PCSK9 基因rs562556 多態(tài)性與急性心肌梗死患者冠狀動脈狹窄程度的關聯(lián)性分析

［摘 要］ 目的：分析急性心肌梗死 （AMI） 患者蛋白轉化酶枯草桿菌素/酶切蛋白9型 （PCSK9）基因 rs562556多態(tài)性與冠狀動脈狹窄程度的關聯(lián)性。方法：選取 2021年 1月—2022年 12月確診為AMI 患者200 例（AMI 組），選取同期200 例健康體檢者作為對照組。根據Gensini 評分標準將AMI 組患者按照其病變程度分為輕危組（Gensini 積分≤40 分， n=78） 和中高危組（Gensini 積分gt;40 分，n=122）。全自動生化儀檢測2 組研究對象血清中脂質代謝指標水平，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA） 法檢測2 組研究對象血清中PCSK9 水平，紫外分光光度法檢測2 組研究對象PCSK9 基因單核苷酸基因多態(tài)性（SNP），Spearman 相關性分析PCSK9 基因rs562556 多態(tài)性與疾病嚴重程度和患者血清中脂質代謝指標水平的相關性。結果：與對照組比較，AMI組吸煙患者百分率明顯升高（Plt;0. 01）。與對照組比較，AMI組患者血清中低密度脂蛋白膽固醇（LDL-c） 和PCSK9 水平均明顯升高（Plt;0. 05）；與輕危組比較，中高危組AMI 患者血清中LDL-c 和PCSK9 水平均明顯升高（Plt;0. 05）。對照組和AMI 組研究對象PCSK9 基因rs1800487 基因型分布符合Hardy-Weinberg （H-W） 遺傳平衡（χ2=0. 677， P=0. 713；χ2=0. 970，P=0. 831），與對照組比較，AMI 組患者血清中PCSK9 基因rs562556 基因型AA 與等位基因A 分布頻率明顯升高（Plt;0. 05）。輕危組和中高危組AMI 患者PCSK9 基因rs562556 基因型分布符合H-W 遺傳平衡（χ2=0. 045，P=0. 978；χ2=1. 290，P=0. 525），與輕危組比較，中高危組AMI患者血清中PCSK9 基因rs562556 基因型AA 與等位基因A 分布頻率明顯升高（Plt;0. 05）。PCSK9 基因rs562556 基因型AA 與AMI 嚴重程度（r=0. 193，P=0. 006） 和LDL-c 水平（r=0. 301，Plt;0. 01） 呈正相關關系，等位基因 A與 LDL-c水平 （r=0. 168，P=0. 017） 呈正相關關系。結論：PCSK9 基因rs562556 基因型AA 與AMI 患者冠狀動脈狹窄程度呈正相關關系，其多態(tài)性可能通過上調LDL-c 水平促進AMI 疾病發(fā)展。

［關鍵詞］ 急性心肌梗死； 基因多態(tài)性； 脂質代謝； 蛋白轉化酶枯草桿菌素/酶切蛋白9 型； 低密度脂蛋白膽固醇

［中圖分類號］ R542.22 ［文獻標志碼］ A

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI） 在臨床上表現(xiàn)為冠狀動脈急性、持續(xù)性缺血和缺氧引起的心肌壞死。全球每年死于AMI 的患者高達900 萬，我國心肌梗死的年死亡人數也高達50 余萬人［1］。流行病學數據［2］ 顯示：近年來AMI患者數量逐年升高，且越來越年輕化。因此，早診斷和早治療對AMI 患者尤為重要， 可以顯著提高患者預后水平，對AMI 發(fā)病風險及病情進行準確評估是降低AMI 死亡率的關鍵。心肌梗死的危險因素主要包括不可改變因素（如年齡、性別和家族史）、可變因素（如吸煙、飲酒、缺乏運動、不良飲食、高血壓、糖尿病、血脂異常和代謝綜合征）及其他因素［如C-反應蛋白（C-reactive protein，CRP）、纖維蛋白原、冠狀動脈鈣化（coronaryartery calcification，CAC）、同型半胱氨酸、脂蛋白a和低密度脂蛋白］ 異常［3］。研究［4-5］ 顯示：各種環(huán)境因素與部分遺傳多態(tài)性的相互作用可能導致AMI，如自噬相關5 （autophagy related 5， ATG5）中的一個單核苷酸基因多態(tài)性（single nucleotidepolymorphism， SNP） 位點rs190825454 突變與AMI 有密切關聯(lián)［6］。蛋白轉化酶枯草桿菌素/酶切蛋白9 型（proprotein converase subtilisin/keexintype 9，PCSK9） 是由PCSK9 基因編碼的絲氨酸蛋白酶，主要由肝臟產生，在腸道、心臟和胰腺等器官中均有表達。PCSK9 可以調節(jié)低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol， LDL-c）水平，且PCSK9 基因多態(tài)性與心血管事件發(fā)生有相關性［7］。但PCSK9 基因多態(tài)性與AMI 患者冠狀動脈狹窄程度是否有關尚未見相關報道。本研究探討PCSK9 基因rs562556 多態(tài)性與AMI 患者冠狀動脈狹窄程度的關系，并闡明其可能的機制，為早期預防AMI 提供參考。

