基于UPLC-QE-MS代謝組學(xué)探討青錢柳治療糖尿病合并非酒精性脂肪肝大鼠的作用機(jī)制

〔摘要〕 目的 應(yīng)用非靶向肝臟代謝組學(xué)探討青錢柳對(duì)糖尿病合并脂肪肝大鼠的作用機(jī)制。方法 將SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、青錢柳組（0.9 g·kg-1），每組6只，建立糖尿病合并非酒精性脂肪肝動(dòng)物模型，連續(xù)灌胃4周后取材。采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定大鼠空腹血糖（fasting blood sugar， FBS）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase， ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase， AST）、甘油三酯（triglyceride， TG）、總膽固醇（total cholesterol， TC）；ELISA法檢測(cè)肝組織谷胱甘肽（glutathione， GSH）、丙二醛（malondialdehyde， MDA）、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase， SOD）含量；HE染色觀察肝組織病理形態(tài)學(xué)；油紅O染色觀察肝臟脂質(zhì)蓄積；過典酸雪夫氏（peridic acid-schiff stain， PAS）染色觀察肝臟糖原及其他多糖類物質(zhì)分布情況，并通過肝臟代謝組學(xué)分析差異代謝通路及相關(guān)靶點(diǎn)。結(jié)果 與模型組相比，青錢柳可以顯著增加模型大鼠肝組織的GSH、SOD水平，顯著降低FBS、TG、ALT、AST指標(biāo)水平（P＜0.001），并減輕肝臟脂質(zhì)沉積。通過代謝組學(xué)分析確定了 8 個(gè)生物標(biāo)志物及 1 條主要的代謝通路。結(jié)論 青錢柳可以減輕糖尿病合并脂肪肝大鼠肝脂沉積與血糖水平，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)丁酸代謝有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 代謝組學(xué)；青錢柳；2型糖尿病；非酒精性脂肪肝；丁酸代謝

〔中圖分類號(hào)〕R285.5" " " " "〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A" " " " " "〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.11.004

Mechanism of action of Cyclocarya paliurus in treating diabetic rats with nonalcohol fatty liver disease based on UPLC-QE-MS metabolomics

LIU Yixuan1，2， WU Haoyang3， LUO Zheng1，2， CAI Yuzhe1，2， DENG Yihui2， LI Dingxiang2*

1. Key Laboratory of Hunan Province for Integrated Chinese and Western Medicine on Prevention and Treatment of Cardio-cerebral Diseases， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 3. School of Acupuncture-moxibustion， Tuina and Rehabilitation， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China.

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective The application of non-targeted hepatic metabolomics and animal experiments was utilized to investigate the mechanisms by which Cyclocarya paliurus ameliorates diabetic fatty liver. Methods SD rats were randomly assigned to control， model， and Cyclocarya paliurus group （0.9 g·kg-1）， with six rats in each group. An animal model of diabetes mellitus combined with non-alcoholic fatty liver disease was established， and tissue samples were collected after four weeks of continuous gavage. Fasting blood sugar （FBS）， alanine aminotransferase （ALT）， aspartate aminotransferase （AST）， and triglyceride （TG） levels were measured using an automatic biochemical analyzer. The levels of glutathione （GSH）， malondialdehyde （MDA）， and superoxide dismutase （SOD） in liver tissues were quantified using ELISA. HE was employed to observe liver histopathology and morphology， while Oil Red O was used to assess liver lipid accumulation. Periodic acid-Schiff （PAS） staining was conducted to evaluate the distribution of liver glycogen and other polysaccharides. Additionally， differential metabolic pathways and related targets were analyzed through hepatic metabolomics. Results Compared to the model group， Cyclocarya paliurus significantly increased the levels of GSH and SOD in the liver tissues of the model rats， while also significantly decreasing the levels of FBS， TG， ALT， and AST （Plt;0.001）， and reducing hepatic lipid deposition. Metabolomics analysis identified eight biomarkers and one major metabolic pathway. Conclusions Cyclocarya paliurus attenuates hepatic lipid deposition and blood glucose levels in rats with diabetes mellitus combined with fatty liver， potentially through the regulation of butyric acid metabolism.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 metabolomics; Cyclocarya paliurus; type 2 diabetes mellitus; nonalcoholic fatty liver disease; butyrate metabolism

