清瘟解熱方對濕熱證型病毒性肺炎大鼠肺損傷及CCL3/CCR5信號通路的作用

〔摘要〕 目的 探討清瘟解熱方（以下簡稱QWJR）對濕熱證型病毒性肺炎大鼠肺損傷及CCL3/CCR5信號通路的作用。方法 將48只大鼠隨機分為正常組、濕熱模型組、陽性藥物組（甲潑尼龍）、清瘟解熱低劑量組（QWJR-L）、清瘟解熱中劑量組（QWJR-M）、清瘟解熱高劑量組（QWJR-H），每組8只，雌雄各半，正常組自然環(huán)境飼養(yǎng)，其余各組濕熱外因+內(nèi)因飼養(yǎng)14 d。14 d后，除正常組氣管注射50 μL PBS外，其余組均運用Poly（I：C）氣管注射，建立濕熱證型病毒性肺炎大鼠模型。造模2 h后，正常組和濕熱模型組灌胃生理鹽水，其余各組給予相應藥物干預，連續(xù)給藥3 d。收集樣本后檢測相關指標。（1）濕熱證評價指標：大鼠癥狀、證候積分、體質(zhì)量、血清總膽固醇（cholesterol， CHOL）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol， LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol， HDL-C）含量、血常規(guī)；（2）肺泡毛細血管屏障變化、肺損傷情況：肺組織的干濕比、支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid， BALF）總細胞計數(shù)、BALF總蛋白濃度、HE染色觀察大鼠肺組織病理變化；（3）趨化因子CCL3（CC chemokine Ligand 3， CCL3）/CC趨化因子受體-5（CC chemokine receptor 5， CCR5）通路及下游因子：qPCR法檢測肺組織中CCL3、CCR5、磷脂酶C（phospholipase C， PLC）、蛋白激酶C（proteinkinase C， PKC）mRNA表達水平和Western-Blot法檢測CCL3、CCR5、PLC、PKC蛋白表達水平。結(jié)果 QWJR干預后大鼠大便黏滯或溏泄伴臭穢，肛門紅腫污穢情況有所減輕，大鼠濕熱證候積分降低，血脂CHOL、LDL-C水平降低（Plt;0.05）；血常規(guī)中WBC及NE水平較模型組降低（Plt;0.05）；QWJR-M組和QWJR-H組肺組織W/D值、BULF中總蛋白含量、總細胞數(shù)均降低，且以高劑量組治療效果最顯著（Plt;0.01），并有效改善大鼠肺組織病理損傷；與模型組相比，陽性藥物組、QWJR-H組大鼠CCR5、PLC、PKC蛋白表達水平降低（P＜0.05，P＜0.01），CCL3、CCR5、PLC、PKC mRNA表達量降低（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論 QWJR可減輕濕熱大鼠濕熱癥狀，改善濕熱證型病毒性肺炎大鼠肺部損傷情況，該作用可能是通過抑制CCL3/CCR5信號通路實現(xiàn)的。

〔關鍵詞〕 病毒性肺炎；清瘟解熱方；肺損傷；濕熱證；濕熱證動物模型；CCL3/CCR5信號通路

〔中圖分類號〕R285.5" " " " "〔文獻標志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.11.003

Effects of Qingwen Jiere Formula on lung injury and CCL3/CCR5 signaling pathway in rats with viral pneumonia of damp-heat pattern

