達(dá)有關(guān)，miR-345-5p/SETD7軸為PTC的治療提供了潛在分子靶點(diǎn)[20]。研究顯示，miR-345-5p表達(dá)的上調(diào)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，并增強(qiáng)肝癌細(xì)胞放射敏感性[21]。

綜上所述，circSETDB1通過調(diào)控miR-345-5p表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移能力，蜂斗菜素通過調(diào)控該通路展現(xiàn)出良好的抗癌潛力。在未來的臨床治療中，靶向circSETDB1的治療手段可能成為肝癌治療的新方向，因此，進(jìn)一步探討circSETDB1作為肝癌治療靶點(diǎn)的臨床應(yīng)用具有重要意義。

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