糖尿病是以高血糖為特點(diǎn)的代謝性疾病，其并發(fā)癥可累及全身多個(gè)靶臟器功能障礙。非酒精性脂肪性肝?。╪onalcohol fatty liver disease， NAFLD）與2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus， T2DM）、胰島素抵抗（insulin resistance， IR）、代謝綜合征密切相關(guān)[1]，據(jù)統(tǒng)計(jì)超過70%的T2DM患者合并有NAFLD[2]，并且T2DM會(huì)加速NAFLD進(jìn)展為非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis， NASH）、肝硬化或肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）[3]，被認(rèn)為是NAFLD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。近日，美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration， FDA）首次批準(zhǔn)了一種治療NAFLD的藥物，這種名為瑞司美替羅（Resmetirom）的藥物是甲狀腺激素受體的部分激活劑，通過增強(qiáng)肝臟對(duì)甲狀腺激素的反應(yīng)能力提高其代謝脂肪酸的能力，從而減少肝臟脂肪堆積，該藥物被授予治療伴有肝纖維化中重度NASH成人患者[4]。然而，目前尚無針對(duì)輕度肝纖維化和單純脂肪性病變的肝臟病理變化的治療藥物。

青錢柳[Cyclocarya paliurus （Batal.） Iljinskaja]是我國特有的樹種和寶貴的中藥資源，隸屬于胡桃科、青錢柳屬，廣泛分布于長江以南的13個(gè)省區(qū)[5]。青錢柳的葉、皮、根都可以入藥，其葉是主要活性部位，具有具有清熱解毒、生津止渴等功能[6]。已有研究證明，青錢柳主要的活性成分以多糖、三萜和黃酮類為主，可通過多種途徑調(diào)節(jié)糖脂代謝[7-9]，并對(duì)肝臟有保護(hù)作用，但從代謝組學(xué)角度分析其對(duì)糖尿病性脂肪肝大鼠肝臟代謝變化的報(bào)道較少，肝臟作為人體內(nèi)調(diào)控糖、脂類及蛋白質(zhì)代謝的樞紐器官，最能反映體內(nèi)小分子生化代謝狀態(tài)。因此，本研究在分析血清生化指標(biāo)以及肝組織病理切片的基礎(chǔ)上，采用非靶向肝臟代謝組學(xué)研究青錢柳對(duì)糖尿病性脂肪肝大鼠的干預(yù)機(jī)制，為青錢柳治療糖尿病性脂肪肝的藥效學(xué)研究提供新的思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1" 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD雄性大鼠24只，體質(zhì)量（210±10） g， 購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)單位使用許可證號(hào)：SYXK（湘）2019-0009，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（湘）2019-0004。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室，通風(fēng)良好，每日12 h照明，溫度25 ℃，濕度合適。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（LL2022070405）。

1.2" 主要試劑

甲醇（CAS 67-56-1，LC-MS級(jí)，CNW Technologies）；乙腈（CAS 75-05-8，LC-MS級(jí)，CNW Technologies）；甲酸（CAS 64-18-6，LC-MS級(jí)，Sigma）；大鼠MDA測(cè)定試劑盒、SOD試劑盒、GSH－ST試劑盒（上海茁彩生物科技有限公司，貨號(hào)：ZC-55718-J、ZC-36451、ZC-36690）；鏈脲佐菌素STZ、檸檬酸鈉緩沖液（索萊寶公司，貨號(hào)：S8050、C1013）。

