豬瘟病毒Erns蛋白原核表達(dá)及其多克隆抗體制備

摘要：【目的】制備豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）Erns蛋白多克隆抗體，為進一步研究Erns蛋白結(jié)構(gòu)和功能及解析CSFV的致病機理提供理論依據(jù)。【方法】采用生物信息學(xué)方法預(yù)測Erns蛋白結(jié)構(gòu)。以真核表達(dá)載體pCMV-HA-Erns為模板，PCR克隆CSFV Erns基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-32a-Erns。將pET-32a-Erns轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，添加IPTG誘導(dǎo)Erns蛋白表達(dá)，確定Erns蛋白表達(dá)形式。利用Ni-NTA親和層析法純化蛋白，以獲得高純度的Erns蛋白。采用背部皮下多點注射法免疫小鼠，經(jīng)4次免疫后采集小鼠血液，分離血清制備獲得Erns蛋白多克隆抗體，并檢測其效價和特異性?！窘Y(jié)果】Erns蛋白不含信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，為親水性蛋白，含有多個B細(xì)胞抗原表位；Erns基因片段大小為681 bp，其重組蛋白主要以包涵體形式表達(dá)；Erns蛋白多克隆抗體對原核表達(dá)的重組蛋白效價為1∶64000，對真核表達(dá)的重組蛋白效價為1∶1000，且能特異性識別CSFV?！窘Y(jié)論】制備獲得的Erns蛋白多克隆抗體具有效價高和特異性強等特點，可用于ELISA和Western blotting檢測細(xì)胞中Erns蛋白水平。Erns蛋白多克隆抗體的制備有助于更好地理解Erns蛋白在CSFV感染和免疫過程中的作用，對深入研究Erns蛋白功能、CSFV生物學(xué)特性及豬瘟的防治和診斷方法的開發(fā)具有重要意義。

關(guān)鍵詞：豬瘟病毒；Erns蛋白；原核表達(dá)；多克隆抗體

中圖分類號：S828.89文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：2095-1191（2024）09-2835-08

Prokaryotic expression ofErns protein of classical swine fever virus and preparation of its polyclonal antibody

SONG Dan-dan1，2，JIN Yi-xin1，2，HUANG Yuan-hui1，2，WANGWen-feng1，2，MIN Kai-jun1，2，ZHANG Chuan-liang1，2，LUO Ting-rong1，2*，LI Xiao-ning1，2*

（1College of Animal Science and Veterinary Medicine，Guangxi University，Nanning，Guangxi 530004，China；2Guangxi Engineering Research Center of Veterinary Biologics/Guangxi Key Laboratory of Livestock and PoultryBreeding and Disease Prevention and Control/Key Laboratory of Animal Disease Prevention and Control inGuangxi Universities，Nanning，Guangxi 530004，China）

Abstract：【Objective】The study aimed to prepare polyclonal antibody against the Erns protein of the classical swine fe-ver virus（CSFV），which could provide theoretical basis for further exploring the structure and function of the Erns pro-tein，as well as for elucidating the pathogenic mechanisms of CSFV.【Method】Bioinformatics methods were used to pre-dict the structure of the Erns protein.The CSFV Erns gene was cloned by PCR using the eukaryotic expression vector pCMV-HA-Erns as a template，and the prokaryotic expression vector pET-32a-Erns was constructed.The pET-32a-Erns vector was then transformed into Escherichia coli BL21（DE3）receptor cells，IPTG was added to induce the expression ofErns pro-tein，confirming the expression formofErns protein.The target protein was purified by Ni-NTA affinity chromatography toobtain high-purity Erns protein.Mice were immunized using the back subcutaneous multiple injection method，and after 4 immunizations，blood was collected to isolate serum for the preparation of polyclonal antibodies against the Erns protein，and their titer and specificity were assessed.【Result】The Erns protein lacked signal peptide and transmembrane domains，making it a hydrophilic protein that contained multiple B-cell epitopes.The size of the Erns gene fragment was 681 bp，and its recombinant protein was primarily expressed as inclusion bodies.The polyclonal antibodies against the Erns protein had titers of 1∶64000 for the prokaryotic expressed recombinant protein and 1∶1000 for the eukaryotic expressed recombinant protein，and they could specifically recognize CSFV.【Conclusion】The prepared polyclonal antibodies against the Erns pro-tein possess hightiter and strong specificity，making them suitable for detecting the expression levels of the Erns protein in cells using ELISA and Western blotting.The preparation ofErns protein polyclonal antibodies contributes to a better under-standing of the role of Erns protein in CSFV infection and immune processes.This has significant implications for further research into the function of Erns protein，the biological characteristics of CSFV，and the development of prevention and diagnostic methods for CSFV.

