濃縮生長因子聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片的生物學(xué)性能及其在骨缺損修復(fù)中的作用

［摘 要］ 目的：探討濃縮生長因子 （CGF） 對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 （BMSCs） 膜片性能的影響，并闡明含CGF復(fù)合細(xì)胞膜片（CS）在骨缺損修復(fù)中的作用。方法：體外實驗，選取2只3周齡SD大鼠，分離培養(yǎng)獲得BMSCs，茜素紅和油紅O 染色鑒定BMSCs 成骨和成脂能力。選取3 只3 周齡SD 大鼠，制備CGF 液態(tài)提取物（CGFe），將細(xì)胞分為對照組、傳統(tǒng)CS （BMSC-CS） 組和含CGF 復(fù)合CS （CGF/BMSC-CS） 組。HE 染色觀察2 組CS 形態(tài)表現(xiàn)，茜素紅和堿性磷酸酶（ALP） 染色檢測各組CS 體外成骨情況，細(xì)胞劃痕實驗檢測各組細(xì)胞遷移能力，實時熒光定量PCR （RT-qPCR） 法檢測各組細(xì)胞中ALP、膠原酶Ⅰ型（COL-1）、Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 （RUNX2） 和骨鈣蛋白（OCN） mRNA 表達(dá)水平。體內(nèi)實驗，選取15 只SD 大鼠隨機分為對照組、BMSC-CS 組和CGF/BMSC-CS 組，顯微計算機斷層掃描（Micro-CT） 檢測各組大鼠顱骨缺損處骨形成參數(shù)，HE 染色和Masson 染色觀察各組大鼠顱骨缺損組織形態(tài)表現(xiàn)。結(jié)果：第3代BMSCs為梭形，排列緊密，呈漩渦團簇狀生長；茜素紅染色有明顯的鈣結(jié)節(jié)生成，油紅O 染色有紅色脂滴形成，證實細(xì)胞具有良好的成骨和成脂分化的能力。CS 為白色半透明狀，邊緣輕微卷曲，剝離后的CS 卷曲皺縮為不規(guī)則狀。與BMSC-CS 組比較，CGF/BMSC-CS 組CS 白色更深，透明程度較低，在厚度和延展性方面明顯增加，不易破損，有一定黏性和可塑性。HE染色觀察，與BMSC-CS組比較，CGF/BMSC-CS 組CS 細(xì)胞數(shù)增加，排列密集，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM） 更豐富，包裹連接細(xì)胞形成一個整體的片狀結(jié)構(gòu)。茜素紅和ALP 染色檢測，與對照組比較，BMSC-CS組CS的ALP 活性和礦化提升值均明顯升高（Plt;0. 05）；與對照組和BMSC-CS 組比較，CGF/BMSC-CS 組CS 成骨細(xì)胞及紅色礦化結(jié)節(jié)數(shù)明顯增多，染色明顯加深，陽性面積增大，ALP活性和礦化提升值均明顯升高（Plt;0. 05）。細(xì)胞劃痕實驗檢測，培養(yǎng)24 h，與對照組比較，BMSC-CS 組和CGF/BMSC-CS 組細(xì)胞遷移率均明顯升高（Plt;0. 05）； 與BMSC-CS 組比較， CGF/BMSC-CS 組細(xì)胞遷移率明顯升高（Plt;0. 01）；培養(yǎng)48 h，與對照組比較，CGF/BMSC-CS組細(xì)胞遷移率明顯升高（Plt;0. 05）。RT-qPCR 法檢測，與對照組比較，BMSC-CS 組細(xì)胞中COL-1 和OCN mRNA 表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 01），CGF/BMSC-CS 組細(xì)胞中ALP、COL-1、OCN 和RUNX2 mRNA 表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 01）；與BMSC-CS 組比較，CGF/BMSC-CS 組細(xì)胞中ALP、COL-1 和OCN mRNA 表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 01）。Micro-CT 檢測，對照組大鼠顱骨缺損區(qū)域邊界清晰，幾乎無新骨生成；BMSC-CS 組大鼠顱骨僅在骨缺損邊緣有少量新骨形成，缺損中心區(qū)域有明顯空缺；CGF/BMSC-CS 組大鼠顱骨新骨沿骨缺損邊緣向中心區(qū)域生成， 修復(fù)大部分骨缺損； 與對照組比較， BMSC-CS 組大鼠顱骨骨體積分?jǐn)?shù)［骨體積（BV） /組織體積（TV）］ 和骨小梁間距（Tb. N） 均明顯升高（Plt;0. 05），CGF/BMSC-CS 組大鼠顱骨BV、BV/TV、骨小梁數(shù)目（Tb. Th）和Tb. N均明顯升高（Plt;0. 05）；與BMSC-CS 組比較，CGF/BMSC-CS 組大鼠顱骨BV、BV/TV、Tb. Th 和Tb. N 均明顯升高（Plt;0. 01）。HE 和Masson 染色觀察，對照組大鼠顱骨缺損組織幾乎無新骨生成，僅見大量膠原纖維連接兩側(cè)骨斷端；BMSC-CS 組大鼠顱骨缺損組織僅在骨缺損邊緣有少量新骨形成，中央為致密的膠原纖維與缺損邊緣的新生骨連接；CGF/BMSC-CS 組大鼠顱骨缺損組織除在骨缺損邊緣可以看到新生骨組織外，缺損中央亦有骨島形成，骨島周圍可見骨細(xì)胞及大量的膠原纖維。Masson 染色觀察，細(xì)胞質(zhì)和類骨質(zhì)呈紅色，膠原呈藍(lán)色；CGF/BMSC-CS組大鼠顱骨缺損組織中可見明顯的新形成的類骨質(zhì)，新骨形成量最高。結(jié)論：CGF可以促進(jìn)BMSCs 膜片的成骨分化和ECM 的豐富度，含CGF 復(fù)合CS 可以高效修復(fù)大鼠顱骨缺損，是一種理想和安全的促骨再生材料。

