N端攜帶HBGAs受體結(jié)合表位的兔出血癥病毒嵌合VP60蛋白的表達(dá)及其免疫原性

摘要：將HBGAs受體結(jié)合表位插入兔出血癥病毒（RHDV）衣殼蛋白VP60的N端，分析嵌合VP60蛋白的表達(dá)及病毒樣顆粒（VLPs）形成情況，并研究N端HBGAs受體結(jié)合表位的插入對嵌合VP60 蛋白免疫原性的影響。通過VP60蛋白N端起始位點(diǎn)HBGAs受體結(jié)合表位的插入，獲得表位插入的VP60基因。利用Bac-to-Bac系統(tǒng)構(gòu)建桿狀病毒重組質(zhì)粒，命名為Bacmid-VP60-CR，轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞后，得到重組桿狀病毒rBac-VP60-CR，經(jīng)HA、IFA和Western Blot鑒定，結(jié)果顯示，重組蛋白VP60-CR在Sf 9昆蟲細(xì)胞中得到高效表達(dá)，電鏡觀察顯示其可形成與VP60類似的VLPs結(jié)構(gòu)。將重組蛋白免疫2月齡RHDV血清陰性的新西蘭兔，200 μg/只，免疫后每周采血檢測HBGAs表位抗體水平，同時在免疫后14 d，以RHDV WF株攻毒觀察VP60-CR重組蛋白的免疫保護(hù)效果。結(jié)果顯示，與VP60對照相比，VP60-CR蛋白可產(chǎn)生更高水平的針對HBGAs表位的抗體水平，且VP60-CR免疫兔可完全抵抗RHDV強(qiáng)毒的攻擊。本研究構(gòu)建了一種N端插入HBGAs受體結(jié)合表位的嵌合VP60蛋白，為研究高免疫原性兔出血癥基因工程疫苗抗原奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：兔出血癥病毒；VP60蛋白；HBGAs；病毒樣顆粒；免疫原性

中圖分類號：S855.3；S852.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）12-0183-04

兔出血癥（rabbit hemorrhagic disease，RHD）是由兔出血癥病毒（rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）引起的高發(fā)病率和死亡率的烈性傳染?。?］，可分為GI.1（RHDV1）和GI.2（RHDV2）2種基因型，分別引起兔出血癥1型和兔出血癥2型，2種基因型病毒間無法產(chǎn)生有效交叉保護(hù)［2-4］。研究發(fā)現(xiàn)，RHDV的衣殼蛋白VP60可在體外自組裝成不含核酸的病毒樣顆粒（VLPs），與天然的RHDV病毒粒子在物理形態(tài)上高度相似且具有良好的免疫原性。

VP60蛋白是RHDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，主要分為NTA區(qū)（N端臂，1～65 aa）、S結(jié)構(gòu)域（66～229 aa）、P結(jié)構(gòu)域（238～579 aa）和鏈接S與P結(jié)構(gòu)域的鉸鏈區(qū)（Hinge，230～237aa）。NTA區(qū)和S結(jié)構(gòu)域形成VLPs的內(nèi)殼，P結(jié)構(gòu)域位于VLPs的外表面，形成刺突結(jié)構(gòu)［5］。據(jù)報道，VP60 NTA區(qū)和S結(jié)構(gòu)域的抗原性較強(qiáng)，是P結(jié)構(gòu)域的10～100倍［6］。組織血型抗原（Histo-blood group antigens，HBGAs）是兔出血癥病毒的結(jié)合受體，與兔對病毒感染的敏感性相關(guān)［7］。筆者所在實(shí)驗室前期已鑒定出1個HBGAs受體結(jié)合位點(diǎn)為VP60蛋白的326～331位氨基酸（NPISQV）［8］，其抗原性的高低對于抵抗病毒感染可能具有重要作用。本研究在VP60 N端起始位點(diǎn)插入該表位，構(gòu)建了N端攜帶HBGAs受體結(jié)合表位的兔出血癥病毒嵌合VP60蛋白，并研究其VLPs形成能力和免疫原性，可為研究高免疫原性兔出血癥基因工程疫苗抗原奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌種和細(xì)胞 pFastbac1-VP60重組質(zhì)粒（GI.1型VP60）、Sf9昆蟲細(xì)胞由筆者所在實(shí)驗室保存；大腸桿菌 DH10 Bac，購自南京酶普利斯生物科技有限公司；大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）感受態(tài)，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑 DNA Marker DL 2 000、ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit試劑盒、ECL顯色試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；胎牛血清，購自GIBCO公司；FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，購自Biosharp公司；VP60單克隆抗體1D4由筆者所在實(shí)驗室制備保存；Taq高保真酶、脂質(zhì)體Lipofectamine 3 000和Grace培養(yǎng)基，購自invitrogen公司；1.1×PCR mix，購自南京擎科生物科技有限公司；人O型紅細(xì)胞取自南京某醫(yī)院；其他試劑均為國產(chǎn)分析純化。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計 擴(kuò)增和鑒定的特異性引物見表1。