1.3" 儀器與設(shè)備

超高效液相儀（Vanquish Thermo Fisher Scientific）；高分辨質(zhì)譜儀（Orbitrap Exploris 120 Thermo Fisher Scientific）；GA-3型血糖測(cè)試儀、血糖試紙（長沙Sinocare公司）；Basis Hel-VAP ML旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國海道爾夫Heidolph公司）；Chemray 800全自動(dòng)生化分析儀（深圳雷杜生命科技）；BioPrep-24生物樣品均質(zhì)儀（中國杭州奧盛）；RT-6100型酶標(biāo)儀（美國Rayto公司）；Milli-Q Biocel A10超濾除熱源純水器；Optima MAX臺(tái)式超速離心機(jī)；RM2016病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；KD-P組織攤片機(jī)（浙江金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1" 藥物制備及給藥濃度

青錢柳由湖南省中藥研究所提供，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)翦雨青副教授鑒定為胡桃科青錢柳Cyclocarya paliurus （Batal.） Iljinskaja 的干燥葉片。制備方法：取1 kg青錢柳干燥葉片，加入12倍水，沸騰2 h，過濾，濾渣再加10倍水，沸騰 1 h，合并2 次濾液，濾液濃縮至1 L，即青錢柳水提液濃度為1 mg/mL。

青錢柳給藥濃度按照人與大鼠體表面積折算，參考《貴州省中藥、民族藥材治療標(biāo)準(zhǔn)（2019年版）》與《四川省藥品監(jiān)督管理局中藥標(biāo)準(zhǔn)》中青錢柳成人推薦用量（10 g/d）計(jì)算其臨床等效劑量，即青錢柳組給藥劑量為（0.9 g/kg），空白組及模型組灌胃生理鹽水。灌胃4周后取材并檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

2.2" 動(dòng)物分組

參考XU等[10]報(bào)道的造模方法，24只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)選6只大鼠作為空白組飼以普通飼料，其余18只大鼠予高糖高脂飼料（67%基礎(chǔ)飼料+10%豬油+20%蔗糖+2.5%膽固醇+0.5%膽酸鈉），飼養(yǎng)4周后禁食12 h，一次性腹腔注射鏈脲佐菌素（35 mg/kg），空白組腹腔注射相應(yīng)體積的檸檬酸緩沖液。1周后，隨機(jī)從18只大鼠中選取3只進(jìn)行肝臟病理觀察，若出現(xiàn)一定程度的脂肪變性，胞質(zhì)中出現(xiàn)大量脂滴空泡，并連續(xù)2次大鼠空腹血糖（fasting blood sugar， FBS）≥16.7 mmol/L，兩者條件均滿足即為T2DM合并NAFLD模型。余下15只造模大鼠，隨機(jī)選取12只大鼠，以隨機(jī)數(shù)字表法將其分為模型組、青錢柳組（0.9 g/kg），每組6只。

2.3" 大鼠的體質(zhì)量記錄及肝臟指數(shù)計(jì)算

大鼠處死前記錄其體質(zhì)量，處死大鼠后，取其肝臟并拍照觀察肝臟表面，稱量肝臟質(zhì)量并計(jì)算肝臟指數(shù)，肝臟指數(shù)=肝濕重（g）/大鼠體質(zhì)量（g）×100%。

2.4" 大鼠血清FBS、TG、TC、ALT、AST水平

取材前12 h予以禁食不禁水處理。取材前用10%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，大鼠麻醉后仰臥位固定，從腹正中線皮膚切開腹腔，腹主動(dòng)脈取血4 mL，室溫靜置1 h后，4 ℃條件下，以3 500 r/min離心15 min，分離血清，采用全自動(dòng)血生化分析儀分別測(cè)定FBS、TG、TC、ALT、AST水平，嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行。

2.5" 大鼠肝臟MDA、SOD、GSH水平

收集到的肝臟用生理鹽水進(jìn)行清洗，并按說明書要求進(jìn)行勻漿后取上清液，置冰上待測(cè)，按試劑盒說明書操作分步檢測(cè)肝組織氧化應(yīng)激標(biāo)志物丙二醛（malondialdehyde， MDA）、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase， SOD）、肝組織谷胱甘肽（glutathione， GSH）水平。