ZHANG Linman1， LI Qin1，2， ZHANG Tingrui1， WEN Weibo1，2*

1. Yunnan University of Chinese Medicine， Kunming， Yunnan 650021， China; 2. Yunnan Key Laboratory of Integrated Chinese and Western Medicine for Chronic Disease Prevention and Treatment， Kunming， Yunnan 650021， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the effects of Qingwen Jiere Formula （QWJR） on lung injury and CC chemokine Ligand 3 （CCL3）/CC chemokine receptor 5 （CCR5） signaling pathway in rats with viral pneumonia of damp-heat pattern. Methods Forty-eight rats were randomized into normal group， model group， positive drug group （methylprednisolone）， as well as low-， medium-， and high-dose QWJR groups （i.e. QWJR-L， QWJR-M， and QWJR-H groups）， with eight rats in each group， half male and half female. The normal group was raised in a natural environment， while the other groups were subjected to both exogenous and endogenous damp-heat conditions for 14 days. After 14 days， except for the normal group which received a tracheal injection of PBS 50 μL， all other groups were administered with Poly（I∶C） via tracheal injection to establish a rat model of viral pneumonia with damp-heat pattern. Two hours after model establishment， the normal and model groups were gavaged with saline， while the other groups received corresponding drug interventions for 3 consecutive days. Samples were collected for the following measurements： （1） Evaluation indicators of damp-heat pattern： rat symptoms， pattern scores， body mass， serum levels of chol？鄄esterol （CHOL）， low-density lipoprotein cholesterol （LDL-C）， and high-density lipoprotein cholesterol （HDL-C）， and blood routine test; （2） Changes in alveolar-capillary barrier and lung injury： measurement of the lung wet-to-dry weight ratio （W/D）， as well as the total cell count and total protein concentration in the bronchoalveolar lavage fluid （BALF）， and observation of pathological changes in the lung tissue using HE staining; （3） CCL3/CCR5 pathway and downstream factors： determination of CCL3， CCR5， PLC， and PKC protein and mRNA expression levels using qPCR and Western blot， respectively. Results After QWJR intervention， symptoms such as sticky or loose stools with a foul odor， and redness， swelling， and soiling around the anus were alleviated in the rats; the pattern scores for damp-heat were reduced， along with lower levels of serum CHOL and LDL-C （Plt;0.05）; the levels of WBC and NE in the blood routine test were also lower than those of the model group （Plt;0.05）. In the QWJR-M and QWJR-H groups， the lung W/D value and the total protein content and total cell count in BALF decreased， with the QWJR-H group showing the most significant therapeutic effect （Plt;0.01）. Additionally， the pathological damage to the rat lung tissue was effectively reduced. Compared with the model group， the protein expression levels of CCR5， PLC， and PKC were lower in the positive drug and QWJR-H groups （Plt;0.05， Plt;0.01）， and the mRNA expression levels of CCL3， CCR5， PLC， and PKC were also reduced （Plt;0.05， Plt;0.01）. Conclusion Qingwen Jiere Formula can alleviate the symptoms of damp-heat and reduce lung injury in rats with viral pneumonia of the damp-heat pattern. The effects may be achieved through the inhibition of the CCL3/CCR5 signaling pathway.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 viral pneumonia; Qingwen Jiere Formula; lung injury; damp-heat pattern; animal model of damp-heat pattern; CCL3/CCR5 signaling pathway

隨著全球人口老齡化趨勢加速，免疫抑制劑的普及使用以及病毒變異或新興病毒的不斷出現(xiàn)，病毒性肺炎的發(fā)病率顯著增長，已占肺炎總發(fā)病率的10%～30%[1]。有研究指出，在呼吸道病毒測試陽性的病例中，過半數(shù)患者最終發(fā)展成肺炎[2]。云南省名中醫(yī)溫偉波主任醫(yī)師依據(jù)病毒性肺炎的病理、云南特殊氣候及濕熱體質(zhì)主導的特征，研發(fā)了清熱化濕、芳香辟穢的清瘟解毒方，適用于發(fā)熱、咽痛、咳嗽伴消化不良等癥狀[3]。體外研究顯示，清瘟解熱合劑對多種常見及新型冠狀病毒展示出廣譜的抗病毒和抗炎作用[4]。本研究通過建立濕熱證病毒性肺炎大鼠模型，檢測模型大鼠的濕熱相關指標及肺泡毛細血管屏障變化情況，并進一步檢測趨化因子CCL3（CC chemokine ligand 3， CCL3）/CC趨化因子受體-5（CC chemokine receptor 5， CCR5）通路相關因子及肺組織病理改變，分析清瘟解熱方對濕熱證型病毒性肺炎大鼠肺損傷的作用。

