早期多感覺(jué)刺激對(duì)缺氧缺血性腦損傷新生大鼠海馬 p-ERK/p-CREB/BDNF/TrkB信號(hào)通路的影響

〔摘要〕 目的 觀察早期多感覺(jué)刺激對(duì)缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage， HIBD）新生大鼠海馬區(qū)磷酸化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（phosphorylated extracellular signal-regulated kinase， p-ERK）/磷酸化的環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（phosphorylated cAMP-response element binding protein， p-CREB）/腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor， BDNF）/酪氨酸激酶受體B（tyrosinekinase receptor B， TrkB）信號(hào)途徑及其介導(dǎo)的突觸重塑的影響。方法 將48只7日齡健康新生大鼠以隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、早期多感覺(jué)刺激組，每組16只。模型組和早期多感覺(jué)刺激組大鼠制備HIBD模型，假手術(shù)組僅暴露頸總動(dòng)脈。早期多感覺(jué)刺激組自造模24 h開(kāi)始施以持續(xù)28 d的早期多感覺(jué)刺激干預(yù)，余組不進(jìn)行處理。采用水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力；透射電鏡觀察海馬突觸亞微結(jié)構(gòu)變化；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠海馬BDNF、TrkB表達(dá)水平；Western blot檢測(cè)各組大鼠海馬中p-ERK、p-CREB、BDNF、TrkB、突觸蛋白1（Synapsin1， Syn1）的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組新生大鼠訓(xùn)練第3、4、5天逃避潛伏時(shí)間顯著延長(zhǎng)（Plt;0.01），訓(xùn)練第6天穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少（Plt;0.01）；海馬突觸亞微結(jié)構(gòu)模糊不清，突觸密度降低，突觸小泡減少；海馬p-ERK、p-CREB、BDNF、TrkB、Syn1蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)（Plt;0.01）。與模型組比較，早期多感覺(jué)刺激組新生大鼠訓(xùn)練第4、5天逃避潛伏時(shí)間顯著縮短（Plt;0.01），訓(xùn)練第6天穿越平臺(tái)次數(shù)增多（Plt;0.05）；海馬突觸密度增加，突觸連接增多，突觸前膨大可見(jiàn)清亮圓形的突觸小泡；海馬p-ERK、p-CREB、BDNF、TrkB、Syn1蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)（Plt;0.01）。結(jié)論 早期多感覺(jué)刺激可有效促進(jìn)新生缺氧缺血性腦損傷大鼠認(rèn)知功能，促進(jìn)缺血側(cè)海馬突觸重塑，其作用機(jī)制可能與激活p-ERK/p-CREB /BDNF/TrkB信號(hào)通路有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 新生缺氧缺血性腦損傷；早期多感覺(jué)刺激；突觸重塑；磷酸化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶；磷酸化的環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白；腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子

〔中圖分類號(hào)〕R285.5" " " " "〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A" " " " " 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.11.009

Effects of early multisensory stimulation on the p-ERK/p-CREB/BDNF/TrkB signaling pathway in the hippocampus of neonatal rats with hypoxic-ischemic brain damage

JIANG Xinru1， LING Chen2， QI Fang1， ZENG Xuejiu1， SHE Yan1， TANG Xian1， YI Xiqin1*， AI Kun1*

