肝喜片通過miR200a/ZEB信號通路抑制肝癌細(xì)胞HepG2上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究

〔摘要〕 目的 研究肝喜片通過微小分子RNA200a/E盒結(jié)合鋅指蛋白（microRNA200a/zinc finger E-box binding homeobox， miR200a/ZEB）信號通路抑制肝癌細(xì)胞HepG2上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制。方法 培養(yǎng)肝癌細(xì)胞HepG2，制備肝喜片含藥血清，采用不同濃度（10%、15%、20%）的肝喜片含藥血清作用于HepG2細(xì)胞，同時設(shè)置空白對照組。運用CCK-8實驗檢測HepG2細(xì)胞的增殖，劃痕實驗、Transwell實驗分別檢測HepG2細(xì)胞的橫向遷移和縱向遷移，Western blot檢測ZEB1、ZEB2、E鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）的表達(dá)，RT-PCR檢測miR200a、ZEB1、ZEB2、E-cadherin、Vimentin mRNA的表達(dá)。結(jié)果 與空白對照組比較，肝喜片各劑量組的細(xì)胞存活率顯著降低，且具有明顯的時間和濃度依賴性（P＜0.05，P＜0.01）；肝喜片各劑量組的橫向遷移率及縱向遷移細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.05，P＜0.01）。與空白對照組比較，肝喜片中、高劑量組miR200a表達(dá)升高，肝喜片各劑量組E-cadherin蛋白及中、高劑量組E-cadherin mRNA表達(dá)升高，肝喜片各劑量組Vimentin蛋白及中、高劑量組Vimentin mRNA表達(dá)下降，肝喜片各劑量組ZEB1、ZEB2蛋白及mRNA表達(dá)下降（P＜0.05，P＜0.01）；與肝喜片低劑量組比較，肝喜片中、高劑量組miR200a、E-cadherin蛋白及mRNA表達(dá)升高，Vimentin、ZEB1、ZEB2蛋白及mRNA表達(dá)下降（P＜0.05，P＜0.01）；與肝喜片中劑量組比較，肝喜片高劑量組miR200a、E-cadherin蛋白及mRNA表達(dá)升高，Vimentin、ZEB1、ZEB2蛋白及mRNA表達(dá)下降（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論 肝喜片可顯著抑制肝癌細(xì)胞HepG2的增殖和轉(zhuǎn)移，其機(jī)制與調(diào)控miR200a/ZEB信號通路、促進(jìn)E-hadherin的表達(dá)、抑制Vimentin的表達(dá)、逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 肝癌；肝喜片；微小分子RNA200a；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；E盒結(jié)合鋅指蛋白；E鈣黏蛋白；波形蛋白

〔中圖分類號〕R273；R735" " " " "〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.11.010

Mechanism of Ganxi Pill in inhibiting epithelial-mesenchymal transition of HepG2 cells through miR200a/ZEB signaling pathway

LUO Yan1， TANG Wei1， CHEN Linglong2， ZENG Qian3， ZHANG Xuan3， LUO Ji1*

1. Hunan Provincial Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Changsha， Hunan 410006， China;

2. Hunan Academy of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410013， China; 3. Hunan University of Chinese Medicine，

Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the mechanism by which Ganxi Pill inhibits epithelial-mesenchymal transition （EMT） in HepG2 cells through the microRNA200a/zinc finger E-Box binding homeobox 1 （miR200a/ZEB） signaling pathway. Methods HepG2 cells were cultured and treated with Ganxi Pill-medicated serum at different concentrations （10%， 15%， and 20%）， with a blank control group set up in parallel. The CCK-8 assay was used to assess the proliferation of HepG2 cells， while scratch assay and Transwell assay were conducted to evaluate the horizontal and vertical migration of the cells， respectively. Western blot was employed to check the expressions of ZEB1， ZEB2， E-cadherin， and vimentin. Additionally， RT-PCR was utilized to measure the mRNA expression levels of miR200， ZEB1， ZEB2， E-cadherin， and vimentin. Results Compared with the blank control group， the cell survival rate in all Ganxi Pill groups was significantly reduced， exhibiting clear time- and concentration-dependence （Plt;0.05， Plt;0.01）. The horizontal migration rate and the number of vertically migrating cells significantly decreased in all Ganxi Pill groups （Plt;0.05， Plt;0.01）. Compared with the blank control group， the expression of miR200a increased in the medium- and high-dose Ganxi Pill groups; E-cadherin protein level was elevated in all Ganxi Pill groups， with its mRNA expression increased in the medium- and high-dose groups. Meanwhile， the protein expression of vimentin was reduced across all Ganxi Pill groups， with its mRNA expression decreased in the medium- and high-dose groups. The protein and mRNA expressions of ZEB1 and ZEB2 were reduced in all Ganxi Pill groups （Plt;0.05， Plt;0.01）. Compared with the low-dose group， the medium- and high-dose Ganxi Pill groups exhibited increased protein and mRNA expressions of miR200a and E-cadherin， along with reduced protein and mRNA expressions of vimentin， ZEB1， and ZEB2 （Plt;0.05， Plt;0.01）. Compared with the medium-dose group， the high-dose Ganxi Pill group showed further increases in the protein and mRNA expressions of miR-200a and E-cadherin， while the protein and mRNA expressions of vimentin， ZEB1， and ZEB2 decreased （Plt;0.05， Plt;0.01）. Conclusion Ganxi Pill can significantly inhibit the proliferation and migration of HepG2 cells， and its mechanism might be related to the regulation of the miR200a/ZEB signaling pathway， promotion of the E-hadherin expression， inhibition of the vimentin expression， and reversal of EMT.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 liver cancer; Ganxi Pill; microRNA200a; epithelial-mesenchymal transition; zinc finger E-box binding homeobox; E-cadherin; vimentin