1 材料

1.1" 動物

48只6～8周齡無特定病原體級（specific pathogen free， SPF）成年健康SD大鼠，8周齡，體質(zhì)量180～220 g，雌雄各半，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司提供，動物許可證號：SCXK（京）2019-0010。動物實驗倫理通過云南中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審批，審批號：R-062022031。

1.2" 藥物與試劑

1.2.1" 藥物及制備" 清瘟解熱方（以下簡稱QWJR）：廣藿香15 g，滇柴胡20 g，黃芩12 g，連翹12 g，法半夏15 g，炒（姜）厚樸12 g，草果10 g，白薇15 g，茵陳15 g，蜘蛛香15 g，滑石15 g，炒神曲20 g，甘草9 g，購于國藥控股云南有限公司。草果破碎后和其他藥一起煎煮，煎3次：第1次加水1 850 mL，煎60 min后過濾；第2次加水1 480 mL，煎40 min后過濾；第3次加水1 110 mL，煎30 min后過濾。最后將濾液濃縮，用純凈水定容至300 mL，即清瘟解熱方的規(guī)格為0.60 g（生藥）/mL；甲潑尼龍片，輝瑞制藥有限公司產(chǎn)品，批號：FD7748。

1.2.2" 主要試劑" poly I：C（貨號：J17GS151849，上海源葉生物科技有限公司）；Rat NE ELISA試劑盒[貨號：KE1601，安諾倫（北京）生物科技有限公司]；CCL3 Polyclonal Antibody、CCR5 Polyclonal Antibody（貨號：35E27A37、35E29A14，美國英杰生命技術有限公司）；Anti-PKC antibody[貨號：Ab109539，艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司]。

1.2.3" 主要儀器" Mini Amp Thermal Cycller PCR儀[型號：Mini Amp Thermal Cycller，美國應用生物系統(tǒng)（ABI）公司]；酶標儀（型號：RT-6100，深圳雷杜生命科學股份有限公司產(chǎn)品）；血液細胞分析儀（型號：TEK-VET3，江西特康科技有限公司產(chǎn)品）；全自動生化分析儀（型號：SH11，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司產(chǎn)品）；低溫高速離心機（型號：H1-16KR，湖南可成儀器設備有限公司產(chǎn)品）；Nikon ECLI？鄄

PSE Ci光學顯微鏡[型號：Nikon ECLIPSE Ci，尼康映像儀器銷售（中國）有限公司產(chǎn)品]；電子天平（型號：FA2004B，上海佑科儀器儀表有限公司產(chǎn)品）。

2 方法

2.1" 分組及造模

大鼠適應性喂養(yǎng)5 d，按照隨機數(shù)字表法分為分為正常組、濕熱模型組、陽性藥物組、QWJR低劑量組（QWJR-L）、中劑量組（QWJR-M）和高劑量組（QWJR-H），每組8只。正常組在自然環(huán)境[室內(nèi)溫度（26±2） ℃，相對濕度45%～60%]＋普通飼料飼養(yǎng)，其余各組根據(jù)中醫(yī)常用濕熱造模法[5-6]建立濕熱大鼠模型，用高脂飼料（80%基礎飼料＋8%蜂蜜＋12%豬油）喂養(yǎng)（內(nèi)因），同時放入人工氣候箱中溫度（32±0.5） ℃、濕度90%±5%，每天在濕熱環(huán)境中8 h（8—17時）（外因），14 d后移至自然環(huán)境。Poly（I：C）是人工合成的雙鏈RNA病毒類似物，其可激活宿主先天免疫反應，誘導I型干擾素和炎性細胞因子/趨化因子產(chǎn)生，造成肺上皮屏障功能受損常被用來制備病毒性肺炎肺損傷模型[7-8]，故本研究通過濕熱模型組和各給藥組加用5 mg/kg Poly（I：C）溶解于50 μL PBS氣管內(nèi)注射，正常組氣管內(nèi)注射50 μL PBS，建立病毒性肺炎大鼠模型。若出現(xiàn)飲食減少，毛發(fā)稀疏無光澤，反應遲鈍，嗜睡懶動，肛周污穢，大便溏泄等濕熱證型主要癥狀，即可判斷造模成功[8]。