1. School of Acupuncture-moxibustion， Tuina and Rehabilitation， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. The First People's Hospital of Chenzhou City， Chenzhou， Hunan 423000， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To observe the effects of early multisensory stimulation on the signaling pathway of phosphorylated extracellular signal-regulated kinase （p-ERK）/phosphorylated cAMP-response element binding protein （p-CREB）/brain-derived neur？鄄otrophic factor （BDNF）/tyrosine kinase receptor B （TrkB） and its mediated synaptic remodeling in the hippocampus of neonatal rats with hypoxic-ischemic brain damage （HIBD）. Methods Forty-eight healthy seven-day-old neonatal rats were randomized into sham-operated group， model group， and early multisensory stimulation group， with 16 rats in each group. A HIBD model was establ？鄄ished in the model and early multisensory stimulation groups. The sham-operated group only had the common carotid arteries exposed without further intervention. The early multisensory stimulation group received continuous early multisensory stimulation interventions for 28 days starting 24 h post-modeling， while the other groups did not receive any treatment. Morris water maze test was performed to assess the spatial learning and memory ability of rats; transmission electron microscopy was utilized to observe changes in hippocampal synaptic ultrastructure; immunohistochemistry was used to measure the expression levels of BDNF and TrkB in the hippocampus; Western blot was employed to analyze the protein expression levels of p-ERK， p-CREB， BDNF， TrkB， and Syn1 in the hippocampus. Results Compared with the sham-operated group， the model group showed significantly prolonged escape latencies on training days 3， 4， and 5 （Plt;0.01） and a significantly reduced number of platform crossings on training day 6 （Plt;0.01）; the hippocampal synaptic ultrastructure was blurred， with decreases in synaptic density and synaptic vesicles; the protein expression levels of p-ERK， p-CREB， BDNF， TrkB， and Syn1 in the hippocampus were significantly downregulated （Plt;0.01）. Compared with the model group， the early multisensory stimulation group exhibited shorter escape latencies on training days 4 and 5 （Plt;0.01） and an increased number of platform crossings on training day 6 （Plt;0.05）; there was an increase in hippocampal synaptic density， with more synaptic connections， and clear， round synaptic vesicles in the presynaptic enlargements; the protein expression levels of p-ERK， p-CREB， BDNF， TrkB， and Syn1 in the hippocampus were significantly upregulated （Plt;0.01）. Conclusion Early multisensory stimulation can effectively enhance cognitive function in neonatal rats with HIBD and promote synaptic remodeling in the ischemic hippocampus. The mechanism of action may be related to the activation of the p-ERK/p-CREB/BDNF/TrkB signaling pathway.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 neonatal hypoxic-ischemic brain damage; early multisensory stimulation; synaptic remodeling; phosphorylated extracellular signal-regulated kinase; phosphorylated cAMP-response element binding protein; brain-derived neurotrophic factor

缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain dam？鄄age， HIBD）是圍產(chǎn)期窒息導(dǎo)致缺氧、腦血流量減少或暫停引起的胎兒和新生兒腦功能障礙的病癥，是新生兒腦損傷最常見(jiàn)的病因之一[1]。研究表明，海馬突觸的喪失是HIBD遺留認(rèn)知障礙的關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制[2-3]。HIBD后動(dòng)物早期發(fā)育期間神經(jīng)軸突生長(zhǎng)和突觸發(fā)生出現(xiàn)延遲，神經(jīng)遞質(zhì)釋放和結(jié)合異常，進(jìn)一步誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞壞死、凋亡[2]。臨床研究證實(shí)，早期多感覺(jué)刺激治療HIBD療效確切，安全無(wú)毒副作用[4-5]。研究表明，早期多感覺(jué)刺激可以促進(jìn)HIBD大鼠海馬區(qū)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的表達(dá)，減輕HIBD后突觸超微結(jié)構(gòu)的損傷、促進(jìn)突觸的重建，明顯改善HIBD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[6-7]，但具體機(jī)制尚不明確。本課題組前期研究表明，早期多感覺(jué)刺激治療HIBD大鼠能有效改善HIBD后功能障礙[8]。