原發(fā)性肝癌是臨床常見的具有高致死率的惡性腫瘤。據(jù)國家癌癥中心最新數(shù)據(jù)顯示，我國每年新增肝癌患者36.77萬，占惡性腫瘤發(fā)病率第四位，死亡人數(shù)31.65萬，占惡性腫瘤死亡率第二位[1]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）是上皮細(xì)胞獲得間充質(zhì)干細(xì)胞表型的過程，其在胚胎形態(tài)發(fā)生、組織纖維化、傷口愈合和腫瘤轉(zhuǎn)移中起著作用；扭轉(zhuǎn)家族bHLH轉(zhuǎn)錄因子（Twist）、E盒結(jié)合鋅指蛋白1（zinc finger E-box binding homeobox 1， ZEB1）、E盒結(jié)合鋅指蛋白2（zinc finger E-box binding homeobox 2， ZEB2）、蝸牛家族轉(zhuǎn)錄抑制因子（snail）等轉(zhuǎn)錄因子可通過調(diào)控細(xì)胞中E鈣黏蛋白（E-cadherin）、N鈣黏蛋白（N-cadherin）等的表達(dá)，在腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2-4]。miR200家族由miR141、miR200a、miR200b、miR200c和miR429組成，在惡性腫瘤中起到抑癌作用。研究表明，miR200家族成員的下調(diào)不僅與E-cadherin的損失顯著相關(guān)，而且可通過靶向作用于ZEB1、ZEB2調(diào)控EMT過程，抑制多種惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[5-6]。肝喜片是由湖南省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院（湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院）腫瘤科創(chuàng)始人、國醫(yī)大師潘敏求牽頭研發(fā)的醫(yī)院制劑，在醫(yī)院已使用30余年，使用量常年居醫(yī)院制劑第一。前期本團(tuán)隊已利用超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)證實，肝喜片在大鼠血清中的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制與戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化、色氨酸代謝和類固醇激素生物合成等代謝途徑調(diào)控有關(guān)，且其水劑（肝喜合劑）體外可有效抑制肝癌細(xì)胞HepG2增殖，通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白X（Bcl-2-associated X protein， Bax）、p53上調(diào)凋亡調(diào)節(jié)因子（p53 upregulated modulator of apoptosis， Puma）、半胱氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）的表達(dá)促進(jìn)凋亡[7-8]。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，從miR200a/ZEB信號通路調(diào)控EMT過程進(jìn)一步探討肝喜片的作用機(jī)制，以期為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1" 細(xì)胞株及實驗動物

人肝癌細(xì)胞株HepG2購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫（目錄編號為：TCHu 72）；SD雄性大鼠10只，體質(zhì)量250～300 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0008。本研究中涉及動物的實驗均經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（審批號：21-2310-30）。

1.2" 藥物

肝喜片購自湖南省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院（湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院）中成藥房，批準(zhǔn)文號：湘藥制字Z20080761，生產(chǎn)批號：20230305。