2.6" 大鼠肝臟病理染色

腹主動(dòng)脈取血后，用眼科剪沿肝臟外緣取下完整肝臟，置于4 ℃生理鹽水中浸洗，在冷凍臺(tái)上用刀片切取右葉5 mm×5 mm×3 mm肝組織并固定于4%多聚甲醛中，經(jīng)固定-脫水-包埋-切片-脫蠟等常規(guī)步驟后，對(duì)各組大鼠肝臟標(biāo)本進(jìn)行染色并且在鏡下進(jìn)行觀察、拍照。

2.7" 代謝組學(xué)研究

2.7.1" 肝組織樣本處理" 將18個(gè)肝組織樣本各取25 mg置于離心管中，分別加入500 μL提取液（甲醇∶乙腈∶水＝2∶2∶1，含同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)混合物），35 Hz研磨后置于冰水浴上超聲5 min，-40 ℃靜置1 h，隨后離心取上清于進(jìn)樣瓶中上機(jī)檢測(cè)。所有樣品另取等量上清混合成質(zhì)量控制（quality control， QC）樣品上機(jī)檢測(cè)。

2.7.2" 色譜條件" 通過WATERS ACQUITY UPLC BEH Amide（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）液相色譜柱對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行色譜分離。液相色譜A相為水相，含25 mmol/L乙酸銨和25 mmol/L氨水，B相為乙腈。樣品盤溫度4 ℃，進(jìn)樣體積2 μL。梯度洗脫（0～0.5 min，95% B；0.5～7 min，95%～65% B；7～8 min，65% B～40% B；8～9 min，40% B；9～9.1 min，40%～95% B；9.1～12 min，95% B），柱溫30 ℃，進(jìn)樣盤溫度4 ℃，流速0.5 mL/min。

2.7.3" 質(zhì)譜條件" Orbitrap Exploris 120質(zhì)譜儀在軟件（Xcalibur，版本4.4，Thermo）控制下進(jìn)行一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。詳細(xì)參數(shù)如下：鞘氣流速50 Arb，輔助氣流速15 Arb，毛細(xì)管溫度320 ℃，全MS分辨率（full MS resolution）為60 000，MS/MS分辨率為15 000，碰撞能量（collision energy）：SNCE 20/30/40，噴霧電壓（spray voltage）3.8 kV（正離子模式）、-3.4 kV（負(fù)離子模式）。

2.7.4" 差異代謝物與代謝通路分析" 原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)ProteoWizard軟件轉(zhuǎn)化成“.mzXML”格式，并對(duì)每個(gè)色譜圖進(jìn)行峰識(shí)別、峰提取、峰對(duì)齊等處理，通過二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫匹配進(jìn)行物質(zhì)注釋，對(duì)所得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行偏離值過濾、缺失值過濾、缺失值填補(bǔ)、數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化等處理。將清洗后的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，使用SIMCA v16.0.2對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換以及中心化格式化處理，進(jìn)行自動(dòng)建模分析。將篩選編輯后的結(jié)果根據(jù)投影（VIP）值和Student t檢驗(yàn)篩選潛在代謝物，通過在線數(shù)據(jù)庫HMDB（http：//www.Hmdb.ca/）、京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫（http：//www.kegg.jp/kegg/pathway.html）和Metabo Analyst（http：//www.metaboananlyst.ca/faces/upload-view.xhtml）等檢索差異性代謝物和代謝通路，并且尋找最相關(guān)通路上的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.8" 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0軟件以及GraphPad Prism 9.5.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析以及圖像處理。多組間數(shù)據(jù)比較采用One-way ANOVA，組間兩兩比較采用LSD法，Plt;0.05表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1" 青錢柳對(duì)糖尿病性脂肪肝大鼠體質(zhì)量及肝臟指數(shù)的影響