1.2.2 HBGAs受體結(jié)合表位插入的重組轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建 筆者所在本實(shí)驗室保存的重組質(zhì)粒pFastbac1-VP60為模板，以VP60 CR-F/R引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增N端插入HBGAs受體結(jié)合表位的VP60基因。PCR反應(yīng)程序為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，65 ℃ 15 s，72 ℃ 7 min，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。將PCR反應(yīng)產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行鑒定，120 V電泳30 min后，回收PCR陽性產(chǎn)物，使用ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化后，獲得的陽性菌液經(jīng)pFastBac-F/R引物鑒定陽性后進(jìn)行測序鑒定，獲得正確插入的桿狀病毒重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-VP60-CR。

1.2.3 HBGAs受體結(jié)合表位插入的重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-VP60-CR轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB平板（含50 μg/mL卡那霉素、7 μg/mL慶大霉素、10 μg/mL四環(huán)霉素、100 μg/mL X-gal和40 μg/mL IPTG），37 ℃培養(yǎng)48 h后，挑取白色單菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。以 M13-F/R通用引物進(jìn)行PCR鑒定，獲得重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-VP60-CR。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 參照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000 說明書，將重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-VP60-CR轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后每日觀察細(xì)胞形態(tài)，待細(xì)胞出現(xiàn)直徑變大、變圓、脫落等明顯病變時收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，以1 000 r/min離心5 min收獲上清即為重組桿狀病毒（F1代病毒），命名為rBAC-VP60-CR。將F1代病毒液以1%體積比接種Sf9昆蟲細(xì)胞，接毒后48～72 h收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，離心取上清獲得F2代病毒液。

1.2.5 間接免疫熒光檢測（IFA） 在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，將重組桿狀病毒rBAC-VP60-CR接種到對數(shù)生長期的Sf9細(xì)胞，同時以感染野生型桿狀病毒的Sf9 細(xì)胞作陰性對照。在感染Sf9細(xì)胞24 h后，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，加入-20 ℃預(yù)冷的甲醇-丙酮固定液，4 ℃作用1 h；PBS洗滌3次，加入1 ∶200倍稀釋的1D4單抗，37 ℃作用1 h；PBS洗滌3次后，加入1 ∶100倍稀釋的FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，37 ℃下避光作用1 h；PBS洗滌3次，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6 SDS-PAGE和Western Blot檢測 將重組桿狀病毒rBAC-VP60-CR接種Sf9細(xì)胞，72 h后收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，經(jīng)5%脫脂乳封閉過夜，TBST洗滌3次后，以1D4單抗（1 ∶1 000）為一抗，羊抗鼠HRP-IgG（1 ∶10 000）為二抗，進(jìn)行Western Blot鑒定。

1.2.7 血凝效價測定 在96孔“U”形血凝板中每孔加入50 μL滅菌生理鹽水，然后在第1孔內(nèi)分別加入50 μL感染重組病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物，混勻后，吸取50 μL加入至第2孔中，如此連續(xù)稀釋至第15孔，第15孔吸取50 μL液體棄掉；第16孔為滅菌生理鹽水對照，同時以感染野生型桿狀病毒的Sf9 細(xì)胞作陰性對照；然后每孔加入50 μL 1%人O型紅細(xì)胞懸液，混勻，37 ℃下作用30 min后觀察結(jié)果。