1.3" 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素混合液、0.25% EDTA-胰蛋白酶混合液（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號：PM150210、PB180120、PB180226）；10%胎牛血清（澳大利亞Cell-box公司，批號：AUS-01S-02）；布拉德福德蛋白檢測試劑盒（美國BioRad公司，批號：5000205）；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒（日本Takara公司，批號：RR047Q、RR430A）PVDF膜（美國Millipore公司，批號：R8AA8000F）；RIPA哺乳動物細(xì)胞裂解液、ZEB1、ZEB2、E-cadh？鄄

erin、Vimentin[美國Thermo Fisher公司，批號：89900、21544-1-AP（稀釋比：1∶10 000）、14026-1-AP（稀釋比：1：5 000）、20874-1-AP（稀釋比：1∶5 000）、10366-1-AP（稀釋比：1∶1 000）]；GAPDH蛋白抗體[美國Abcam公司，批號：ab8245（稀釋比：1∶5 000）]；二抗山羊抗兔抗體、二抗山羊抗鼠抗體[杭州戴格生物有限公司，批號：db10002（稀釋比：1∶4 000）、db10003（稀釋比：1∶4 000）]。

1.4" 儀器設(shè)備

MOP175型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司）；EIX808U型全自動酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）；Mini-PROTEAN Tetra Cell型垂直凝膠電泳儀、Trans-Blot SD蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜儀（美國伯樂公司）；GBOX型凝膠成像系統(tǒng)（美國Syngene公司）；480II FAST型熒光定量PCR儀器（瑞士Roche公司）；GX53倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）。

2 方法

2.1" 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清和青霉素-鏈霉素的DMEM（葡萄糖濃度：4.5 g/L）培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)肝癌細(xì)胞HepG2，當(dāng)細(xì)胞生長至培養(yǎng)皿的75%左右，進(jìn)行消化傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.2" 含藥血清制備

SD雄性大鼠10只，隨機(jī)數(shù)字表法分成對照組和實驗組，每組10只。大鼠灌胃劑量按照人與大鼠體表面積計算比值換算公式計算，實驗組按相當(dāng)于70 kg成年人100 mL/d的藥物量，即1.03 g/kg藥物量對大鼠進(jìn)行灌胃；對照組按大鼠體質(zhì)量灌胃等容積的生理鹽水。每天灌胃1次，連續(xù)7 d，于最后1次灌胃1 h后水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈取血，3 000 g離心15 min后取血清，混勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3" CCK-8實驗檢測細(xì)胞的增殖

選取對數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞HepG2接種于96孔板中，培養(yǎng)過夜。依次加入不同濃度（10%、15%、20%）的肝喜片含藥血清，設(shè)置6個平行孔，同時設(shè)置空白對照組。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24、48、72 h，每孔加入CCK-8溶液10 μL，放入培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的測定吸光度，計算各組細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=（加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD）×100%[9]。實驗重復(fù)3次。

2.4" 劃痕實驗檢測細(xì)胞的橫向遷移

取對數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞HepG2用0.25% EDTA-胰蛋白酶混合液常規(guī)消化后，配制成細(xì)胞懸液，接種于6孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)3個復(fù)孔；培養(yǎng)至形成單層細(xì)胞，更換無血清培養(yǎng)液饑餓處理4 h，培養(yǎng)板底部正中間劃“一”字劃痕，PBS清洗3次去除劃掉的細(xì)胞，加入不同濃度（10%、15%、20%）的肝喜片含藥血清，并于0、12、24 h拍照觀察，Image J軟件分析結(jié)果。遷移率=（0 h劃痕距離-目的時間劃痕距離）/0 h劃痕距離×100%[10]。

2.5" Transwell檢測細(xì)胞的縱向遷移

取對數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞HepG2，加入不同濃度（10%、15%、20%）的肝喜片含藥血清，用DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106/mL，100 μL/孔接種于Transwell小室上室，小室下室加入含15%FBS的DMEM 1 mL作為誘導(dǎo)劑，繼續(xù)培養(yǎng)36 h，取上室，移除培養(yǎng)液后，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，脫色清洗后顯微鏡下觀察、拍照、計數(shù)。

2.6" Western blot檢測EMT相關(guān)的蛋白表達(dá)

采用RIPA蛋白裂解液提取總蛋白，BIO-RAD QUICK START BRADFORD試劑盒測定蛋白濃度。按蛋白40 μg/孔進(jìn)行10%或者12%SDS-PAGE分離，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到0.22 μm PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加入適量稀釋后抗體ZEB1（1∶2 000）、ZEB2（1∶2 000）、E-cadherin（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）、GAPDH（1∶5 000），4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗膜15 min×3次，加入山羊抗兔二抗（1∶5 000）或者山羊抗鼠二抗（1∶5 000），室溫?fù)u床孵育1.5 h，TBST洗滌15 min×3次，加入適量ECL plus溶液，暗室內(nèi)曝光顯影拍照，Image J軟件分析各條帶灰度值。實驗重復(fù)3 次。