與空白組相比，模型組大鼠與青錢柳組大鼠體質(zhì)量均顯著升高（Plt;0.001），且青錢柳組顯著低于模型組大鼠體質(zhì)量（Plt;0.001）。與模型組相比，青錢柳組大鼠肝臟指數(shù)均顯著降低（Plt;0.01，Plt;0.001），且與空白組大鼠肝臟指數(shù)無明顯統(tǒng)計(jì)差異。詳見圖1。

3.2" 青錢柳對(duì)糖尿病性脂肪肝大鼠血生化指標(biāo)的影響

與空白組比較，模型組大鼠FBS、TG、TC、ALT、AST含量顯著升高（P＜0.001）。與模型組比較，青錢柳組大鼠FBS、TG、ALT、AST顯著降低（P＜0.001）。詳見圖2。

3.3" 青錢柳對(duì)糖尿病性脂肪肝大鼠肝臟MDA、SOD、GSH水平的影響

與空白組比較，模型組大鼠肝組織MDA水平顯著升高（P＜0.001），SOD、GSH水平顯著降低（P＜0.001）；與模型組比較，青錢柳組GSH、SOD水平顯著升高（P＜0.001），MDA水平顯著下降（P＜0.01）。詳見圖3。

3.4" 青錢柳對(duì)糖尿病性脂肪肝大鼠肝組織病理學(xué)的影響

HE染色顯示：空白組大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)正常清晰、細(xì)胞形態(tài)排列整齊，空泡狀改變較少，無明顯炎性細(xì)胞浸潤；模型組大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)異常、細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)紊亂、出現(xiàn)大量脂滴空泡及炎性浸潤；青錢柳組大鼠有脂肪肝的組織病理學(xué)特征，但相比模型組有很大緩解。肝組織油紅Ｏ染色顯示，空白組未見紅色脂滴；模型組肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量紅色脂滴，脂滴較大，脂質(zhì)含量顯著增高；青錢柳組的肝細(xì)胞內(nèi)脂滴形成明顯減少，脂質(zhì)含量顯著降低。PAS染色結(jié)果顯示：空白組大鼠肝臟糖原染成大片的紫紅色；與空白組相比，模型組大鼠肝糖原染色面積顯著減少并且顏色明顯偏淡；與模型組相比，青錢柳組染色明顯改善。詳見圖4。

3.5" 代謝組學(xué)分析

3.5.1" 大鼠肝組織代謝物主成分分析" 主成分分析（principal component analysis， PCA）圖顯示3個(gè)QC樣本緊密聚集在一起（圖5A），并且在PCA-X一維分布圖中呈現(xiàn)的QC樣本全部在±2 STD之內(nèi)（圖5B），以上結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)方法穩(wěn)定性好數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，適合繼續(xù)研究。

3.5.2" 大鼠肝組織OPLS-DA分析" 采用OPLS-DA回歸對(duì)代謝物表達(dá)與樣品之間的關(guān)系進(jìn)行建模，進(jìn)一步構(gòu)建并區(qū)分組間差異代謝物。OPLS-DA結(jié)果表明，空白組和模型組（R2Y=0.991，Q2=0.871）、模型組與青錢柳組（R2Y=0.971，Q2=0.582）有較好的區(qū)別，模型穩(wěn)定可靠，代謝物差異明顯，表明組間差異遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于組內(nèi)差異（圖6）。

3.5.3" 大鼠肝組織差異代謝物分析" 3組共得到檢測(cè)物質(zhì)13 894個(gè)，空白組與模型組差異代謝物4 385個(gè)（上調(diào)2 059個(gè)，下調(diào)2 326個(gè)），模型組與青錢柳組差異代謝物2 903個(gè)（上調(diào)2 583個(gè)，下調(diào)320個(gè)）。將獲得的所有代謝物繪制火山圖，圖中橫坐標(biāo)代表該組對(duì)比各物質(zhì)的倍數(shù)變化（取以2為底的對(duì)數(shù)），縱坐標(biāo)表示學(xué)生t檢驗(yàn)的P-value（取以10為底對(duì)數(shù)的負(fù)數(shù)），散點(diǎn)大小代表OPLS-DA模型的VIP值，散點(diǎn)越大VIP值越大。顯著上調(diào)的代謝物以紅色表示，顯著下調(diào)的代謝物以藍(lán)色表示，非顯著差異的代謝物為灰色（圖7）。