1.2.8 電鏡觀察 對獲得的重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物以紅細(xì)胞吸附釋放法［9］進(jìn)行純化并超速離心，蛋白樣品VP60-CR經(jīng)生理鹽水重懸后取少量置于銅網(wǎng)靜置2 min，加入2%磷鎢酸染液，利用投射電鏡觀察重組蛋白樣品并拍照。

1.2.9 免疫原性研究 參照筆者所在實(shí)驗室前期建立的間接ELISA法［10］檢測免疫兔血清中HBGAs受體結(jié)合位點(diǎn)特異性抗體水平。以8 μg/mL谷胱甘肽磁珠純化的HBGAs表位蛋白作為包被抗原，5%脫脂乳為封閉液。每孔加入100 μL 1 ∶100倍稀釋的待檢兔血清，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌3次后，每孔加入100 μL 1 ∶10 000倍稀釋的羊抗鼠HRP-IgG，37 ℃ 避光孵育1.5 h，PBST洗滌3次后，每孔加入100 μL TMB顯色10 min，加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止液終止反應(yīng)，并于450 nm波長處檢測吸光度。

1.2.10 免疫保護(hù)性研究 將純化的VP60-CR蛋白稀釋至200 μg/mL，免疫兔出血癥病毒抗原和抗體均陰性的2月齡新西蘭兔5只，每只頸部皮下注射1 mL，同時以5只接種生理鹽水的新西蘭兔作為對照組。免疫后14 d，分別頸部皮下注射1 mL LD50的兔出血癥病毒，攻毒后連續(xù)觀察7 d，記錄家兔死亡情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組轉(zhuǎn)移載體和重組穿梭載體的鑒定

以重組質(zhì)粒pFastbac1-VP60為模板擴(kuò)增得到HBGAs表位插入的桿狀病毒重組轉(zhuǎn)移載體pFastbac1-VP60-CR。經(jīng)測序驗證后將重組轉(zhuǎn)移載體pFastbac1-VP60-CR轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，挑取白色單菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)M13通用引物進(jìn)行PCR鑒定，由圖1可知，擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為 4 000 bp，而陰性對照的擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為 300 bp，表明成功獲得重組穿梭載體Bacmid-VP60-CR。

2.2 間接免疫熒光檢測（IFA）

將重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞，感染24 h后，以RHDV單抗1D4為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，進(jìn)行IFA鑒定。由圖2可知，感染重組桿狀病毒的細(xì)胞具有很強(qiáng)的特異性熒光，而感染野生型桿狀病毒的Sf9昆蟲細(xì)胞無特異性熒光出現(xiàn)，說明VP60 CR 蛋白得到有效表達(dá)。

2.3 SDS-PAGE和Western-Blot鑒定

對感染重組桿狀病毒的Sf9 細(xì)胞樣品進(jìn)行 SDS-PAGE，轉(zhuǎn)印至PVDF膜后，以RHDV單抗1D4為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，進(jìn)行Western Blot鑒定。由圖3可知，在約60 ku處出現(xiàn)明顯的蛋白條帶，與預(yù)期大小一致，表明VP60-CR蛋白得到有效表達(dá)。

2.4 表達(dá)蛋白的血凝效價測定

將重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞，感染96 h后，以96孔“U”形血凝板對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行血凝效價測定。由表2可知，表達(dá)的重組蛋白能凝集人O型紅細(xì)胞，血凝效價為1 ∶4 096，表明VP60-CR蛋白得到高效表達(dá)。

2.5 電鏡觀察

由電鏡觀察結(jié)果（圖4）可知，表達(dá)蛋白可形成大小為35～40 nm、形態(tài)和結(jié)構(gòu)與兔出血癥病毒VP60蛋白類似的VLPs，說明HBGAs表位的插入不影響VP60蛋白病毒樣顆粒的組裝。

2.7 免疫原性檢測

參照前期建立的間接ELISA檢測方法，采用HBGAs蛋白包被板檢測兔血清中中和表位HBGAs抗體水平變化，結(jié)果（圖5）表明，VP60-CR重組蛋白可在兔體內(nèi)引發(fā)高水平抗HBGAs表位抗體，且抗體水平在21 d和28 d時顯著高于VP60對照組（Plt;0.05）。

