應(yīng)用實(shí)驗(yàn)小動物高頻超聲評價小鼠2K1C腎動脈狹窄模型的研究

[摘要]"目的"探討應(yīng)用實(shí)驗(yàn)小動物高頻超聲評估小鼠腎動脈狹窄（renal"artery"stenosis，RAS）模型的方法。方法"選用C57B1/6J雄性小鼠，使用銀夾夾閉左側(cè)腎動脈制備RAS模型（RAS組，n=5），假手術(shù)組不夾閉左側(cè)腎動脈（n=5）。術(shù)后3d開始測量血壓。術(shù)后4周，應(yīng)用實(shí)驗(yàn)小動物高頻超聲影像系統(tǒng)于胸骨旁左室短軸乳頭肌水平記錄左心室運(yùn)動曲線，測量小鼠左心室前壁和后壁厚度，計(jì)算左心室質(zhì)量、射血分?jǐn)?shù)及左心室短軸縮短率；測量腎臟形態(tài)學(xué)參數(shù)（腎臟長度、寬度、厚度及腎皮質(zhì)厚度）和腎動脈血管壁厚度、阻力指數(shù)；二維斑點(diǎn)追蹤技術(shù)評價兩組小鼠右側(cè)腎動脈血管擴(kuò)張性及血管壁整體徑向應(yīng)變。術(shù)后4周觀察兩組小鼠腎臟病理。結(jié)果"與假手術(shù)組相比，RAS組小鼠的收縮壓顯著升高，左心室前后壁厚度及左心室質(zhì)量均顯著增加（P?0.05）。與假手術(shù)組相比，RAS組小鼠的左側(cè)腎臟長度、寬度、厚度及腎皮質(zhì)厚度均顯著減小（P?0.05），右側(cè)腎臟代償性增大、腎皮質(zhì)厚度增加，右側(cè)腎動脈血管壁顯著增厚，右側(cè)腎動脈血管擴(kuò)張性和血管整體徑向應(yīng)變均顯著降低（P?0.05）。結(jié)論"應(yīng)用實(shí)驗(yàn)小動物高頻超聲可無創(chuàng)檢測小鼠RAS模型的心臟、腎臟、腎血管損傷，并可分析腎動脈應(yīng)變等生物力學(xué)指標(biāo)，為小鼠RAS模型檢測提供新的方法。

[關(guān)鍵詞]"兩腎一夾模型；實(shí)驗(yàn)小動物高頻超聲；二維斑點(diǎn)追蹤技術(shù)；無創(chuàng)檢測；小鼠

[中圖分類號]"R544.14""""""[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]"A""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.34.013

Evaluation"of"mouse"2K1C"renal"artery"stenosis"model"by"high-frequency"ultrasound"in"experimental"small"animals

HUANG"Song1，"LIU"Lina2，"GAO"Qiuyue3，"XU"Qing2

1.State-owned"Assets"and"Laboratory"Management"Office，"Capital"Medical"University，"Beijing"100069，"China;"2.Core"Facilities"Centre，"Capital"Medical"University，"Beijing"100069，"China;"3.Department"of"Physiology"and"Pathophysiology，"School"of"Basic"Medical"Sciences，"Capital"Medical"University，"Beijing"100069，"China