3.5.4" 回調(diào)差異代謝物" 以VIP＞1.5且P＜0.05作為差異代謝物篩選標(biāo)準(zhǔn)，空白組與模型組差異代謝物80個(gè)，模型組與青錢柳組差異代謝物81個(gè)，將空白組與模型組、青錢柳組與模型組的差異代謝物取交集共獲得8個(gè)內(nèi)源性代謝物，將其相對(duì)含量進(jìn)行z-score標(biāo)準(zhǔn)化，觀察這8個(gè)差異代謝物在不同分組中的相對(duì)含量變化趨勢(shì)（表1）。

3.5.5" 差異代謝通路和相關(guān)靶點(diǎn)分析" 將篩選出的8個(gè)生物標(biāo)志物導(dǎo)入MetaboAnalyst網(wǎng)站進(jìn)行代謝通路分析，發(fā)現(xiàn)涉及相關(guān)通路9條（表2）。根據(jù)P＜0.05且Impact＞0.1篩選出主要的回調(diào)代謝通路，推測(cè)青錢柳主要通過調(diào)節(jié)丁酸代謝（butanoate metabolism）對(duì)糖尿病性脂肪肝起到治療作用，可能通過影響差異代謝物乙酰乙酸（acetoacetic acid）調(diào)節(jié)丁酸代謝，最終改善酮體及短鏈脂質(zhì)生成。

結(jié)合HMDB數(shù)據(jù)庫對(duì)丁酸代謝通路進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（monocarboxylate transporter 1，SLC16A1）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、過氧化酶增殖因子活化受體（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARG）、組蛋白脫乙酰酶4（histone deacetylase 4，HDAC4）、組蛋白脫乙酰酶9（histone deacetylase 9，HDAC9）等靶點(diǎn)與丁酸代謝相關(guān)。課題組前期通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)了青錢柳治療T2DM合并NAFLD的核心作用靶點(diǎn)[11]，與本次差異代謝通路的相關(guān)靶點(diǎn)取交集，推測(cè)青錢柳主要通過PPARG與TNF靶點(diǎn)調(diào)控丁酸代謝改善T2DM合并NAFLD。

4 討論

NAFLD包括一系列的肝損傷，被視為代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)，與遺傳及多種代謝風(fēng)險(xiǎn)因素相關(guān)[12]，已成為肝臟相關(guān)發(fā)病和死亡的主要原因，目前的全球患病率約為25%，并預(yù)計(jì)將持續(xù)增加[13]。天然產(chǎn)物在新藥開發(fā)和設(shè)計(jì)中發(fā)揮重要作用，在各種疾病的治療中顯示出巨大潛力，黃連素和西利馬林被發(fā)現(xiàn)可以改善患者肝臟脂質(zhì)積累，目前，處于第四階段臨床研究，有望成為治療NAFLD的特效藥物[14-15]。

青錢柳是我國特有的藥食同源植物，以其樹葉為原料研制的保健茶，已經(jīng)獲得了FDA的認(rèn)可，并且被國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)2013年第4號(hào)公告列入新食品原料，具有廣闊的研究前景。目前，已有大量研究表明青錢柳具有降血糖、降血脂、降尿酸、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)腸道菌群等功效，但具體機(jī)制尚未闡明。代謝組學(xué)可直接反映生物體的生理及病理變化，具有動(dòng)態(tài)性和整體性等特點(diǎn)[16]。本研究通過對(duì)比空白組、模型組與青錢柳組大鼠的肝臟代謝組學(xué)、肝病理組織染色以及血生化檢測(cè)指標(biāo)，綜合探討青錢柳治療糖尿病性脂肪肝的作用機(jī)制。