［關(guān)鍵詞］ 濃縮生長因子； 細(xì)胞膜片； 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 骨缺損再生修復(fù)

［中圖分類號］ R78 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

近年來， 細(xì)胞膜片（cell sheet， CS） 技術(shù)被廣泛應(yīng)用于骨缺損的再生修復(fù)， 其克服了傳統(tǒng)細(xì)胞用于組織工程時的缺點， 如胰酶消化造成的細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞間連接蛋白減少、細(xì)胞存活率低及細(xì)胞活性不足等［1］。CS 包含大量種子細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix， ECM）， ECM 作為內(nèi)源性支架可以增加細(xì)胞生物活性，其緊密的片狀結(jié)構(gòu)使細(xì)胞保存狀態(tài)完好，細(xì)胞存活率高且分布均勻，具有較好的黏附和增殖能力，從而提高了修復(fù)骨缺損的能力。目前，CS 技術(shù)已被用于修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨、骨、牙周韌帶、角膜、血管和心肌的損傷［2-3］。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem"cells， BMSCs） 因其易獲得性、增殖能力強和成骨分化效果好等優(yōu)點，是最常用的種子細(xì)胞之一。AKAHANE 等［4］ 成功構(gòu)建大鼠BMSCs 膜片， 植入大鼠皮下部位6 周后，在移植處發(fā)現(xiàn)礦化基質(zhì)和活躍的成骨細(xì)胞，證實CS 的成骨性能良好。