2.2" 分組用藥

糖皮質(zhì)激素對炎癥因子具有良好的抑制作用，常被用作病毒性肺炎的輔助治療[9]。在病毒性肺炎的治療中，糖皮質(zhì)激素甲潑尼龍因其作用快、生物半衰期短、安全性好而被廣泛使用[10]，故本實驗選用甲潑尼龍作為陽性對照藥物。

病毒性肺炎大鼠造模造模2 h后，正常組和濕熱模型組灌胃生理鹽水2 mL/d；陽性藥物組灌胃甲潑尼龍3.43 mg/（kg·d），QWJR-L組、QWJR-M組、QWJR-H組比為1∶2∶4，分別灌胃生藥7.93 g、15.86 g、31.72 g/（kg·d）。所有組灌胃均為1次/d，連續(xù)灌胃3 d。QWJR各組為人等效劑量，根據(jù)動物給藥劑量換算公式[11]得出。

將QWJR濃縮至6 g（生藥）/mL，QWJR-L、QWJR-M、QWJR-H 3組大鼠給藥體積分別為1.32、2.64、5.28 mL/（kg·d）；甲潑尼龍組以無菌0.9%氯化鈉溶液配成濃度為0.686 mg/mL的藥液備用，大鼠給藥劑量為5 mL/（kg·d）。

2.3" 生物樣本的收集

2.3.1" 血清的收集" 清瘟解熱方干預3 d后，所有大鼠禁食不禁水8 h，運用腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉溶液（10 mL/kg）進行麻醉大鼠，經(jīng)腹主動脈采血，4 ℃、3 000 r/min，離心15 min，收集上層血清。

2.3.2" BALF及肺組織的收集" 收集血清后，將大鼠處死，在氣管叉處結(jié)扎右側(cè)主支氣管，應用注射器經(jīng)氣管緩慢注入冷PBS 2 mL行左肺支氣管肺泡灌洗，用注射器緩慢沖洗左肺3遍，回收支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid， BALF），重復3次。收集的BALF在4 ℃、2 000 r/min離心10 min，分別收集上清液和沉淀。此外，取右肺下葉組織用于濕干重比值檢測；取右肺中葉組織固定于10%福爾馬林溶液中，用于病理檢測；稱取右肺上葉組織，凍存于-80 ℃冰箱中，用于后續(xù)檢測。

2.4" 指標檢測

2.4.1" 濕熱證型病毒性肺炎模型評價指標" （1）一般情況及癥候積分：造模期間，每天觀察大鼠的飲食飲水、精神狀態(tài)、形體、皮毛、眼睛、肛門、大小便等，于每天下午造模結(jié)束后的17：00用電子秤測量大鼠體質(zhì)量。造模結(jié)束后參照文獻判斷濕熱證小鼠模型建立成功與否[12]，并按各項證候無、輕、中、重程度記為 0、1、2、3 分，統(tǒng)計記錄每只小鼠的證候積分，證候分類及積分設置如表1所示。

（2）血常規(guī)：血液細胞分析儀檢測大鼠紅細胞計數(shù)（red blood cell count， RBC）、白細胞計數(shù)（white blood cell count， WBC）、血紅蛋白（hemoglobin， HGB）、血小板計數(shù)（blood platelet， PLT）、淋巴細胞計數(shù)（lymphocyte count， LYM）、中性粒細胞計數(shù)（neutrophilicgranulocyte， NE）。