在本實(shí)驗(yàn)中，高糖高脂飼料喂養(yǎng)結(jié)合腹腔注射STZ誘導(dǎo)T2DM合并NAFLD模型，造模成功的大鼠體質(zhì)量、肝重指數(shù)明顯增加，與模型組大鼠相比，青錢柳組FBS、ALT、AST、TG血生化指標(biāo)顯著降低，肝臟氧化應(yīng)激指標(biāo)GSH、SOD水平顯著升高，MDA水平顯著下降。肝組織HE、油紅O、PAS染色結(jié)果表明，青錢柳可顯著緩解肝細(xì)胞彌漫性腫脹，減少肝臟脂滴沉積，改善肝糖原生成。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，青錢柳對(duì)T2DM合并NAFLD大鼠血糖、血脂有調(diào)節(jié)作用，可以減輕肝損傷、改善肝組織脂質(zhì)沉積，恢復(fù)其抗氧化能力。

通過肝臟代謝組學(xué)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，青錢柳治療T2DM合并NAFLD主要與調(diào)節(jié)丁酸代謝相關(guān)。人體中大部分丁酸是由腸道微生物群在大腸中發(fā)酵產(chǎn)生，約占短鏈脂肪酸（short-chain fatty acid，SCFA）總產(chǎn)量的20%，被認(rèn)為是調(diào)節(jié)腸道菌群在全身能量平衡中的重要媒介[17]，在腸外分布于中樞系統(tǒng)及周圍組織，如肝臟、棕色脂肪組織以及白色脂肪組織。丁酸在脂肪酸氧化過程中代謝為CO2、乙?；鵆oA，后者可以進(jìn)入三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA cycle）用于脂質(zhì)和葡萄糖的合成。DEN等[18]研究表明，丁酸在肝臟中的作用與過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPAR γ）有關(guān)，通過降低PPAR γ，丁酸增加了解偶聯(lián)蛋白2（uncoupling protein 2，UCP2）表達(dá)和線粒體質(zhì)子泄漏，改變AMP/ATP比率并通過腺苷酸激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）通路以減少脂質(zhì)合成、增加脂質(zhì)氧化。目前，丁酸及其衍生物苯丙氨酸丁酰胺（C13H18N2O2，F(xiàn)BA）已被證明對(duì)改善胰島素抵抗和脂肪肝有保護(hù)作用，通過激活A(yù)MPK/乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）途徑，減少肝臟ROS的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)線粒體功能，被視為一種新的治療策略[19]。

此外，本研究中TG水平下降，差異代謝物甘油磷酸酯（Glycerol-3-phosphate，G3P）水平升高，提示用藥后可能通過促進(jìn)TG分解、抑制G3P途徑介導(dǎo)的甘油三酯合成，最終導(dǎo)致TG水平下降；肝內(nèi)生成的葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase，G6P）與糖酵解、磷酸戊糖途徑、糖原合成等多個(gè)代謝途徑相關(guān)，是糖代謝的樞紐，也是代謝重編程的主要原因[20]，推測(cè)青錢柳通過調(diào)節(jié)G6P參與肝糖代謝過程；D-Fagomine是1-脫氧野尻霉素的類似物，已被證明具有降血糖活性，能夠抑制α-糖苷酶活性[21]，實(shí)驗(yàn)研究表明，D-Fagomine可能通過改變腸道微生物群減輕炎癥水平及葡萄糖耐受性受損[22]，此外還可以通過調(diào)控AMPK/沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）/過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活子1α（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1-alpha，PGC-1α）通路減輕高葡萄糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激[23]。

綜上所述，本研究在代謝層面探討了青錢柳治療T2DM合并NAFLD的作用，提示其可以通過調(diào)節(jié)丁酸代謝改善糖脂代謝紊亂，可能與腸道微生物群相關(guān)，課題組接下來將進(jìn)一步從“腸-肝”軸角度探討青錢柳治療T2DM合并NAFLD的作用機(jī)制。

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