生長因子在骨缺損再生中起著關(guān)鍵作用，將生長因子或小分子物質(zhì)復(fù)合至膜片中可以提高其成骨能力。QI 等［5］ 將富血小板血漿（platelet-richplasma，PRP） /磷酸鈣（calcium phosphate，CaP）復(fù)合物作用于CS，證實其具有更強的促進(jìn)骨缺損修復(fù)的能力。濃縮生長因子（concentrated growthfactor， CGF） 是繼PRP 和富血小板纖維蛋白（platelet rich fibrin，PRF） 之后第三代血小板濃縮物，是富含高濃度生長因子的自體纖維蛋白支架，有利于干細(xì)胞的附著［6］。CGF 可通過變速離心法制備，避免血液中的生長因子受到破壞并完全分離血液中的各種細(xì)胞成分，因此能夠獲得濃度極高的各種生長因子， 主要包括轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1， TGF-β1）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） 和胰島素樣生長因子1 （insulin like growthfactor-1，IGF-1） 等，相關(guān)內(nèi)源性生長因子具有協(xié)同效應(yīng)和級聯(lián)效應(yīng)，明顯影響細(xì)胞的增殖、分化和遷移［7-8］。本研究通過維生素C 誘導(dǎo)BMSCs 形成CS，即傳統(tǒng)CS （BMSC-CS），同時在成膜誘導(dǎo)過程中加入CGF，構(gòu)建復(fù)合CS （CGF/BMSC-CS），分析2 種CS 的細(xì)胞活性、組織結(jié)構(gòu)和體內(nèi)外成骨能力， 探討CGF 對BMSCs 膜片生物學(xué)性能的影響，并闡明其在骨缺損再生修復(fù)應(yīng)用中的潛能。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物、主要試劑和儀器 5 只 2～3 周齡SD 大鼠，體質(zhì)量50～100 g，15 只7～8 周齡SD 大鼠，體質(zhì)量200～250 g，購自長春億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司，實驗動物使用許可證號：SYXK（吉） 2023-0010。實驗動物飼養(yǎng)于吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物房中，環(huán)境清潔，恒溫恒濕，定期消毒和通風(fēng)，實驗前所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。本研究經(jīng)過吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會批準(zhǔn)（倫理審批號： 2022450）， 實驗過程均符合實驗室動物倫理準(zhǔn)則。胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）購自杭州四季青公司， 磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS） 購自美國Gibco公司，α-MEM培養(yǎng)基和DMEM 高糖培養(yǎng)基購自美國HyClone公司，抗壞血酸購自美國Sigma 公司，TRIzol 裂解液購自日本TaKaRa 公司。CGF 變速離心機購自北京創(chuàng)英科技有限公司， 超凈工作臺購自日本AIRTECH 公司，PCR 儀購自瑞士Roche 公司。

1. 2 大鼠 BMSCs分離、培養(yǎng)和鑒定 取 2只 3周齡SD 大鼠，頸椎脫臼法處死，75% 乙醇溶液浸泡10 min。剝?nèi)テっ?，取雙側(cè)股骨和脛骨，于超凈臺上剪除兩端骨骺端，用1 mL 無菌注射器吸取含1%雙抗和10% FBS 的α -MEM 培養(yǎng)基， 反復(fù)沖洗3 次，直至骨髓腔變白，收集骨髓沖出液，反復(fù)吹打使骨髓組織均勻分布。于37 ℃、5% CO2和100%飽和濕度環(huán)境細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h 待細(xì)胞貼壁完全后首次換液，以后每2～3 d 換液。約6～8 d 后細(xì)胞生長至培養(yǎng)皿80%～90%，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取第3 代BMSCs，以2×106 mL-1的細(xì)胞密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，含10% FBS 的α-MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，至細(xì)胞生長至80% 融合時， 將培養(yǎng)基更換為含50 mg·L-1 維生素C、10 mmol·L-1 β-甘油磷酸鈉、10 nmol·L-1 地塞米松和10%FBS 的DMEM 高糖培養(yǎng)基成骨誘導(dǎo)液，成骨誘導(dǎo)21 d 后，PBS 緩沖液沖洗， 4% 多聚甲醛溶液固定30 min，1% 茜素紅染液染色3～5 min，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞成骨情況并拍照。更換成脂誘導(dǎo)液， 誘導(dǎo)3 周， PBS 緩沖液沖洗， 4% 多聚甲醛溶液固定30 min，油紅O 染色3～5 min，倒置顯微鏡下觀察脂滴形成情況并拍照。

1. 3 CGF液態(tài)提取物（CFG liguid extracts，CGFe）制備 3只3周齡SD大鼠，1%戊巴比妥鈉麻醉，腹主靜脈采血并置于變速離心機內(nèi)離心，加速30 s，2 700 r·min-1、 2 min； 2 400 r·min-1、 4 min；2 700 r·min－1、4 min； 3 000 r·min-1、3 min， 減速36 s 后停止。離心后血液樣本分為3 層， 上層為PRP，中層為富含生長因子的淡黃色凝膠樣CGF，下層為紅細(xì)胞（red blood cell，RBC） 層。剪取中間凝膠層，PBS 緩沖液沖洗，-80 ℃冷凍1 h，解凍后于4 ℃ 下， 230 g 離心5 min， 然后加入5 mLα-MEM 培養(yǎng)基，37 ℃孵育24 h，400 g 離心5 min。收集5 mL 上清液， 0. 22 μm 過濾器過濾， 作為CGFe［9］。根據(jù)HONDA 等［10］ 的研究方法， 選擇促進(jìn)BMSCs 成骨分化的最佳濃度10% CGFe 進(jìn)行后續(xù)實驗。