1 資料與方法

1. 1 研究對象 選取 2021年 1月—2022年 12月齊齊哈爾醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院心內科因胸痛和胸悶癥狀入院，并進行心電圖和血清酶學檢查，確診為AMI 的患者200 例（AMI 組）。AMI 組患者平均年齡為56. 0 （23. 0～85. 0） 歲，其中男性134 例，女性66 例。選擇同期200 例健康體檢者作為對照組，平均年齡為56. 5（23. 0～89. 0） 歲，其中男性130例，女性70 例。AMI 患者符合《AMI 診斷和治療指南》診斷標準［8］：①胸痛通常發(fā)生在胸骨后或左胸部，持續(xù)20 min 以上， 呈劇烈壓榨性疼痛癥狀；②心電圖改變，伴左束支傳導阻滯，超急性期T 波改變和典型或非典型心肌梗死心電圖改變；③心肌酶譜天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）、肌酸激酶（creatine kinase， CK）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase， LDH）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzymes，CK-MB） 及α-羥丁酸脫氫酶（α-hydroxybutyrate dehydrogenase，HBDH） 水平均升高。再根據Gensini 評分標準［9］，將AMI 患者按照其病變程度分為輕危組（Gensini積分≤40 分，n=78） 和中高危組（Gensini 積分gt;40 分，n=122）。比較2 組研究對象一般資料。

1. 2 納入標準和排除標準 納入標準：①診斷為心肌梗死并入住冠心病監(jiān)護病房的患者； ② 年齡lt;80 歲； ③ 出現(xiàn)AMI 癥狀至入院時間≤12 h；④ 入院前1 個月內未服用降脂藥物； ⑤ 心電圖及其他臨床資料完整。排除標準： ① 年齡lt;18 歲；② 經皮冠狀動脈介入治療史；③伴有免疫系統(tǒng)疾病者；④并發(fā)心臟瓣膜病等心功能不全者；⑤患惡性腫瘤者。

1. 3 基 因 信 息 查 詢 通 過 人 類 基 因 組 計 劃（http：//grch37. ensembl. org/） 網站查詢人類PCSK9 基因rs562556 SNP 位點信息。等位基因型為G/A， 最小等位基因頻率（minor allelefrequency，MAF） 為0. 13，并位于PCSK9 基因編碼區(qū)?；蚍中涂煞譃橐吧虶G， 雜合突變型GA 和純合突變型AA。

1. 4 全自動生化儀檢測 2組研究對象血清中脂質代謝指標水平 入院后第 2 天清晨空腹靜脈抽血3～4 mL 至紅色促凝管， 采用全自動生化儀檢測2 組研究對象總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-c） 和LDL-c 水平，單位為mmol·L-1。

1. 5 酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 試 驗 （enzyme linkedimmunosorbent assay， ELISA）法檢測 2 組研究對象血清中 PCSK9水平 取所有研究對象入院后第2 天清晨5 mL 空腹靜脈血至含枸櫞酸鈉抗凝管，3 000 r·min－1 離心10 min， 棄上清取血漿。采用ELISA 法檢測血清中PCSK9 水平，按照試劑盒說明書操作（杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司）。繪制樣本標準曲線后，將待測樣本稀釋至100 μL，加入50 μ L 檢測抗體工作液后室溫孵育2 h， 加入100 μL 鏈霉親和素工作液， 室溫孵育45 min 后，洗滌， 顯色， 使用酶標儀檢測波長450 nm 處吸光度（A） 值。根據標準曲線計算血清中PCSK9 水平（單位：mg·L－1）。