2.8 免疫保護(hù)性檢測

將VP60-CR蛋白以紅細(xì)胞吸附釋放法進(jìn)行純化后，以200 μg/只的劑量免疫RHDV血清陰性的2月齡新西蘭兔，14 d后進(jìn)行攻毒，檢驗重組蛋白對家兔的免疫保護(hù)作用。由表3可知，以RHDV WF株攻毒，免疫組家兔獲得100%保護(hù)，而注射生理鹽水的對照組家兔全部死亡，表明表達(dá)的重組蛋白VP60-CR具有良好免疫保護(hù)性。

3 討論與結(jié)論

VP60作為RHDV的衣殼蛋白，可以自組裝成VLPs。因此，本研究對經(jīng)典RHDV VP60基因進(jìn)行表位改造后，利用BEVS系統(tǒng)，成功構(gòu)建了表位插入的重組桿狀病毒，經(jīng)IFA、SDS-PAGE、Western Blot、ELISA以及血凝試驗鑒定顯示，HBGAs表位插入的重組蛋白VP60-CR在Sf9細(xì)胞中得到了高效表達(dá)，電鏡觀察顯示可形成VLPs結(jié)構(gòu)，重組蛋白VP60-CR在兔體內(nèi)可產(chǎn)生高水平的抗HBGAs抗體，且能完全抵抗RHDV強(qiáng)毒的攻擊。

兔出血癥病毒VP60蛋白可自行組裝成VLPs，能準(zhǔn)確模仿病毒粒子的幾何形狀，是優(yōu)秀和安全的免疫原。VP60 NTA區(qū)和S結(jié)構(gòu)域組成VLPs的內(nèi)部區(qū)域，而P結(jié)構(gòu)域形成VLPs外部刺突結(jié)構(gòu)，該刺突結(jié)構(gòu)與免疫保護(hù)性直接相關(guān)，但抗原性較弱。前期研究顯示，VP60氨基酸的部分改變不影響VLPs的形成［5，11-12］，據(jù)此，本研究構(gòu)建了VP60 N端起始位點(diǎn)HBGAs表位插入的重組桿狀病毒，以該重組桿狀病毒感染 Sf9 細(xì)胞后表達(dá)的HBGAs表位插入的VP60 蛋白可自組裝成VLPs，表明該表位的插入不影響病毒樣顆粒的形成。經(jīng)間接ELISA檢測顯示，與VP60蛋白相比，VP60-CR重組蛋白可在兔體內(nèi)引發(fā)更高水平的抗HBGAs中和表位抗體，表明HBGAs受體結(jié)合表位的插入提高了抗原免疫的高效性和精準(zhǔn)性，同時也說明VP60蛋白的N端是高效的表位插入位置。此外，重組蛋白免疫的新西蘭兔能夠100%抵抗RHDV強(qiáng)毒的攻擊，表明HBGAs表位插入的VP60蛋白仍然具有良好的免疫保護(hù)性。

本研究構(gòu)建了N端攜帶HBGAs受體結(jié)合位點(diǎn)的兔出血癥病毒嵌合VP60蛋白，在形成VLPs結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，可引發(fā)更高水平的針對HBGAs表位的抗體水平，為研究高免疫原性兔出血癥基因工程疫苗抗原奠定了基礎(chǔ)。

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收稿日期：2023-08-17

基金項目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金［編號：CX（23）1028］；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（編號：CARS-43-C-1）。

作者簡介：董文宇（2000—），男，山東煙臺人，碩士研究生，主要從事畜禽疫病防控研究。E-mail：m18722279527@163.com。

通信作者：王 芳，博士，研究員，主要從事家兔重要疾病的病原學(xué)、快速診斷、流行病學(xué)、致病機(jī)理、疫苗研制、綜合防控技術(shù)等方面的研究，E-mail：rwangfang@126.com；熊富強(qiáng)，博士，副教授，主要從事大學(xué)生思想政治教育研究，E-mail：xiongfuqiang@njau.edu.cn。