1. 4 細(xì)胞分組和培養(yǎng) 選擇第 3 代 BMSCs，以2×106 mL-1 的細(xì)胞密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。將細(xì)胞分為對照組、BMSC-CS 組和CGF/BMSCCS組。待細(xì)胞密度達(dá)到70%～80% 時，對照組僅用高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)， BMSC-CS 組更換為含100 mg·L-1維生素C 和10% FBS 的高糖DMEM培養(yǎng)基成膜誘導(dǎo)液， CGF/BMSC-CS 組加入含10%CGF 的成膜誘導(dǎo)液， 每2～3 d 換液， 連續(xù)培養(yǎng)14 d，孔底可見白色膜片形成，用細(xì)胞刮刀小心獲取完整膜片用于后續(xù)實驗。

1. 5 HE染色觀察 2組 CS形態(tài)表現(xiàn) CS成熟后，吸棄培養(yǎng)液，獲取完整膜片，PBS 緩沖液沖洗3 次，4% 多聚甲醛固定4 h， PBS 緩沖液再次沖洗3 次，掃描記錄其大體形態(tài)。隨后常規(guī)脫水，石蠟包埋，組織學(xué)切片，HE 染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察2 組CS 形態(tài)表現(xiàn)并記錄。

1. 6 茜素紅和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色檢測各組 CS 體外成骨情況 獲取 CS，PBS 緩沖液沖洗3 次， 4% 多聚甲醛固定30 min，PBS 緩沖液再次沖洗3 次， 分別進(jìn)行茜素紅和ALP 染色， 顯微鏡下觀察各組CS 體外成骨情況，采用Image J 軟件分析吸光度（A） 值， 計算各組CS 礦化提升值和ALP 活性。礦化提升值= 茜素紅染色實驗孔A 值/茜素紅染色對照孔A 值；ALP活性=ALP 染色實驗孔A 值/ALP 染色對照孔A 值。

1. 7 細(xì)胞劃痕實驗檢測各組細(xì)胞遷移能力 在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板底部等間距畫出3 條平行直線，將P3 代BMSCs 消化后，均勻接種至6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔5×105個，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞長滿孔底時，用200 μL 滅菌槍頭沿標(biāo)記劃直線，PBS 緩沖液小心沖洗后更換為成膜培養(yǎng)基，0、24 和48 h 后觀察拍照， 采用Image J 軟件檢測細(xì)胞遷移面積，計算各組細(xì)胞遷移率，代表各組細(xì)胞遷移能力。細(xì)胞遷移率= （0 h 劃痕面積-24 h 或48 h 劃痕面積） /0 h 劃痕面積×100%。

1. 8 實 時 熒 光 定 量 PCR（real-time fluorescencequantitative PCR，RT-qPCR）法檢測各組細(xì)胞中ALP、膠 原 酶 Ⅰ 型（collegenase type 1，COL-1）、Runt 相 關(guān) 轉(zhuǎn) 錄 因 子 2（runt-related transcriptionfactor 2，RUNX2）和骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）mRNA 表達(dá)水平 分別提取各組細(xì)胞總 RNA，DEPC 水溶解， Nanodrop 測定RNA 濃度， 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA， SYBR 法擴增， 以GAPDH 作為內(nèi)參，采用2—ΔΔCt 法計算各組細(xì)胞中成骨相關(guān)因子ALP、COL-1、RUNX2 和OCN mRNA 表達(dá)水平， 至少3 次獨立重復(fù)實驗。引物序列見表1。

1. 9 大鼠顱骨缺損模型制備和膜片植入 15 只7～8 周齡SPF 級雄性SD 大鼠，體質(zhì)量（250±25）g，隨機分為對照組、BMSC-CS組和CGF/BMSC-CS組，每組5 只。清潔環(huán)境飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水，定期環(huán)境消毒。腹腔注射2% 戊巴比妥鈉麻醉大鼠，仰臥位固定大鼠四肢， 脫去頭部毛發(fā)， 消毒頭皮部位，鋪巾完畢，在無菌條件下利用手術(shù)刀片沿顱中縫作長約2 cm 的縱形切口，切開皮膚、皮下組織、肌層和骨膜層，鈍性分離暴露顱骨骨板，建造全層圓形缺損，不損傷硬腦膜。用外科電動空心環(huán)鉆于顱骨制備直徑為5 mm、厚度為1 mm 的全層圓形骨缺損，操作過程中利用生理鹽水持續(xù)沖洗。對照組大鼠不放置任何材料， 其余2 組大鼠放置等量BMSC-CS 和CGF/BMSC-CS，填充整個圓形骨缺損區(qū)，對位縫合傷口。