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase， ERK）激活后可以較持久地活化轉(zhuǎn)錄因子環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein， CREB），引發(fā)BDNF等神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的轉(zhuǎn)錄，BDNF與其特異性受體酪氨酸激酶受體B（tyrosinekinase receptor B，TrkB）結(jié)合，誘導(dǎo)Trk介導(dǎo)的生存機(jī)制，增強(qiáng)突觸連接，實(shí)現(xiàn)突觸重塑和神經(jīng)作用[9-10]。因此，p-ERK/p-CREB/BDNF/TrkB信號(hào)途徑可作為減輕HIBD的潛在干預(yù)靶點(diǎn)。本研究選用經(jīng)典RICE法制備HIBD模型，以p-ERK/p-CREB/BDNF/TrkB信號(hào)途徑為觀察指標(biāo)，探討早期多感覺(jué)刺激對(duì)HIBD大鼠海馬突觸重塑的影響，為早期多感覺(jué)刺激干預(yù)HIBD的調(diào)控機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1" 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SPF級(jí)SD孕鼠4只，孕15 d，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供[合格證編號(hào)：SYXK（湘）2019-0009]。SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)至分娩，共得到50只新生大鼠。在7日齡時(shí)對(duì)其進(jìn)行稱重（體質(zhì)量12～17 g），排除體質(zhì)量異常或精神狀態(tài)不佳的2只新生大鼠，剩余48只新生大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為2組：假手術(shù)組（16只）和造模組（32只）。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（倫理批準(zhǔn)編號(hào)：LL2020081801），所有實(shí)驗(yàn)步驟均嚴(yán)格按照國(guó)家科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》[11]進(jìn)行。

1.2" 主要試劑和儀器

異氟烷購(gòu)（深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司，批號(hào)：R510-22-10）；組化試劑盒DAB顯色劑（湖南艾方生物科技，批號(hào)：AFIHC004）；β-actin抗體（Bioworld生物科技有限公司，批號(hào)：BS1002P）；兔抗p-ERK、兔抗p-CREB、兔抗BDNF、兔抗TrkB、兔抗突觸蛋白1（Synapsin1，Syn1）（美國(guó)Affinity Biosciences公司，批號(hào)：AF3240、AF3189、DF6387、DF6387、AF6201）。SMART 3.0小動(dòng)物行為學(xué)視頻記錄與分析系統(tǒng)（西班牙Panlab公司，型號(hào)：2021001496）；病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司，型號(hào)：RM2016）；透射電鏡（日本Hitachi，型號(hào)：HT7700）；數(shù)碼顯微成像系統(tǒng)（日本尼康，型號(hào)：DS-U3）。

1.3" 模型制備及處理

參照改良RICE法[12]建立HIBD大鼠模型，予7日齡新生大鼠異氟烷吸入麻醉，消毒后切開(kāi)頸部皮膚，充分暴露新生大鼠左側(cè)頸總動(dòng)脈，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈并使用電凝筆電凝左側(cè)頸總動(dòng)脈做永久性阻斷，手術(shù)時(shí)間控制在5 min內(nèi)。術(shù)后保溫恢復(fù)60 min，將幼鼠暴露于恒溫缺氧艙（加濕8%氧氣和92%氮?dú)猓﹥?nèi)120 min，置于帶有母鼠氣味的墊料中10 min，回籠母乳喂養(yǎng)。經(jīng)過(guò)前期實(shí)驗(yàn)[8]，上述制備方法可成功建立模型，降低小鼠死亡率。假手術(shù)組僅分離左側(cè)總動(dòng)脈但不進(jìn)行電凝，其余處理相同。

模型制備過(guò)程中，觀察新生大鼠是否出現(xiàn)抽搐、夾尾、左旋等行為表現(xiàn)，待大鼠清醒后采用Longa評(píng)分法[13]進(jìn)行評(píng)定，評(píng)分2分及以上并出現(xiàn)上述行為視為造模成功，造模組32只均造模成功，納入實(shí)驗(yàn)。隨后使用隨機(jī)數(shù)字表法對(duì)造模組進(jìn)行二次隨機(jī)分組，分為模型組（16只）、早期多感覺(jué)刺激組（16只）。