2.7" RT-PCR檢測miR200、EMT相關(guān)的mRNA表達(dá)

采用Trizol法提取總RNA，按cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書制備cDNA。按照RT-PCR試劑盒說明書擴(kuò)增miR200a、U6、ZEB1、ZEB2、E-cadherin、Vimentin、GAPDH（引物序列見表1），擴(kuò)增條件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 40 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 5 min。2-ΔΔCt法計算miR200a、ZEB1、ZEB2、E-cadherin、Vimentin的相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次。

2.8" 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad prism 9.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)以“ｘ±s”表示，所有數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布的采用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布的則采用Kruskal-Walls檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1" 肝喜片含藥血清對HepG2細(xì)胞增殖的影響

與空白對照組比較，肝喜片各劑量組的24、48、72 h細(xì)胞存活率均降低（P＜0.05，P＜0.01）；與肝喜片低劑量組比較，肝喜片中、高劑量組24、48、72 h細(xì)胞存活率均降低（P＜0.01）；與肝喜片中劑量比較，肝喜片高劑量組24、48、72 h細(xì)胞存活率均降低（P＜0.01）。與24 h比較，肝喜片各劑量組48、72 h細(xì)胞存活率均降低（P＜0.05，P＜0.01）；與48 h比較，肝喜片各劑量組72 h細(xì)胞存活率均降低（P＜0.05，P＜0.01）。詳見表2。

3.2" 肝喜片含藥血清對HepG2細(xì)胞橫向遷移的影響

與空白對照組比較，肝喜片各劑量組12、24 h HepG2細(xì)胞橫向遷移率均明顯下降（P＜0.01）；與肝喜片低劑量組比較，肝喜片中、高劑量組12、24 h HepG2細(xì)胞橫向遷移率均明顯下降（P＜0.01）；與肝喜片中劑量組比較，肝喜片高劑量組12、24 h HepG2細(xì)胞橫向遷移率均明顯下降（P＜0.01）。與0 h比較，肝喜片低、中劑量組12、24 h HepG2細(xì)胞橫向遷移率均明顯上升（P＜0.01）；與12 h比較，肝喜片低、中劑量組24 h HepG2細(xì)胞橫向遷移率均明顯上升（P＜0.01）。詳見圖1、表3。

3.3" 肝喜片含藥血清對HepG2細(xì)胞縱向遷移的影響

與空白對照組比較，肝喜片中、高劑量組縱向遷移細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.05）；與肝喜片低劑量組比較，肝喜片中、高劑量組縱向遷移細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.05）；與肝喜片中劑量組比較，肝喜片高劑量組縱向遷移細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.05）。詳見圖2、表4。

3.4" 肝喜片含藥血清對E-cadherin、Vimentin、ZEB1、ZEB2蛋白表達(dá)的影響

與空白對照組比較，肝喜片各劑量組E-cadherin蛋白表達(dá)明顯升高，Vimentin、ZEB1、ZEB2蛋白表達(dá)明顯下降（P＜0.01）；與肝喜片低劑量組比較，肝喜片中、高劑量組E-cadherin蛋白表達(dá)明顯升高，Vimentin、ZEB1、ZEB2蛋白表達(dá)明顯下降（P＜0.01）；與肝喜片中劑量組比較，肝喜片高劑量組E-cadherin蛋白表達(dá)升高，Vimentin、ZEB1、ZEB2蛋白表達(dá)下降（P＜0.05，P＜0.01）。詳見圖3、表5。

3.5" 肝喜片含藥血清對miR200a、ZEB1、ZEB2、E-cadherin、Vimentin mRNA表達(dá)的影響

與空白對照組比較，肝喜片中、高劑量組miR200a、E-cadherin mRNA表達(dá)升高，Vimentin mRNA 表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01），肝喜片低、中、高劑量組ZEB1、ZEB2 mRNA表達(dá)均明顯降低（P＜0.01）；與肝喜片低劑量組比較，肝喜片中、高劑量組miR200a、E-cadherin mRNA表達(dá)升高，Vimentin、ZEB1、ZEB2 mRNA表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01）；與肝喜片中劑量組比較，肝喜片高劑量組miR200a、E-cadherin mRNA表達(dá)明顯升高，Vimentin、ZEB1、ZEB2 mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.01）。詳見表6。