Key words：classical swine fever virus（CSFV）；Erns protein；prokaryotic expression；polyclonal antibody

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（32360869，31660722）；Guangxi Natural Science Foundation（2023GXNSFDA026043，2021GXNSFAA220007）

0引言

【研究意義】豬瘟是由豬瘟病毒（Classical swinefever virus，CSFV）引起的一種高發(fā)病率、高死亡率傳染病，具有急性、熱性、接觸性及全年性流行的特點，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失（楊曉穎等，2018），是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定必須上報的豬病之一，我國將其歸為二類動物疫病（陳紫昱等，2023；鄧俊花等，2023；Edwards et al.，2000）。在實際生產(chǎn)中，加強飼養(yǎng)管理、疫苗接種及加強疫病監(jiān)測等方法未能有效的控制豬瘟傳播（Mangen et al.，2001）。Erns蛋白是CSFV包膜蛋白中唯一具有RNA酶活性的蛋白，參與調(diào)節(jié)RNA的合成（Moormann et al.，2000）。在豬瘟感染過程中，Erns發(fā)揮著關(guān)鍵作用（Hulst etal.，1998）。研究表明，Erns具有特異性識別宿主細(xì)胞表面受體的能力，且該受體參與CSFV的侵染過程（Hulst etal.，1998）。因此，制備Erns蛋白多克隆抗體對CSFV的研究至關(guān)重要（李鵬等，2008；郭東光等，2014），能為研究Erns蛋白在CSFV感染和免疫過程中的作用及探究Erns蛋白的結(jié)構(gòu)與功能提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】經(jīng)典CSFV顆粒呈球形，具有二十面體核衣殼結(jié)構(gòu)，表面有包膜，是一種單鏈RNA病毒。CSFV基因組只有1個開放閱讀框（ORF）（Risatti et al.，2006；Fernandez-Sainz et al.，2015），編碼由3898個氨基酸組成的多聚蛋白。多聚蛋白可被宿主細(xì)胞蛋白酶進一步切割，產(chǎn)生4個結(jié)構(gòu)蛋白（C、Erns、E1和E2）和8個非結(jié)構(gòu)蛋白（Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B）（Li.et al.，2017）。其中，結(jié)構(gòu)蛋白Erns和E2抗原性較強，可在天然宿主體內(nèi)誘導(dǎo)中和抗體，產(chǎn)生保護性免疫（康愷，2015；Fernandez-Sainz et al.，2015；梅建國，2019）。CSFV的保護性免疫依賴于針對結(jié)構(gòu)蛋白E2和Erns產(chǎn)生的中和抗體，該理論已應(yīng)用于開發(fā)DIVA CSFV E2疫苗及其配套的基于Erns蛋白的ELISA（Panyasinget al.，2023）試劑盒。Erns蛋白又稱E0蛋白，由ORF編碼的227個氨基酸組成，存在9個潛在的糖基化位點，分子量44～48 kD（Wei et al.，2021）；Erns蛋白高度糖基化，約50%質(zhì)量由N-連接的糖基組成（Liu et al.，1998）。Erns是豬瘟病毒屬的特異性蛋白，常以通過二硫鍵連接的同源二聚體形式存在（Hong et al.，2023）；Erns蛋白可與多種類型細(xì)胞結(jié)合，在細(xì)胞培養(yǎng)過程能抑制CSFV和牛病毒性腹瀉病毒感染，提示Erns蛋白可能參與病毒附著或進入易感細(xì)胞的過程（Lin et al.，2005）；Erns蛋白參與CSFV的吸附和細(xì)胞自噬調(diào)控，且能通過與dsRNA/ssRNA結(jié)合而阻斷TLR3/TLR7信號傳導(dǎo)，進而抑制I型干擾素的合成（Honget al.，2023），引起持續(xù)性感染（Fatima et al.，2021）。Erns蛋白缺乏疏水跨膜區(qū)（Transmembrane region，TMR），與囊膜的結(jié)合較松散，在病毒囊膜上不穩(wěn)定，屬于可分泌蛋白，在CSFV感染的細(xì)胞上清、組織和血清中均能檢測到（Zhang et al.，2022）。Erns是CSFV重要的結(jié)構(gòu)蛋白，具有良好的免疫原性，能刺激機體產(chǎn)生中和抗體，可作為鑒別CSFV感染和標(biāo)記疫苗免疫抗體的靶抗原（孫永芳，2017）；除了作為CSFV的結(jié)構(gòu)蛋白之外，Erns也是一種功能性蛋白，具有核糖核酸酶（RNase）活性，參與調(diào)節(jié)感染細(xì)胞RNA合成，能誘導(dǎo)宿主免疫抑制和病毒毒力減弱（Lamothe-Reyes，2023）；Erns還具有免疫抑制活性，能誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的凋亡（Wang，2021）?！颈狙芯壳腥朦c】豬瘟病毒Erns蛋白在病毒感染過程中的表達(dá)及其與宿主蛋白的相互作用對豬瘟的檢測和預(yù)防至關(guān)重要，在實際生產(chǎn)中CSFV Erns抗體使用較多，但市場上尚缺乏商品化的CSFV Erns抗體?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過克隆Erns基因片段，構(gòu)建Erns蛋白原核表達(dá)載體，經(jīng)表達(dá)純化和復(fù)性濃縮后免疫小鼠制備Erns蛋白多克隆抗體，為進一步研究Erns蛋白的結(jié)構(gòu)和功能及解析CSFV的致病機理提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