[Abstract]"Objective"To"investigate"the"method"of"evaluating"renal"artery"stenosis"（RAS）"model"in"mice"by"high-frequency"ultrasound"in"experimentalnbsp;small"animals."Methods"C57B1/6J"male"mice"were"selected"and"left"renal"artery"was"clamped"with"silver"clip"to"prepare"RAS"model"（RAS"group，"n=5），"while"left"renal"artery"was"not"clamped"in"sham"operation"group"（n=5）."Systolic"blood"pressure"was"measured"3"days"after"surgery."Four"weeks"after"surgery，"the"left"ventricular"movement"curve"was"recorded"at"the"level"of"parasternal"left"ventricular"brachyaxis"papillary"muscle"by"high-frequency"ultrasound"of"experimental"small"animals，"mice"left"ventricular"anterior"wall"and"posterior"wall"thickness"were"measured，"left"ventricular"mass，"ejection"fraction"and"left"ventricular"short"axis"reduced"rate"were"calculate."The"renal"morphological"parameters"（kidney"length，"width，"thickness"and"cortical"thickness），"the"vascular"wall"thickness"and"resistance"index"of"renal"artery"were"measured."The"right"renal"artery"distensibility"and"global"radial"strain"of"the"vessel"wall"were"evaluated"by"two-dimensional"dot"tracking"technique."Renal"pathology"was"observed"4"weeks"after"surgery."Results"Compared"with"sham"operation"group，"systolic"blood"pressure，"left"ventricular"anterior"wall"and"posterior"wall"thickness"and"left"ventricular"mass"were"significantly"increased"in"RAS"group"（P?0.05）."Compared"with"sham"operation"group，"the"length，"width，"thickness"and"cortical"thickness"of"left"kidney"in"RAS"group"were"significantly"reduced"（P?0.05）."In"the"right"kidney，"the"compensation"increased，"the"thickness"of"the"renal"cortex"increased，"vascular"wall"of"right"renal"artery"was"significantly"thickened，"distensibility"and"global"radial"strain"of"right"renal"artery"were"significantly"reduced"（P?0.05）."Conclusion"The"application"of"high-frequency"ultrasound"in"experimental"small"animals"can"noninvasively"detect"the"damage"of"the"heart，"kidney"and"renal"vessels"in"RAS"model，"and"analyze"the"biomechanical"indexes"such"as"renal"artery"strain，"providing"a"new"method"for"the"detection"of"mouse"RAS"model.

[Key"words]"Two"kidneys"and"one"clip;"High-frequency"ultrasound"in"experimental"small"animals;"Two-dimensional"speckle"tracking"technique;"Noninvasive"detection;"Mice

腎動脈狹窄（renal"artery"stenosis，RAS）是臨床常見疾病，RAS患者發(fā)生慢性心血管和腎臟疾病的基本機(jī)制一直是研究熱點(diǎn)[1-2]。兩腎一夾（two"kidneys"and"one"clip，2K1C）動物模型（保留雙側(cè)腎臟，狹窄單側(cè)腎動脈）是經(jīng)典的RAS動物模型，用以研究腎血管性高血壓及心臟、腎臟、血管損傷的發(fā)病機(jī)制。病理檢測依舊是RAS模型心血管及腎臟損傷常用的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證手段，但其為侵入性檢查，且無法檢測器官的活體功能[3]。超聲檢查無創(chuàng)、無輻射，在觀察心臟、腎臟、血管結(jié)構(gòu)的同時還能評價其功能。本研究制備小鼠RAS模型，利用實(shí)驗(yàn)小動物高頻超聲無創(chuàng)檢測模型小鼠的心臟、腎臟、腎血管相關(guān)指標(biāo)，探究RAS后心臟、腎臟及腎血管損傷的超聲改變，并尋找可早期提示RAS損傷的指標(biāo)。

1""材料與方法

1.1""實(shí)驗(yàn)動物

選用C57B1/6J雄性小鼠，8周齡，10只。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)（倫理審批號：AEEI-2023-021），北京市實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格許可證編號：SCXK（京）2021-0006。

1.2""儀器

實(shí)驗(yàn)小動物高頻超聲成像系統(tǒng)（Vevo"2100"Imaging"System，"FUJIFILM"VisualSonics"Inc.，USA）；美國Visitech"System"BP-2000無創(chuàng)血壓儀。

1.3""模型制作

小鼠吸入異氟烷麻醉。俯臥位固定于手術(shù)臺上，背部左側(cè)切口，體視顯微鏡下鈍性分離左側(cè)腎動脈。RAS組使用內(nèi)徑0.2mm銀夾夾閉左側(cè)腎動脈，夾閉位置靠近主動脈。假手術(shù)組用同樣方法分離左側(cè)腎動脈，但不夾閉。RAS術(shù)后每周2次采用尾套法測量血壓。

1.4""超聲檢測

小鼠仰臥位固定于專用操作臺，異氟烷維持量為1.0%～1.5%。

1.4.1""心臟超聲檢測及評價指標(biāo)""使用中心頻率40MHz高頻寬帶電子線陣探頭，軸向分辨力和橫向分辨力分別為30μm和75μm，幀頻235fps。于胸骨旁左室短軸乳頭肌水平記錄左心室運(yùn)動曲線，測量左心室前壁和后壁厚度，計(jì)算左心室質(zhì)量、短軸縮短率及射血分?jǐn)?shù)。