1.4" 早期多感覺(jué)刺激干預(yù)方案

造模后24 h，早期多感覺(jué)刺激組予7 d早期撫觸干預(yù)，采用不同材質(zhì)、大小及軟硬的毛刷沾染不同味道的浴鹽，以從頭到尾的順序給新生大鼠刷毛，15 min/次，4次/d，上、下午各2次。自第8天起，將大鼠置入豐富環(huán)境籠內(nèi)，2 h/次，1次/d，干預(yù)周期3周。共進(jìn)行28 d的早期多感覺(jué)刺激干預(yù)。假手術(shù)組和模型組置于無(wú)特殊刺激的標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)天數(shù)與早期多感覺(jué)刺激組相同。豐富環(huán)境籠設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[14]研究自制透明豐富環(huán)境籠，長(zhǎng)寬高70 cm×60 cm×50 cm，底部鋪墊料，不同質(zhì)感的砂紙、樹(shù)葉予觸覺(jué)刺激；檸檬味和草莓味的浴砂、檸檬、橙子等水果予嗅覺(jué)及味覺(jué)刺激；不同顏色的斜坡、臺(tái)階、樓梯、鉆筒、轉(zhuǎn)盤、平衡木予運(yùn)動(dòng)覺(jué)刺激；明暗交替、不同顏色的燈光予視覺(jué)刺激；輕柔舒緩的音樂(lè)、α腦波音樂(lè)予聽(tīng)覺(jué)刺激；涼席、冰涼金屬予溫度刺激。每天干預(yù)后清理籠內(nèi)衛(wèi)生，每3天更換一次環(huán)境布置。

1.5" 觀察指標(biāo)

1.5.1" Morris水迷宮評(píng)估大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力" 所有新生大鼠于早期多感覺(jué)刺激干預(yù)結(jié)束后，即造模后28 d，開(kāi)始進(jìn)行6 d的Morris水迷宮試驗(yàn)[15]，訓(xùn)練前Morris水迷宮水池中加入適量的印度墨汁，使水池成為不透明色，溫度維持在（25±1） ℃，將水池均等分4個(gè)象限，記Ⅰ～Ⅳ，平臺(tái)隱藏于第Ⅲ象限水面下1 cm。每天同一時(shí)間段將新生大鼠面向池壁依次從Ⅰ～Ⅳ象限同一入水點(diǎn)入水，記錄從入水至四肢完全站立于平臺(tái)上的耗時(shí)為逃避潛伏時(shí)間；若超出90 s新生大鼠仍未至平臺(tái)上，則引導(dǎo)新生大鼠至平臺(tái)停留30 s，該情況新生大鼠逃避潛伏時(shí)間記90 s，4次/d，兩次訓(xùn)練時(shí)間間隔30 min，持續(xù)5 d。第6天撤去平臺(tái)，將新生大鼠面向池壁從第Ⅰ象限入水（原平臺(tái)對(duì)側(cè)象限），記錄新生大鼠穿越原平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)。統(tǒng)計(jì)各組新生大鼠第3、4、5天水迷宮潛伏期數(shù)據(jù)及第6天穿越平臺(tái)次數(shù)，潛伏期縮短和穿越平臺(tái)次數(shù)增多提示大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力改善[16]。SuperMaze+軟件用于記錄和分析各組新生大鼠逃避潛伏時(shí)和穿越原平臺(tái)區(qū)域次數(shù)。

1.5.2" 透射電子顯微鏡觀察大鼠缺血側(cè)海馬組織突觸亞微結(jié)構(gòu)變化" 行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后，各組均隨機(jī)選取3個(gè)樣本快速斷頭，冰上取左側(cè)海馬組織，行電鏡固定液固定、鋨酸后固定、PBS洗滌、梯度乙醇溶液脫水、滲透、60 ℃聚合48 h包埋以制備透射電鏡樣本，切片機(jī)切超薄切片，2%醋酸鈾飽和水溶液，枸櫞酸鉛，各染色15 min，至此染色結(jié)束。切片室溫干燥過(guò)夜，5 000×和20 000×透射電鏡下觀察缺氧缺血側(cè)海馬組織突觸亞微結(jié)構(gòu)變化。