豬瘟病毒石門株（Shimen strain）、原核載體pET-32a（+）、真核載體pCMV-HA、HEK-293T細(xì)胞、PK-15細(xì)胞和Erns蛋白真核表達(dá)載體pCMV-HA-Erns由廣西高校動物疫病預(yù)防與控制重點實驗室保存提供；ClonExpress II一步克隆試劑盒、抗β-Actin鼠單克隆抗體和HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG抗體購自艾比瑪特醫(yī)藥科技（上海）有限公司；蛋白酶抑制劑、脫脂奶粉、30%制膠液、1.0 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）、1.5 mol/L Tris-HCl（pH 8.8）和PAGE膠促凝劑購自北京索萊寶科技有限公司；堿性磷酸酶標(biāo)記馬抗小鼠IgG抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；強RIPA裂解液、Bradford法蛋白濃度測定試劑盒、DMEM、OPTI-MEM和LipofectamineTM 2000購自賽默飛世爾科技有限公司；TEMED購自上海麥克林生化科技有限公司；胎牛血清購自上海諾寧生物科技有限公司；TMB底物顯色液購自蘇州新賽美生物科技有限公司。

1.2試驗動物

35日齡SPF級雌性BALB/c小鼠購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司。動物試驗由廣西大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號GXU2019-021；并參照GB/T 35892—2018《實驗動物福利倫理審查指南》進行操作。

1.3蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用ProtScale預(yù)測Erns蛋白親疏水性；使用IEDB預(yù)測Erns蛋白抗原表位；運用SignalP-4.1和TMHMM-2.0分別預(yù)測Erns蛋白氨基酸序列是否含有信號肽和跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)。

1.4引物設(shè)計與合成

在GenBank下載Erns基因序列（KY816734.1），經(jīng)DNAMAN堿基序列比對后，采用Primer 5.0設(shè)計含BamH I和EcoR I酶切位點的引物（表1），委托南寧捷尼斯生物科技有限公司合成，上游引物命名為pET-32a-Erns-F，下游引物命名為pET-32a-Erns-R，擴增目的片段大小681bp。

1.5原核表達(dá)載體構(gòu)建

以pCMV-HA-Erns為模板，使用高保真酶對Erns基因進行PCR擴增。根據(jù)諾唯贊ClonExpress II一步克隆試劑盒說明及原核表達(dá)載體和目的基因濃度配制反應(yīng)體系進行一步克隆，轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌液PCR鑒定，將鑒定結(jié)果呈陽性的菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測序成功的菌液擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，采用限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I進行雙酶切鑒定。

1.6重組蛋白表達(dá)

以pET-32a-Erns轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，37℃搖床培養(yǎng)12h，涂板并挑取單克隆菌斑接種于含氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基（5 mL）中，37℃搖床培養(yǎng)至OD600 nm達(dá)0.4～0.6，然后按1∶100的比例接種于LB液體培養(yǎng)基（20 mL）中，培養(yǎng)至OD600nm達(dá)0.4～0.6時加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)8 h。取誘導(dǎo)前后的菌液各2 mL，離心收集菌體，使用200μL菌體裂解液重懸，細(xì)胞破碎儀充分破碎后12000r/min離心10min，取上清液、沉淀及破碎的全菌液各200μL，加入40μL蛋白上樣緩沖液，煮沸10 min，12000 r/min離心10 min。以空載質(zhì)粒pET-32a（+）菌液為對照進行SDS-PAGE檢測，考馬斯亮藍(lán)染色分析重組蛋白表達(dá)情況。