1.4.2""腎臟超聲檢測及評價指標(biāo)""探頭置于左、右季肋區(qū)，獲取腎臟冠狀切面，測量腎上極與腎下極之間的距離，為腎臟長度，并于腎中部垂直于腎包膜測量腎實(shí)質(zhì)厚度。獲取腎門水平橫切面，沿腎臟橫軸測量腎門與腎外側(cè)緣之間的垂直距離，為腎臟寬度，并垂直于腎臟橫軸測量腎臟前緣與后緣之間的垂直距離，為腎臟厚度。

1.4.3""腎動脈超聲檢測及評價指標(biāo)""探頭置于中下腹，二維超聲顯示小鼠腹主動脈和腎動脈。調(diào)整探頭使超聲束垂直于腎動脈前后壁，測量腎動脈血管壁厚度。調(diào)整探頭與小鼠身體的夾角，使聲束入射角度?60°，應(yīng)用彩色多普勒顯示腎動脈主干，觀察管腔內(nèi)血流信號充盈情況。檢測夾閉側(cè)腎動脈時需反復(fù)微調(diào)腎動脈位置觀察血流信號；未夾閉側(cè)的腎動脈取樣容積置于血管中央最亮處，測量腎動脈阻力指數(shù)（renal"artery"resistance"index，RRI）。二維斑點(diǎn)追蹤（two-"dimensional"speckle"tracking，2D-ST）技術(shù)評價腎動脈應(yīng)變和擴(kuò)張性。二維超聲顯示清晰的右側(cè)腎動脈，啟動EKV模式，調(diào)整參數(shù)，存儲腎動脈主干長軸EKV二維動態(tài)圖像。手動勾畫血管壁邊界。應(yīng)用2D-ST技術(shù)血管壁追蹤檢測工具跟蹤血管壁的運(yùn)動變化。計(jì)算血管壁整體徑向應(yīng)變，并輸入血壓值，計(jì)算血管擴(kuò)張性。每個數(shù)據(jù)均測量3次取平均值。

1.5""腎臟病理

術(shù)后4周處死小鼠，取兩組小鼠雙側(cè)腎臟，10%中性緩沖福爾馬林固定，沿腎臟外側(cè)緣正中向腎門方向最大剖面取材，石蠟包埋。制備5μm厚的石蠟切片，蘇木精-伊紅染色。

1.6""統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS"17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布的以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ ）表示，比較采用t檢驗(yàn)。P?0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2""結(jié)果

2.1""兩組小鼠的收縮壓比較

與假手術(shù)組相比，RAS組小鼠的收縮壓顯著升高（P?0.05），見圖1。

2.2""兩組小鼠的心臟超聲參數(shù)比較

與假手術(shù)組相比，RAS組小鼠的左心室前壁和后壁厚度及左心室質(zhì)量均顯著增加（Plt;0.05），射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率有增加趨勢，但比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05），見表1、圖2。

2.3""兩組小鼠的腎臟超聲指標(biāo)比較

與假手術(shù)組相比，RAS組小鼠的左側(cè)腎臟長度、寬度、厚度及腎皮質(zhì)厚度均顯著減小（P?0.05），右側(cè)腎臟代償性增大、腎皮質(zhì)厚度增加（P?0.05），見表2、圖3。

2.4""小鼠腎動脈相關(guān)超聲指標(biāo)測定

小鼠腹主動脈短軸及腎動脈主干長軸圖像可清晰顯示，見圖4。兩組小鼠的右側(cè)腎動脈管壁清晰，血流信號充盈。RAS組小鼠的左側(cè)腎動脈可見銀夾位置強(qiáng)回聲，腎動脈主干管腔內(nèi)既無血流信號，也未探測到血流頻譜，提示腎動脈閉塞。兩組小鼠的右側(cè)腎動脈血管壁各部分以向量形式顯示的運(yùn)動速度均一，方向一致，見圖5。與假手術(shù)組小鼠右側(cè)腎動脈相比，RAS組小鼠右側(cè)的腎動脈血管壁顯著增厚，腎動脈血管擴(kuò)張性和血管整體徑向應(yīng)變均顯著降低（P?0.05），見表3。

2.5""腎臟組織病理學(xué)改變

RAS組小鼠的左側(cè)腎臟萎縮，腎小球硬化，間隔減少，腎小管萎縮，基底膜增厚，間質(zhì)可見炎癥細(xì)胞浸潤。右側(cè)腎臟顯著肥大，腎小球代償性肥大，腎小管上皮細(xì)胞肥大，管腔狹窄，見圖6。