1. 6 紫外分光光度法檢測2組研究對象PCSK9基因SNP 取所有研究對象入院后第2 天清晨5 mL空腹靜脈血至含枸櫞酸鈉抗凝管，3 000 r·min-1 離心10 min， 棄上清， 取血漿進行PCSK9 基因SNP檢測。采用Sigma-Aldrich 全血基因組DNA 提取試劑盒提取DNA，紫外分光光度法測定DNA 純度，利用PCR 進行PCSK9 基因擴增， PCSK9 基因rs562556 上游引物：5'-ATCACGCTCCCCTTTGGAAGTGCTC-3'， 下游引物： 5'-GCCGATGAGCTCACAGGCACATGTC-3'。擴增反應條件：94 ℃ 、3 min， 94 ℃ 、20 s， 56 ℃ 、30 s， 72 ℃ 、30 s， 循環(huán)40 次。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，確保待測樣本的準確性，將待測序樣品送至生工生物工程（上海） 股份有限公司進行純化測序。

1. 7 統(tǒng)計學分析 采用 SPSS 23. 0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。采用Shapiro-Wilk 檢驗計量數據是否符合正態(tài)分布。2 組研究對象血清中TC、TG、HDL-c 和LDL-c 水平及PCSK9 水平符合正態(tài)分布，以x±s 表示， 組間比較采用Student-t 檢驗。2 組研究對象年齡和體質量指數（body mass index，BMI） 不符合正態(tài)分布，以M （P25，P75） 表示，組間比較采用非參數秩和檢驗。采用SHEsis 在線分析軟件（http：//analysis.bio-x.cn/）進行Hardy-Weinberg（H-W） 平衡檢驗，以Pgt;0. 05 為基因型符合H-W平衡，表明該研究群體具有代表性。采用Spearman相關性分析PCSK9 基因rs562556 多態(tài)性與疾病嚴重程度和脂質代謝指標水平的相關性。所有計數資料均采用頻數（%） 表示，組間比較采用χ2 檢驗。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2. 1 2 組研究對象一般資料 與對照組比較，AMI 組患者性別、年齡、BMI 和飲酒患者百分率差異均無統(tǒng)計學意義（Pgt;0. 05），吸煙患者百分率明顯升高（Plt;0. 01）。見表1。

2. 2 2組研究對象血清中PCSK9和脂質代謝指標水平 與對照組比較，AMI組患者血清中 LDL-c和PCSK9 水平均明顯升高（Plt;0. 05），TC、TG 和HDL-c 水平差異均無統(tǒng)計學意義（Pgt;0. 05）。AMI患者中， 與輕危組比較， 中高危組AMI 患者血清中LDL-c 和PCSK9 水平均明顯升高（Plt;0. 05），TC、TG 和HDL-c 水平差異均無統(tǒng)計學意義（Pgt;0. 05）。見表2 和3。

2. 3 2組研究對象PCSK9基因rs562556基因型與等位基因分布特征 對照組和 AMI 組研究對象PCSK9 基因rs562556 基因型分布符合H-W 遺傳平衡（ χ2=0. 677，P=0. 713；χ2=0. 970，P=0. 831）。與對照組比較， AMI 組患者血清中PCSK9 基因rs562556 基因型AA 與等位基因A 分布頻率明顯升高（Plt;0. 05）。AMI 患者中， 輕危組和中高危組AMI 患者血清中PCSK9 基因rs562556 基因型分布符合H-W 遺傳平衡（χ2=0. 045， P=0. 978； χ2=1. 290，P=0. 525）。與輕危組比較，中高危組AMI患者血清中PCSK9 基因rs562556 基因型AA 與等位基因A 分布頻率明顯升高（Plt;0. 05）。見表4 和5。

2. 4 PCSK9 基因 rs562556多態(tài)性與 AMI患者冠狀 動 脈 狹 窄 程 度 和 LDL-c 水 平 的 相 關 性 Spearman 相關性分析結果顯示： AMI 患者中，PCSK9 基因rs562556 基因型AA 與AMI 患者冠狀動脈狹窄程度（r=0. 193， P=0. 006） 和LDL-c水平（r=0. 301，Plt;0. 01） 呈正相關關系，等位基因A 與LDL-c 水平（r=0. 168， P=0. 017） 呈正相關關系。見表6。