1.7重組蛋白純化

重組蛋白Erns以包涵體形式表達(dá)為主，采用包涵體尿素洗滌法進行重組蛋白純化，并進行復(fù)性處理。在構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒過程中，重組蛋白會融合載體pET-32a攜帶的多聚組氨酸（6×His）標(biāo)簽，可利用Ni2+金屬螯合親和層析法純化重組蛋白，以Ni-NTA樹脂為純化介質(zhì)，將純化收集到的樣品分別進行SDS-PAGE和Western blotting檢測。

1.8多克隆抗體制備

4只雌性BALB/c小鼠先飼養(yǎng)3 d以適應(yīng)新環(huán)境，參照趙祥秀等（2020）的方法，采用背部皮下多點注射法進行免疫，免疫周期按照1、7、21和35 d進行，共4次免疫，每次免疫150μg，一免為重組蛋白與弗氏完全佐劑等體積混合乳化，二免至四免為重組蛋白與弗氏不完全佐劑等體積混合乳化。四免后第7d眼球采血，分離血清并分裝儲存于-80℃冰箱。

1.9 Erns蛋白多克隆抗體效價和特異性檢測

以pCMV-HA-Erns轉(zhuǎn)化HEK-293T細(xì)胞，培養(yǎng)36 h后采用Western blotting檢測細(xì)胞中的Erns蛋白表達(dá)情況。使用原核表達(dá)的重組蛋白Erns包被ELISA板，進行ELISA檢測，以驗證抗體特異性。

2結(jié)果與分析

2.1 Erns蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

SignalP-4.1和TMHMM-2.0預(yù)測結(jié)果（圖1-A和圖1-B）顯示，Erns蛋白不含信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于分泌型蛋白；ProtScale預(yù)測Erns蛋白親/疏水性，評分大于0為疏水，小于0為親水，結(jié)果（圖1-C）顯示，Erns蛋白氨基酸序列中最大疏水值為1.189，為第147和148位氨基酸，是疏水性最強的氨基酸，最強親水性的氨基酸是第76位氨基酸，疏水值為-2.956，整條多肽鏈表現(xiàn)為親水性；IEDB預(yù)測抗原表位，閾值為0.5，結(jié)果（圖1-D）顯示，Erns蛋白存在多個B細(xì)胞抗原表位。

2.2 Erns基因擴增結(jié)果

以pCMV-HA-Erns為模板，利用引物pET-32a-Erns-F和pET-32a-Erns-R進行PCR擴增，結(jié)果（圖2）顯示，目的基因片段大小約為700bp，與預(yù)期結(jié)果相符。

2.3 Erns原核表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定結(jié)果

將Erns基因克隆至載體pET-32a（+）中BamH I和EcoR I多克隆位點，隨機挑取6個含有pET-32a-Erns的單克隆進行菌落PCR鑒定，結(jié)果（圖3-A）顯示，PCR產(chǎn)物大小約為700 bp，符合預(yù)期結(jié)果。用限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I對質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，酶切結(jié)果（圖3-B）與預(yù)期結(jié)果符合。將質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序結(jié)果正確。表明Erns基因已成功克隆到pET-32a載體上，原核表達(dá)載體pET-32a-Erns構(gòu)建成功。

2.4重組蛋白Erns表達(dá)形式鑒定結(jié)果

在大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白Erns，IPTG誘導(dǎo)濃度為0.5 mmol/L，誘導(dǎo)溫度為30℃。誘導(dǎo)后取2 mL菌液，收集總菌液、上清和沉淀進行SDS-PAGE及Western blotting（一抗為His單克隆抗體）檢測。結(jié)果（圖4）顯示，與未誘導(dǎo)重組菌相比，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后能明顯觀察到約40 kD的Erns蛋白條帶，且重組蛋白Erns主要以包涵體形式表達(dá)。

2.5重組蛋白Erns純化與鑒定結(jié)果

重組蛋白Erns攜帶His標(biāo)簽，使用Ni-NTA親和層析對其進行純化。使用不同pH 6.3和4.5的咪唑溶液洗脫蛋白，SDS-PAGE和Western blotting鑒定純化效果。結(jié)果（圖5）顯示，使用pH 4.5的咪唑溶液，約在40 kD處有目的條帶，表明成功獲得較高純度的重組蛋白Erns。