（3）血脂：用全自動生化分析儀檢測大鼠血清總膽固醇（cholesterol， CHOL）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol， LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol， HDL-C）的含量。

2.4.2" 肺泡毛細血管屏障變化情況" （1）肺組織的濕重干濕比（Wet weight/干重Dry weight， W/D）：將右肺下葉置于干重紙上測濕重，在80 ℃恒溫箱中干燥48 h得到干重，計算W/D比。（2）總細胞計數(shù)：用1 mL PBS重懸BALF沉淀物并使用移液管充分混合，向血細胞計數(shù)板中加入10 μL細胞懸液，在40×10放大倍數(shù)下計數(shù)細胞總數(shù)。（3）總蛋白濃度：參照試劑盒內(nèi)說明書，取BALF上清液，采用BCA蛋白測定法檢測BALF上清液中總蛋白濃度。

2.4.3" 肺組織病理學染色" 取大鼠右肺中葉組織用10%福爾馬林溶液固定，脫水，石蠟包埋，5 μm切片用HE染色進行病理學分析。

2.4.4" CCL3/CCR5通路相關因子" （1）實時熒光定量PCR檢測肺組織CCL3、CCR5、磷脂酶C（phospholi？鄄pase C， PLC）、蛋白激酶C（proteinkinase C， PKC）mRNA表達：使用RNA提取試劑盒提取肺組織總mRNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒合成cDNA。引物序列見表2。PCR體系各組分2×SYBR Green Mix：10 μL，上游引物（10 μmol/L）：0.4 μL，下游引物（10 μmol/L）：0.4 μL，模板：2 μL，加入滅菌蒸餾水至20 μL，以 GAPDH為內(nèi)參。反應程序為預變性 95 ℃ 10 min，變性95 ℃ 15 s，退火/延伸60 ℃ 1 min，變性、退火/延伸共45個循環(huán)，以2-ΔΔCt法得出mRNA表達量。

（2）Western blot檢測肺組織CCL3、CCR5、PLC、PKC蛋白表達：肺組織提取總蛋白后，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。將蛋白與上樣緩沖液按照4∶1的比例混合，100 ℃煮5 min，SDS-PAGE電泳后200 mA恒流電轉(zhuǎn)膜，封閉液封閉1 h。加入1∶1 000稀釋的CCL3、CCR5、PLC、PKC一抗，4 ℃搖床孵育過夜。洗膜后加二抗，室溫孵育1 h，再次洗膜后加入ECL發(fā)光液，在WB化學發(fā)光儀中顯影，照相。

2.5 統(tǒng)計學分析

用SPSS 23.對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計。正態(tài)分布數(shù)據(jù)用“ｘ±s”表示，當資料滿足正態(tài)分布、方差齊性檢驗時，組間比較采用采用one-way ANOVA。當資料不滿足方差齊性檢驗時，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。Plt;0.05為具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1" 各組大鼠一般情況及癥候積分比較

正常組大鼠一般情況良好，皮毛光滑亮澤，反應靈活，飲食、飲水均正常。模型組大鼠煩躁、抓撓頭面部頻率較高，呼吸加快，伴大便黏滯或溏泄，肛門紅腫污穢，食量、飲水量減少。給藥后，陽性藥物組大鼠煩躁、抓撓頭面部頻率減少，進食進水量略有增加。QWJR-M、QWJR-H大鼠癥狀與陽性藥物組相似，同時大便黏滯或溏泄伴臭穢，肛門紅腫污穢情況改善更為明顯。陽性藥組、QWJR-M及QWJR-H組較模型組降低明顯（Plt;0.01）。詳見表3。

3.2" 各組大鼠體質(zhì)量變化比較

與正常組相比，第9、11天QWJR-M大鼠體質(zhì)量降低（P＜0.05），其余時間點各組間大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。濕熱模型組、陽性藥物組、QWJR-L、QWJR-M、QWJR-H組大鼠體質(zhì)量增長趨勢低于正常組。詳見圖1。