1.5.3" 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠缺血側(cè)海馬組織BDNF、TrkB表達(dá)" 行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后，腹腔注射2%的戊巴比妥鈉使大鼠深度麻醉。各組均隨機(jī)選取6個(gè)樣本，快速斷頭，冰上取左側(cè)海馬組織，使用4%多聚甲醛作為固定液固定24 h以上。將海馬組織從固定液中取出，制備石蠟切片，切片脫蠟水化，置于修復(fù)盒，于微波爐進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻，PBS洗滌，3%過(guò)氧化氫溶液室溫避光孵育15 min阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS洗滌，封閉液封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性30 min，PBS洗滌。在海馬組織上滴加一抗BDNF、TrkB，濕盒內(nèi)4 ℃孵育過(guò)夜，洗滌，滴加二抗覆蓋組織，室溫孵育50 min，洗滌，滴加新鮮配制的DAB顯色，自來(lái)水沖洗終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，自來(lái)水沖洗，PBS反藍(lán)，自來(lái)水沖洗，梯度乙醇溶液脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，400×顯微鏡下采集圖像。ImageJ軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行記錄和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5.4" Western blot檢測(cè)大鼠缺血側(cè)海馬p-ERK、p-CREB、BDNF、TrkB、Syn1表達(dá)水平" 行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后，各組均隨機(jī)選取7個(gè)樣本，冰上快速取左側(cè)海馬，液氮速凍，-80 ℃冰箱保存。檢測(cè)時(shí)取整塊海馬，加入裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑（50∶1∶1）提取蛋白原液，BCA蛋白定量，根據(jù)所測(cè)濃度制備上樣液，100 ℃加熱10 min，晾至室溫，經(jīng)上樣、電泳、電轉(zhuǎn)、封閉，得到與蛋白結(jié)合完成的PVDF膜，TBST洗滌，加入對(duì)應(yīng)一抗p-ERK（1∶1 000）、p-CREB（1∶1 000）、BDNF（1∶1 000）、TrkB（1∶1 000）、Syn1（1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌，加入對(duì)應(yīng)二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌，PVDF膜置于避光孵育盒中滴加顯影液，經(jīng)化學(xué)成像儀曝光、顯影，Image Lab軟件對(duì)各組蛋白相對(duì)含量進(jìn)行定量分析。

1.6" 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)用SPSS 28.0軟件進(jìn)行處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以“ｘ±s”表示，方差齊者采用單因素方差分析，方差不齊者采用Dunnett＇s T3檢驗(yàn);非正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。以Plt;0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1" 各組新生大鼠Morris水迷宮行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果

與假手術(shù)組相比，模型組新生大鼠訓(xùn)練第3、4、5天平均逃避潛伏時(shí)間顯著延長(zhǎng)（Plt;0.01）；與模型組相比，早期多感覺(jué)刺激組訓(xùn)練第4、5天平均逃避潛伏時(shí)間顯著縮短（Plt;0.01）。與假手術(shù)組相比，模型組新生大鼠訓(xùn)練第6天穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少（Plt;0.01）；與模型組相比，早期多感覺(jué)刺激組訓(xùn)練第6天穿越平臺(tái)次數(shù)增多（Plt;0.05）。詳見(jiàn)圖1。

2.2" 各組新生大鼠海馬突觸數(shù)量及分布情況

假手術(shù)組新生大鼠左側(cè)海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)正常。模型組新生大鼠左側(cè)海馬突觸密度降低，突觸結(jié)構(gòu)不完整，突觸前膜突觸小泡溶解、模糊不清，突觸后致密物厚薄不均。早期多感覺(jué)刺激組干預(yù)后新生大鼠海馬突觸結(jié)構(gòu)有所改善，突觸密度增加，突觸結(jié)構(gòu)較完整，突觸前膨大可見(jiàn)清亮圓形的突觸小泡，突觸后致密物增厚。詳見(jiàn)圖2。