3 討 論

AMI 的病因包括血管狹窄、心肌缺血、缺氧和冠狀動脈粥樣硬化引起的心肌損傷，因此積極控制動脈粥樣硬化至關重要。脂質代謝異常在冠狀動脈粥樣硬化的進展、鈣化斑塊的形成和惡化中起重要作用［10］。血清TC 和LDL-c 水平異常升高與中年動脈粥樣硬化的發(fā)展有關聯(lián)［11］。此外，高TG 水平和低HDL-c 水平也是心血管疾病的重要標志［12］。AMI的急性期反應包括膽固醇合成增加和LDL-c 受體活性增加，導致LDL-c 水平降低［13］。姜宏磊等［14］報道了80 例AMI 患者入院后血脂水平的動態(tài)變化，結果顯示：AMI 患者血清中除脂蛋白a 和HDL-c 外的所有脂質代謝指標水平均降低。趙珺等［15］ 發(fā)現(xiàn)：早期AMI 患者血脂水平較高。黎村艷等［16］ 發(fā)現(xiàn)：AMI、不穩(wěn)定型心絞痛和穩(wěn)定型心絞痛患者血清LDL-c 水平比較無明顯差異。本研究結果顯示：與健康體檢者比較，AMI 患者發(fā)病24 h 內血清中僅LDL-c 水平明顯升高，TC、TG 和HDL-c 水平差異均無統(tǒng)計學意義。與上述研究結果不一致，原因可能是研究對象群體數量不同，且大部分是相對較小的群體，導致統(tǒng)計結果出現(xiàn)誤差，且不同研究中患者AMI 疾病發(fā)展時期不同。因此，脂質代謝指標水平是心血管疾病的重要影響因素，需要重點關注。

研究［17］ 顯示：降脂可降低冠狀動脈疾病患者首次或復發(fā)心血管事件的風險， 并提高患者生存率。盡管臨床上有全面的冠狀動脈疾病診療指南，但AMI 患者的降脂治療效果不佳。高水平LDL-c是心血管疾病的關鍵危險因素，LDL-c 水平越低，心血管風險分級也越低［18］。臨床上他汀類藥物作為治療高脂血癥的常規(guī)藥物，大多數情況下能夠有效降低LDL-c 水平［19］。然而， 長期使用可能會導致肝功能異常和橫紋肌溶解等。近年來， PCSK9 被認為是一個很有前景的調節(jié)脂質代謝的治療靶點。即使在患者接受最大劑量他汀類藥物治療的情況下，PCSK9 抑制劑仍可降低血清中LDL-c 水平［20］。PCSK9 抑制劑不僅能夠通過降低LDL-c 水平預防心血管疾病，在胰島素抵抗和血栓等疾病中也可發(fā)揮治療作用［21］。抑制PCSK9 對動脈粥樣硬化脂質代謝指標、動脈粥樣硬化和不良心血管事件產生有利影響， 因此， 開發(fā)針對高危心血管疾病患者PCSK9 靶點治療新方法的熱度持續(xù)增加。

基因多態(tài)性是指在一個生物群體中，同時存在2 種或多種不連續(xù)的變異基因型或等位基因，可能會導致部分個體的患病風險較其他個體更高，甚至影響生理代謝過程， 引起疾病發(fā)生。研究［22-23］ 顯示： 心血管疾病在不同群體中發(fā)生的風險差別較大。在載脂蛋白APOE 基因多態(tài)性變異群體中，高LDL-c/HDL-c 比值與冠心病的發(fā)生密切相關。PCSK9 作為調節(jié)脂質代謝的潛在治療靶點， 其基因多態(tài)性與心血管疾病和AMI 的相關性是目前重點研究內容。研究［24］ 顯示：PCSK9 基因的E670G多態(tài)性與冠心病患病風險升高有關，尤其是在中國群體中。PCSK9 基因突變與LDL-c 水平的變化有關， LDL-c 是冠狀動脈疾病的危險因素［24］。除E670G 多態(tài)性外， PCSK9 基因rs562556 變異也是一種功能獲得突變。研究［25］ 發(fā)現(xiàn)： rs562556 基因G 等位基因與重癥瘧疾患者更高的生存率有關，PCSK9 抑制劑可用于初級心血管疾病預防。本研究結果顯示：PCSK9 基因rs562556 的AA 基因型與AMI 患者冠狀動脈狹窄程度呈正相關關系，且該基因型與LDL-c 水平也呈正相關關系。此外，rs562556 的等位基因A 僅與LDL-c 水平呈正相關關系，與AMI 患者冠狀動脈狹窄程度無相關性，這可能是由于等位基因G 突變率較低且本研究樣本量不夠大所導致的。本研究發(fā)現(xiàn)PCSK9 基因SNP 位點rs562556 的等位基因A 頻率越高的患者發(fā)生中高危AMI的可能性更高，這可能與LDL-c水平升高有關。

綜上所述， PCSK9 基因rs562556 多態(tài)性與AMI 患者LDL-c 水平變化有關， 且攜rs562556 等位基因A 的AMI 患者發(fā)生中高危冠狀動脈狹窄可能性更高，本研究結果可為臨床早期干預治療AMI和降低中高危冠狀動脈狹窄發(fā)生率提供參考。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：劉園園參與論文選題、研究設計和論文撰寫，才奇博和楊秀靜參與數據收集，曲妍參與論文選題和審校，關榮春和劉燦君參與數據整理及統(tǒng)計學分析。

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