3""討論

2K1C動物模型一側(cè)腎動脈狹窄，腎臟血流灌注減少，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活而發(fā)生腎血管性高血壓[4]。2K1C模型表現(xiàn)出人類腎血管疾病的多個特征，可準(zhǔn)確模擬人類高血壓疾病及其靶器官并發(fā)癥。

高血壓引起心臟結(jié)構(gòu)重構(gòu)[5-6]。本研究中RAS術(shù)后小鼠血壓升高，超聲顯示左心室明顯肥厚。血壓增高，左心室壓力負(fù)荷過重，心肌厚度增加以維持左心室的收縮壁應(yīng)力正常化[7]。與假手術(shù)組相比，RAS組小鼠左心室射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明這種向心性心肌肥大初期具有代償作用，心肌仍能維持正常功能。該階段的動物模型能較好地反映心力衰竭早期的病理生理變化。

2K1C模型表現(xiàn)出兩個腎臟表型的顯著差異：狹窄側(cè)腎臟進(jìn)行性萎縮，而對側(cè)腎臟代償性增大[8]。既往研究多關(guān)注狹窄側(cè)腎臟的變化及其發(fā)生機(jī)制，對側(cè)腎臟的研究甚少。暴露于嚴(yán)重高血壓的對側(cè)腎臟也可發(fā)展為高血壓腎功能障礙，導(dǎo)致終末期腎病[9]。腎臟大小一直是臨床評價腎臟疾病的重要參數(shù)[10]。相較于取材后測量腎臟大小，超聲檢查無創(chuàng)無輻射，可清晰顯示腎臟的輪廓。實(shí)驗(yàn)小動物高頻超聲影像系統(tǒng)分辨率高達(dá)30μm，可探測到活體小鼠萎縮的腎臟，為慢性血管閉塞所致的腎損傷提供依據(jù)。同時，超聲還檢測出對側(cè)腎臟體積增大，皮質(zhì)增厚。這種差異與慢性腎臟病有著特殊的相關(guān)性。代償性生長是慢性損傷、腎單位萎縮的前兆[11]。組織病理學(xué)也觀察到狹窄側(cè)腎小球萎縮及對側(cè)腎小球肥大和腎小管改變，這與臨床RAS患者的組織病理學(xué)改變相似[12]。

高血壓還可引起血管重構(gòu)[13]。血管順應(yīng)性降低和動脈管壁增厚可應(yīng)對更高的壓力和剪切力。本研究結(jié)果顯示，RAS術(shù)后暴露于高血壓下的對側(cè)腎動脈血管壁增厚，RRI雖有增高的趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測此階段對側(cè)腎功能處于代償階段，且高血壓期較短不足以影響阻力指數(shù)。小鼠右腎動脈形態(tài)直且長，調(diào)整探頭角度，容易采集到結(jié)構(gòu)清晰的右腎動脈圖像，具備應(yīng)用2D-ST技術(shù)檢測的良好圖像條件。2D-ST可辨認(rèn)血管壁上的聲學(xué)斑點(diǎn)，應(yīng)用空間與時間圖像處理算法逐幀追蹤斑點(diǎn)的幾何位置移動[14-15]。徑向應(yīng)變代表動脈在沿血管直徑的組織形變，被認(rèn)為能準(zhǔn)確反映血管彈性和順應(yīng)性[16]。本研究結(jié)果顯示，RAS小鼠術(shù)后4周對側(cè)腎動脈的RRI雖然還沒有顯著變化，但其生物力學(xué)指標(biāo)整體徑向應(yīng)變及與血壓高度相關(guān)的動脈擴(kuò)張性等指標(biāo)顯著降低，反映出高血壓下腎動脈血管壁伸縮運(yùn)動能力的下降。這些早期指標(biāo)的檢出有利于指導(dǎo)其他RAS常見模型機(jī)制的研究。

綜上所述，應(yīng)用實(shí)驗(yàn)小動物高頻超聲可無創(chuàng)測量并評價小鼠RAS模型的心臟、腎臟、腎血管損傷，2D-ST技術(shù)可評價受累腎血管應(yīng)變等生物力學(xué)指標(biāo)，支持實(shí)驗(yàn)小動物高頻超聲作為在體非侵入性評價小鼠腎動脈應(yīng)變的新興工具。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2024–09–14）

（修回日期：2024–11–11）