2.3" 各組新生大鼠海馬組織BDNF、TrkB的免疫組織化學(xué)結(jié)果

免疫組織化學(xué)顯出的陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色。與假手術(shù)組相比，模型組新生大鼠海馬組織中BDNF、TrkB陽(yáng)性表達(dá)率顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，早期多感覺(jué)刺激組新生大鼠海馬組織中BDNF、TrkB陽(yáng)性表達(dá)率顯著升高（P＜0.01）。詳見(jiàn)圖3。

2.4" 各組新生大鼠造模后28 d海馬組織p-ERK、p-CREB、BDNF、TrkB、Syn1的Western blot結(jié)果比較

與假手術(shù)組相比，模型組新生大鼠海馬組織中p-ERK、p-CREB、BDNF、TrkB、Syn1顯著降低（Plt;0.01）；與模型組相比，早期多感覺(jué)刺激組新生大鼠海馬中p-ERK、p-CREB、BDNF、TrkB、Syn1顯著升高（Plt;0.01）。詳見(jiàn)圖4。

3 討論

新生兒缺氧缺血性腦損傷為腦血流量和腦氧灌注量減少的結(jié)果，其病理特征主要表現(xiàn)為后皮質(zhì)、紋狀體、海馬回和丘腦以及皮質(zhì)下和腦室周圍白質(zhì)損傷[17]。研究表明，新生兒未成熟發(fā)育的腦組織具有很強(qiáng)的自我修復(fù)能力，因此在HIBD的治療過(guò)程中，在大腦發(fā)育早期及時(shí)誘導(dǎo)內(nèi)源性突觸重塑、重建被破壞的神經(jīng)回路有助于促進(jìn)神經(jīng)傳導(dǎo)及病變組織的修復(fù)，最終減輕HIBD[18]。臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均報(bào)道，早期多感覺(jué)刺激通過(guò)視覺(jué)、聽(tīng)覺(jué)、觸覺(jué)等整體性干預(yù)HIBD，促進(jìn)缺氧缺血性腦病新生兒體格和神經(jīng)系統(tǒng)的快速發(fā)育，提高神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能[5，19]。這與中醫(yī)整體觀念相契合[20]。

本研究建立7日齡HIBD模型大鼠，探究早期多感覺(jué)刺激對(duì)HIBD的治療效應(yīng)和影響HIBD后海馬突觸重塑的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)在早期多感覺(jué)刺激干預(yù)28 d后，Morris水迷宮行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，與模型組相比，早期多感覺(jué)刺激組訓(xùn)練第4、5天平均逃避潛伏時(shí)間顯著縮短，訓(xùn)練第6天穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增加，提示早期多感覺(jué)刺激可提升HIBD新生大鼠空間記憶和學(xué)習(xí)能力，改善認(rèn)知功能障礙。透射電子顯微鏡表明，早期多感覺(jué)刺激干預(yù)后HIBD新生大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元損傷程度減輕，突觸密度增加，結(jié)構(gòu)破壞有所改善，突觸前膜內(nèi)突觸小泡數(shù)量增加，呈清亮圓形。損傷后神經(jīng)元修復(fù)的強(qiáng)誘導(dǎo)劑BDNF[21]和其特異性受體TrkB[22]的免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，早期多感覺(jué)刺激干預(yù)后HIBD新生大鼠海馬區(qū)BDNF、TrkB表達(dá)增高。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證實(shí)，早期多感覺(jué)刺激可能通過(guò)誘導(dǎo)新生大鼠海馬區(qū)大腦神經(jīng)元之間的連接，增強(qiáng)突觸發(fā)生和突觸可塑性，從而改善HIBD后學(xué)習(xí)和記憶能力障礙。這與既往研究結(jié)果一致[6，23]。