1. 10 顯 微 計 算 機 斷 層 掃 描（micro-computedtomography，Micro-CT）檢測各組大鼠顱骨缺損處骨形成參數(shù) 術(shù)后6周處死大鼠，10%多聚甲醛固定48 h。進(jìn)行Micro-CT 掃描， 三維重建。選擇所制備的5 mm×1 mm 顱骨缺損區(qū)為感興趣區(qū)域（region of interest， ROI） 進(jìn)行掃描， 獲取各組大鼠顱骨骨體積（bone volume， BV）、骨體積分?jǐn)?shù)［BV/組織體積（tissue volume，TV）］、骨小梁數(shù)目（trabecular number， Tb. N） 和骨小梁間距（trabecular thickness，Tb. Th）。

1. 11 HE 染色和 Masson 染色觀察各組大鼠顱骨缺損組織形態(tài)表現(xiàn) 將大鼠顱骨標(biāo)本使用 EDTA脫鈣50 d，石蠟包埋，制備成5 μm 厚的切片。HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖像，觀察新生骨組織形態(tài)表現(xiàn)。Masson 染色，切片按照Masson 染液套裝說明書進(jìn)行操作，封片，倒置相差顯微鏡下觀察骨組織形態(tài)表現(xiàn)并采集圖像。

1. 12 統(tǒng)計學(xué)分析 采用 GraphPad Prism 9. 0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。各組CS 礦化提升值和ALP 活性，各組細(xì)胞遷移率和BMSC-CS及CGF/BMSC-CS成骨相關(guān)基因mRNA 表達(dá)水平， 各組大鼠顱骨缺損處骨形成參數(shù)均符合正態(tài)分布，以x±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用Student’s t 檢驗。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 大鼠BMSCs鑒定 倒置顯微鏡下可見第3代BMSCs 為梭形， 排列緊密， 呈漩渦團簇狀生長；茜素紅染色有明顯的鈣結(jié)節(jié)生成，油紅O 染色有紅色脂滴形成，證實細(xì)胞具有良好的成骨和成脂分化的能力。見圖1。

2. 2 2組 CS形態(tài)表現(xiàn) CS為白色半透明狀，邊緣輕微卷曲， 剝離后的CS 卷曲皺縮為不規(guī)則狀。與BMSC-CS 組比較， CGF/BMSC-CS 組CS 白色更深，透明程度較低，在厚度和延展性方面明顯增加，不易破損，有一定黏性和可塑性。HE 染色結(jié)果顯示：與BMSC-CS 組比較，CGF/BMSC-CS 組CS 細(xì)胞數(shù)增加，排列密集，ECM 更豐富，包裹連接細(xì)胞形成一個整體的片狀結(jié)構(gòu)。見圖2 和3。

2. 3 各組 CS 體外成骨情況 與對照組比較 ，BMSC-CS 組CS 的ALP 活性和礦化提升值均明顯升高（Plt;0. 05）。與對照組和BMSC-CS 組比較，CGF/BMSC-CS 組CS 的成骨細(xì)胞及紅色礦化結(jié)節(jié)數(shù)明顯增多，染色明顯加深，陽性面積增大，ALP 活性和礦化提升值均明顯升高（Plt;0. 05）。見圖4～7和表2。

2. 4 各組細(xì)胞遷移率 培養(yǎng)24 h，與對照組比較，BMSC-CS 組和CGF/BMSC-CS 組細(xì)胞遷移率均明顯升高（Plt;0. 05）； 與BMSC-CS 組比較， CGF/BMSC-CS 組細(xì)胞遷移率明顯升高（Plt;0. 01）。培養(yǎng)48 h，與對照組比較，BMSC-CS 組細(xì)胞遷移率升高， 但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0. 05）， CGF/BMSC-CS 組細(xì)胞遷移率明顯升高（Plt;0. 05）；與BMSC-CS 組比較，CGF/BMSC-CS 組細(xì)胞遷移率升高， 但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0. 05）。見圖8和表3。