4 討論

原發(fā)性肝癌是一類臨床常見惡性腫瘤，有研究通過對涵蓋185個國家的Globocan數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，預(yù)計到2040年，每年將有140萬人確診為肝癌，較2020年增加55.0%，每年將有130萬人死于肝癌，較2020年增加56.4%[11]。肝癌的發(fā)病主要與乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、非酒精性脂肪肝、過量飲酒、代謝綜合征、2型糖尿病、肥胖、吸煙、攝入黃曲霉素污染的食物等相關(guān)，約56%的肝癌與HBV相關(guān)，20%與HCV相關(guān)[12-14]。但是肝癌發(fā)病隱匿，約50%的肝癌患者被確診時已到晚期，需采用綜合治療手段[15]。中醫(yī)藥作為我國的特色治療方法，在晚期肝癌的綜合治療方案里被廣泛應(yīng)用，已成為參與晚期肝癌全程治療的重要手段之一[16-17]。國醫(yī)大師潘敏求治療原發(fā)性肝癌從“瘀、毒、虛”著手，認(rèn)為其發(fā)生多因脾虛失運，肝失所養(yǎng)，氣機(jī)不暢，導(dǎo)致水谷精微蘊結(jié)成血瘀，長期氣滯血瘀，化火成毒，癌毒積聚，出現(xiàn)“瘀毒互結(jié)”等邪實癥狀。肝喜片是凝練總結(jié)了國醫(yī)大師潘敏求數(shù)十載臨床經(jīng)驗形成的醫(yī)院制劑，該制劑主要由黨參、黃芪、薏苡仁、白術(shù)、茯苓、郁金、蘇木、煅牡蠣、陳皮、茵陳、木通、大黃、香附、桃仁、沉香、半枝蓮、柴胡、敗醬草、砂仁、鱉甲、土鱉蟲、重樓等組成，具有疏肝健脾、化瘀軟堅、清熱解毒的作用，臨床主要用于肝郁脾虛、瘀毒互結(jié)型肝癌患者，臨床療效良好[18-19]。

EMT是實體瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的重要原因，腫瘤細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中諸多細(xì)胞因子的調(diào)控與刺激下，經(jīng)由胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑通過ZEB（ZEB1和ZEB2）、Snail（Snail1和Snail2）和基本螺旋-環(huán)-螺旋（Twist1和Twist2）家族3個不同的蛋白家族調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，其過程主要涉及細(xì)胞間黏附因子消失、上皮極性喪失、細(xì)胞骨架動態(tài)重組、基底膜降解等步驟，具體表現(xiàn)為上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cadherin表達(dá)下調(diào)，間充質(zhì)標(biāo)記物N-cadherin、Vimentin表達(dá)增加[20-21]。研究表明，ZEB1表達(dá)升高可通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)肝細(xì)胞癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，降低肝細(xì)胞癌患者的生存率[22]。miRNA是一種長度為18～22個核苷酸的小的內(nèi)源性非編碼RNA，廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、死亡、凋亡和代謝等生物學(xué)過程，與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)。miRNA在EMT相關(guān)的腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[3，23]。miR200家族根據(jù)種子序列被分為兩個簇，miR-200b、miR-200a和miR-429屬于簇I，位于1號染色體上，并具有共同的種子序列（AAUACUG），而miR-200c和miR-141屬于簇Ⅱ，位于11號染色體上，它們的種子序列（AACACUG）與簇Ⅰ的種子序列僅相差一個核苷酸。miR200家族作為常見的抑癌miRNA，是調(diào)控EMT的關(guān)鍵因素之一，miR200家族成員可通過靶向降解ZEB1和ZEB2的mRNA，抑制其蛋白表達(dá)，緩解EMT惡性表征，抑制包括肝癌、肺癌、乳腺癌等在內(nèi)的多種惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移[24-25]。

本論文在前期研究基礎(chǔ)上，通過實驗體外證實，肝喜片含藥血清可體外降低HepG2細(xì)胞存活率，抑制HepG2細(xì)胞的遷移，同時可上調(diào)miR200a、E-cadherin的表達(dá)，抑制ZEB1、ZEB2、Vimentin的表達(dá)，且呈現(xiàn)顯著的濃度依賴性。綜上，肝喜片可抑制肝癌的轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能與調(diào)控miR200a/ZEB信號通路、上調(diào)E-hadherin的表達(dá)、降低Vimentin的表達(dá)、逆轉(zhuǎn)EMT及抑制肝癌的增殖遷移相關(guān)。

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