ERK通路的激活在腦缺血后突觸發(fā)生過(guò)程發(fā)揮重要作用，通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控能發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，促進(jìn)突觸可塑性及遠(yuǎn)期突觸形成[24]，改善HIBD后神經(jīng)功能障礙[25]。ERK屬絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，磷酸化的ERK可通過(guò)磷酸化絲氨酸/蘇氨酸激酶進(jìn)一步磷酸化激活轉(zhuǎn)錄因子CREB，也可從細(xì)胞質(zhì)移位至細(xì)胞核催化CREB中特定的絲氨酸和蘇氨酸殘基133ser磷酸化直接磷酸化激活CREB，從而作用于cAMP效應(yīng)元件（cAMP response element，CRE），啟動(dòng)CRE依賴性的轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)含CRE序列的BDNF的表達(dá)[10，26]。BDNF通過(guò)神經(jīng)軸突逆行運(yùn)輸?shù)缴窠?jīng)元胞體，與其特異性神經(jīng)細(xì)胞受體TrkB結(jié)合，激活TrkB誘導(dǎo)的生存通路[27]，促進(jìn)發(fā)育中中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的生長(zhǎng)、發(fā)育、存活、分化成熟和再生。WANG等[28]觀察發(fā)現(xiàn)，p-ERK/p-CREB信號(hào)傳導(dǎo)的抑制可下調(diào)新生大鼠突觸蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶功能障礙。WANG等[29]發(fā)現(xiàn)，ERK通過(guò)磷酸化特異性轉(zhuǎn)錄因子來(lái)調(diào)節(jié)BDNF的表達(dá)，從而維持神經(jīng)元的存活、生長(zhǎng)和突觸可塑性的調(diào)節(jié)。上述研究結(jié)果提示，p-ERK/p-CREB/BDNF/TrkB信號(hào)通路可能在HIBD病理過(guò)程中扮演重要角色。本研究p-ERK、p-CREB、BDNF、TrkB的Western blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組新生大鼠海馬中p-ERK、p-CREB、BDNF、TrkB表達(dá)均顯著降低；早期多感覺(jué)刺激干預(yù)后，p-ERK、p-CREB、BDNF、TrkB均顯著升高。突觸發(fā)生的標(biāo)志物、突觸的特異標(biāo)志物Syn1的Western blot結(jié)果進(jìn)一步支持上述研究結(jié)果，與模型組比較，早期多感覺(jué)刺激組新生大鼠海馬中Syn1蛋白表達(dá)量顯著增加。提示早期多感覺(jué)刺激能上調(diào)模型組新生大鼠海馬中p-ERK、p-CREB、BDNF、TrkB的表達(dá)，加強(qiáng)損傷后海馬區(qū)突觸重塑，發(fā)揮腦保護(hù)作用。

綜上所述，本研究以p-ERK/p-CREB/BDNF/TrkB信號(hào)途徑為關(guān)鍵靶點(diǎn)展開(kāi)研究，提示早期多感覺(jué)刺激可能是通過(guò)激活ERK，進(jìn)一步磷酸化活化轉(zhuǎn)錄因子CREB，上調(diào)BDNF表達(dá)，BDNF與TrkB結(jié)合，引發(fā)TrkB介導(dǎo)的下游生存通路，促進(jìn)HIBD后突觸重塑，最終改善HIBD腦功能。研究為早期多感覺(jué)刺激治療HIBD提供一定的證據(jù)支持，并為臨床上藥物治療該疾病提供可能的潛在靶點(diǎn)。為了進(jìn)一步探索早期多感覺(jué)刺激對(duì)于HIBD的治療作用以及上述途徑在早期多感覺(jué)刺激促進(jìn)HIBD突觸重塑的作用機(jī)制，本研究下一步將針對(duì)不同的感覺(jué)輸入設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)以篩選最有利于腦保護(hù)作用的多感覺(jué)刺激方案，并設(shè)置關(guān)鍵蛋白的阻斷劑或激動(dòng)劑展開(kāi)進(jìn)一步研究。

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