2.6 Erns蛋白多克隆抗體效價檢測結(jié)果

使用原核表達(dá)的重組蛋白Erns包被ELISA板以檢測Erns蛋白多克隆抗體效價。為直觀判定效價結(jié)果，以陰性血清A450 nm的2.1倍值建立參考線。結(jié)果（圖6）顯示，Erns蛋白多克隆抗體針對原核表達(dá)的重組蛋白Erns，在1∶64000稀釋度時A450 nm大于2.1倍陰性血清值，判定Erns蛋白多克隆抗體的最高效價為1∶64000。

2.7 Erns蛋白多克隆抗體特異性檢測結(jié)果

采用Western blotting驗證Erns蛋白多克隆抗體與純化的重組蛋白Erns是否發(fā)生反應(yīng)，結(jié)果（圖7-A）顯示，Erns多克隆抗體的特異性良好。按照說明將pCMV-HA-Erns轉(zhuǎn)化至HEK-293T細(xì)胞，培養(yǎng)36 h，收集蛋白樣品。將制備獲得的抗Erns蛋白多克隆抗體按1∶100、1∶500和1∶1000的比例稀釋，Western blotting檢測抗體效價，結(jié)果（圖7-B）顯示，Erns蛋白多克隆抗體能與蛋白Erns發(fā)生特異性反應(yīng)，其抗體效價可達(dá)1∶1000。用CSFV感染PK-15細(xì)胞，用制備的多克隆抗體進行免疫熒光檢測，結(jié)果（圖7-C）顯示，感染CSFV的PK-15細(xì)胞出現(xiàn)明顯的綠色熒光，未感染CSFV的PK-15細(xì)胞未出現(xiàn)綠色熒光，表明Erns蛋白多克隆抗體能特異性識別CSFV。

3討論

豬瘟在我國各地均有發(fā)生，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失（閭志峰，2017）。隨著CSFV C株疫苗株的問世（Luo et al.，2017）和豬場生物安全防控措施的加強，豬瘟在多數(shù)國家已被消滅，但在中國、印度和越南等養(yǎng)豬體量大的國家，仍存在慢性豬瘟和非典型豬瘟，且豬瘟的流行更加復(fù)雜多樣（Edwards et al.，2000）。Erns是CSFV重要的結(jié)構(gòu)蛋白，由227個氨基酸組成，經(jīng)糖基化處理后，其分子量增加，形成分子量約為96 kD的由二硫鍵連接形成的同源二聚體（李玉霄等，2020）。Erns蛋白在CSFV引起的免疫抑制過程中扮演著重要角色，其RNase活性不僅影響宿主細(xì)胞中病毒RNA的復(fù)制，還會抑制動物感染早期的防御功能。目前已知的針對Erns的CSFV特異性單克隆抗體存在一定局限性，制備多克隆抗體對CSFV不同毒株Erns蛋白的研究至關(guān)重要（李鵬等，2008；郭東光等，2014）。

本研究利用原核表達(dá)載體系統(tǒng)成功構(gòu)建了pET-32a-Erns，并到了高純度的重組蛋白Erns，與利用昆蟲細(xì)胞等真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)病毒蛋白相比，本研究使用的原核表達(dá)系統(tǒng)pET-32a（+）具有培養(yǎng)成本低、操作簡單、易于規(guī)?；a(chǎn)、經(jīng)濟和高效等特點（楊忠東和何成，2011），能在短期內(nèi)獲得大量的特異性抗體（耿抒賢等，2020）。此外，本研究在構(gòu)建原核表達(dá)載體時選用的一步克隆法，突破了傳統(tǒng)的雙酶切和連接過程，只需要一步重組法即可得到高效率克隆的重組載體。研究發(fā)現(xiàn)，利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)純化的抗原蛋白所制備的抗體具有更好的反應(yīng)活性和特異性（張傳亮等，2024）。因此，本研究建立的重組蛋白Erns原核表達(dá)系統(tǒng)能有效降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率（楊領(lǐng)弟等，2024）。本研究制備的Erns蛋白多克隆抗體效價為1∶64000，與賈俊杰等（2016）的研究結(jié)果相比，效價更高，提示其在體外試驗中具有更高的活性。進一步研究表明，Erns蛋白多克隆抗體不僅適用于ELISA檢測，在Western blotting檢測中也表現(xiàn)出色，稀釋度為1∶1000時即可檢測到目的蛋白條帶。

4結(jié)論

制備獲得的Erns多克隆抗體具有效價高和特異性強等特點，可用于ELISA和Western blotting檢測細(xì)胞中Erns蛋白水平。Erns多克隆抗體的制備有助于更好地理解Erns蛋白在CSFV感染和免疫過程中的作用，對深入研究Erns蛋白功能、CSFV生物學(xué)特性及豬瘟的防治和診斷方法的開發(fā)具有重要意義。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）