3.3" 各組大鼠血常規(guī)值比較

與正常組相比，濕熱模型組大鼠的WBC和NE增加（Plt;0.05），HGB顯著下降（Plt;0.01）；與濕熱模型組相比，陽性藥物組大鼠LYM降低（Plt;0.05），陽性藥物組和QWJR-H組的大鼠HGB水平上升（P＜0.05），QWJR-H組NE顯著減少（P＜0.01）。詳見表4。

3.4" 各組大鼠血脂水平比較

與正常組相比，濕熱模型組大鼠CHOL、LDL-C升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，P＜0.05），濕熱模型組和QWJE-H組大鼠的HDL-C均顯著升高（P＜0.01）；與濕熱模型組相比，各給藥組CHOL顯著降低（P＜0.01），QWJR-H組大鼠LDL-C顯著降低（P＜0.05）。詳見表5。

3.5" 各組大鼠肺組織的W/D值

與正常組相比，濕熱模型組大鼠肺組織W/D值升高（P＜0.01）；與濕熱模型組相比，QWJR-M組、QWJR-H組大鼠肺組織W/D值降低（P＜0.01）。詳見表6。

3.6" 各組大鼠BALF沉淀中總細胞數(shù)比較

與正常組相比，模型組大鼠BALF沉淀中總細胞數(shù)升高（P＜0.01）；與濕熱模型組相比，給藥組大鼠BALF沉淀中總細胞數(shù)降低（P＜0.01）。詳見表7。

3.7" 各組大鼠BALF上清液中總蛋白濃度比較

與正常組相比，濕熱模型組大鼠BALF上清液中總蛋白濃度升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥物組、QWJR-M組、QWJR-H組大鼠BALF上清液中總蛋白濃度降低（P＜0.05，P＜0.01）。詳見表7。

3.8" 各組大鼠肺組織病理學改變

正常組大鼠肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，肺泡壁厚度正常，未見明顯肺間質(zhì)充血及炎性細胞浸潤；濕熱模型組肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)失常，肺泡壁彌漫性增厚、肺間質(zhì)可見炎性細胞浸潤，部分肺泡融合成大泡；陽性藥物及QWJR-H組干預后，大鼠肺組織病理學變化減輕。詳見圖2。

3.9" 各組大鼠肺組織CCL3/CCR5通路相關因子比較

3.9.1" 各組大鼠肺組織CCL3、CCR5、PLC、PKC mRNA表達量比較" 與正常組相比，濕熱模型組大鼠CCL3、CCR5、PLC、PKC mRNA表達量升高（P＜0.05，P＜0.01），陽性藥物組CCL3 mRNA表達量降低（P＜0.05）；與濕熱模型組比較，陽性藥物組、QWJR-M組、QWJR-H組大鼠CCL3 mRNA表達量降低（P＜0.05，P＜0.01），陽性藥物組、QWJR-H組大鼠CCR5 mRNA表達量降低（P＜0.05），各給藥組PLC mRNA表達量降低，差異有顯著性（P＜0.01），QWJR-H組大鼠PKC mRNA表達量降低（P＜0.05）；與陽性藥物組比較，QWJR各組大鼠CCL3 mRNA表達量升高（P＜0.05，P＜0.01）。詳見表8。

3.9.2" 各組大鼠肺組織CCL3、CCR5、PLC、PKC蛋白表達量比較" 與正常組相比，濕熱模型組CCL3、CCR5、PLC、PKC蛋白表達量升高（P＜0.05或P＜0.01），QWJR-L大鼠CCL3、PLC蛋白表達量升高（P＜0.05）；與濕熱模型組比較，陽性藥物組、QWJR-H組大鼠CCL3蛋白表達量降低（P＜0.05），陽性藥物組、QWJR-M組、QWJR-H組大鼠CCR5、PLC蛋白表達量降低（P＜0.05，P＜0.01），QWJR-H組大鼠PKC蛋白表達量降低（P＜0.05），陽性藥物組、QWJR-H組大鼠PKC蛋白表達量降低（P＜0.05，P＜0.01）。詳見表9、圖3。

4 討論

中國西南部邊界的云南省炎熱潮濕，居民偏好辛辣飲食，這樣的氣候特點和飲食習慣易造成脾胃功能障礙，濕邪累積，同時濕熱氣候適宜病毒等病原體的潛伏與擴散，內(nèi)外因素共同作用下，易于形成“濕熱疫”。在長期應對“濕熱疫”的臨床實踐中，云南中醫(yī)多運用“芳香辟穢”與“清熱化濕”藥物治療“濕熱疫”。清瘟解熱方由藿香、柴胡、黃芩、連翹、法半夏、炒厚樸、草果、白薇、茵陳、蜘蛛香、滑石、炒神曲和甘草共13味藥物組成，有清熱化濕、芳香辟穢、燥濕止瀉之功，符合治療“濕熱疫”的選方用藥要求。

《脾胃論·飲食勞倦所傷始為熱中論》中指出“飲食失節(jié)……脾胃乃傷”，提示過量攝入高脂肪食物會損傷脾胃功能。高脂飼料喂養(yǎng)小鼠，高脂飲食性質(zhì)黏膩，難以運化，濕濁中阻，郁久化熱，加之外濕熱環(huán)境，脾胃為濕熱之邪所困，氣機失調(diào)，運化失常，濕熱困脾，導致小鼠出現(xiàn)便溏，使得小鼠體質(zhì)量下降，濕熱下注，則易出現(xiàn)肛門紅腫、穢臭，且熱性炎上，挾胃氣上逆，進一步導致小鼠食量降低，體質(zhì)量下降。同時，濕熱證與血脂代謝異常緊密關聯(lián)，有研究表明，濕熱證條件下甘油三酯（triglycerides， TG）、CHOL及LDL-C水平呈現(xiàn)顯著升高趨勢[13-14]。長期處于濕熱環(huán)境并過量攝入高脂肪食物的小鼠，內(nèi)外濕熱相合積聚體內(nèi)，導致脾失健運，運化水濕、分清泌濁的功能失職，清瘟解熱方中具有芳香醒脾、燥濕健脾止瀉之功。且方中所用炒厚樸、蜘蛛香、神曲健脾助運、消食導滯、燥濕醒脾，脾胃得健，中焦?jié)駸岬靡赃\化，升清降濁功能得以恢復。甲潑尼龍是臨床被廣泛使用的糖皮質(zhì)激素藥物，在病毒性肺炎治療中具有良好療效[15]，對機體的生長、代謝以及免疫功能等發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，可在機體受到濕熱外邪入侵時，通過調(diào)動機體多種功能達到促進機體恢復正常的功效。故清瘟解熱方及甲潑尼龍干預后大鼠體質(zhì)量出現(xiàn)了增長，濕熱癥候積分明顯下降。與模型組相比，陽性藥物組及清瘟解熱方各劑量組大鼠血脂中CHOL水平顯著降低，清瘟解熱高劑量組LDL-C水平降低，提示清瘟解熱方的療效可能存在劑量依耐性。此外，模型組大鼠HDL-C平顯著提升，反映大鼠可能通過增強HDL-C的轉(zhuǎn)運能力，促進CHOL向肝臟轉(zhuǎn)移并代謝排出，以維護濕熱條件下的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)[16]。

《溫熱論·溫病大綱》曰“溫邪上受，首先犯肺”，肺為華蓋，位居高位，肺為嬌臟，清輕肅靜，不耐邪氣之侵犯。肺與外界相通，濕熱之邪從口鼻而入，首先犯肺。氣管滴注Poly（I：C）可致肺絡受損，影響肺之宣發(fā)肅降功能，使得體內(nèi)水液的輸布、運行和排泄功能失常。故可見HE染色肺組織結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為病毒性肺炎所致的肺損傷特征?！捌樯抵础?，內(nèi)外濕熱之邪郁遏中焦脾胃，脾失運化水飲；熱毒壅積于肺，耗氣傷津，煉液成痰，“肺為貯痰之器”，痰停聚于肺，肺主氣及宣發(fā)肅降功能失常，肺內(nèi)氣機逆亂，肺脾兩臟功能失調(diào)，機體津液輸布障礙，水液代謝失常，形成痰飲停積于肺。病毒性肺炎在病程中過度炎癥反應導致肺毛細血管損傷、通透性增加，誘發(fā)肺水腫甚至出血，大量炎性細胞浸潤，加劇了肺組織的病理損害[17]。清瘟解熱方干預后，可顯著降低炎性細胞、肺W/D值、BALF中總蛋白含量、總細胞數(shù)，改善肺組織病理損傷，清瘟解熱方可宣透肺熱，和解疫毒，暢運中軸樞機，宣上暢中，宣上導下，使上焦得通，濕熱得下，疏通經(jīng)絡郁結(jié)，對病毒性肺炎濕熱證肺損傷具有保護作用，且與劑量大小相關，以高劑量組效果明顯。此外，甲潑尼龍及高劑量清瘟解熱方干預后的大鼠血紅蛋白（hemoglobin，HGB）數(shù)量上升，提示清瘟解熱方可改善濕熱證病毒性肺炎大鼠缺氧狀態(tài)。血紅蛋白作為血液中攜帶氧氣的主要分子，其濃度的提升直接關聯(lián)于機體的氧合能力改善，進而可能緩解病毒性肺炎導致的呼吸困難和組織缺氧現(xiàn)象。

急性肺部感染引發(fā)的炎癥反應中，外周血的中性粒細胞與巨噬細胞遷移到肺部并活化，釋放炎性介質(zhì)和細胞毒性物質(zhì)，損害肺泡毛細血管結(jié)構(gòu)，導致通透性肺水腫和急性肺損傷[18]。CCL3又叫巨噬細胞炎性蛋白1-α（macrophage inflammatory protein 1α， MIP-1α），是一種重要的趨化因子，它可招募炎性細胞至感染區(qū)域，協(xié)同細胞因子介導感染進程。CCL3與CCR5受體結(jié)合，激活GPCR信號通路，分離異源三聚體G蛋白，形成ATP-Gα復合物PLC，研究發(fā)現(xiàn)，PLC-γ1在流感病毒感染過程中以病毒亞型和細胞類型特異性方式發(fā)揮多種作用[19-20]?；罨腉ap亞基同時級聯(lián)激活PKC可調(diào)控細胞增殖、凋亡、形態(tài)變化和受體表達等[21]。大量研究表明，PKC在不同病因誘導的急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征中發(fā)揮著重要作用[22-23]。病毒性急性肺損傷發(fā)生早期腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin， IL）-6、IL-23等前炎癥因子及趨化因子CCL3等釋放，通過CCR5等受體及其下游的PLC、PKC發(fā)揮肺泡巨噬細胞募集作用，導致肺實質(zhì)炎癥及損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，清瘟解熱方抑制CCL3/CCR5信號軸的激活，下調(diào)PLC和PKC的表達，表明清瘟解熱方可以通過抑制CCL3/CCR5信號通路改善病毒性肺炎大鼠肺損傷。

綜上所述，清瘟解熱方能有效降低濕熱證型病毒性肺炎大鼠濕熱癥候積分，改善大鼠體質(zhì)量下降狀況，改善肺泡毛細血管屏障，減輕肺損傷，其機制可能與抑制CCL3/CCR5信號通路有關。因清瘟解熱方的療效與劑量相關，接下需重點探索最合理有效的臨床治療劑量；可以結(jié)合網(wǎng)絡藥理學，進一步探索清瘟解熱方治療濕熱型病毒性肺炎的作用靶點及相關通路。

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