2. 5 各 組 細(xì) 胞 中 ALP、COL-1、Runx2 和 OCNmRNA 表達(dá)水平 與對照組比較，BMSC-CS 組細(xì)胞中COL-1 和OCN mRNA 表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 01），ALP 和RUNX-2 mRNA 表達(dá)水平升高，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0. 05）；CGF/BMSC-CS 組細(xì)胞中ALP、COL-1、OCN 和RUNX-2 mRNA 表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 01）。與BMSC-CS 組比較， CGF/BMSC-CS 組細(xì)胞中ALP、COL-1 和OCN mRNA 表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 01）， RUNX-2 mRNA 表達(dá)水平升高， 但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0. 05）。見表4。

2. 6 各組大鼠顱骨缺損處骨形成參數(shù) 對照組大鼠顱骨缺損區(qū)域邊界清晰， 幾乎無新骨生成；BMSC-CS 組大鼠顱骨僅在骨缺損邊緣有少量新骨形成， 缺損中心區(qū)域有明顯空缺； CGF/BMSCCS組大鼠顱骨新骨沿骨缺損邊緣向中心區(qū)域生成，修復(fù)大部分骨缺損。與對照組比較，BMSC-CS 組大鼠顱骨BV/TV 和Tb. N 均明顯升高（Plt;0. 05），BV 和Tb. Th 升高， 但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0. 05），CGF/BMSC-CS 組大鼠顱骨BV、BV/TV、Tb. Th 和Tb. N 均明顯升高（Plt;0. 05）。與BMSC-CS 組比較， CGF/BMSC-CS 組大鼠顱骨BV、BV/TV、Tb. Th 和Tb. N 均明顯升高（Plt;0. 01）。見圖9 和表5。

2. 7 各組大鼠顱骨缺損組織形態(tài)表現(xiàn) 選取骨缺損邊緣略靠近中間部位進(jìn)行放大， 兩側(cè)為骨缺損邊緣， 中心為骨缺損區(qū)域。HE 染色觀察可見，對照組大鼠顱骨缺損組織幾乎無新骨生成， 僅見大量膠原纖維連接兩側(cè)骨斷端；BMSC-CS 組大鼠顱骨缺損組織僅在骨缺損邊緣有少量新骨形成，中央為致密的膠原纖維與缺損邊緣的新生骨連接；CGF/BMSC-CS 組大鼠顱骨缺損組織除在骨缺損邊緣可以看到新生骨組織外， 缺損中央亦有骨島形成， 骨島周圍可見骨細(xì)胞及大量的膠原纖維。Masson 染色可見細(xì)胞質(zhì)和類骨質(zhì)呈紅色， 膠原呈藍(lán)色。CGF/BMSC-CS 組大鼠顱骨缺損組織中可見明顯的新形成的類骨質(zhì)， 新骨形成量最高。見圖10 和11。

3 討 論

CS 是一種新型培養(yǎng)和獲取細(xì)胞的方法，而機械法是目前制備干細(xì)胞膜片最簡單的一種方法［2，11］。CS 可以保留一個相對完整的ECM，從而通過旁分泌作用促進(jìn)周圍細(xì)胞的生長和增殖［12］。同時ECM 儲存了大量生長因子和功能性蛋白，參與細(xì)胞與細(xì)胞和細(xì)胞與組織之間的信號傳遞，提供并維持細(xì)胞微環(huán)境，對細(xì)胞功能至關(guān)重要。CS 是一種具有發(fā)展前景的基于細(xì)胞的治療方法，在骨組織修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［13-14］。然而，傳統(tǒng)的細(xì)胞膜片存在細(xì)胞分化能力不足、可塑性差和成骨能力欠缺等缺點，尤其是由于缺乏可靠的血液供應(yīng)，無法滿足大面積骨缺損的再生修復(fù)［15-16］。因此， 提高CS 的均勻性，促進(jìn)微血管網(wǎng)絡(luò)的形成和ECM 的發(fā)展是CS 制備的主要目標(biāo)［17-18］。

研究［19］ 顯示： 10% CGF 能明顯促進(jìn)BMSCs的增殖和成骨分化。本研究采用10% CGFe 作用于細(xì)胞， 促進(jìn)BMSCs 增殖、成骨向分化和ECM 分泌， 彌補傳統(tǒng)CS 的不足。本研究結(jié)果顯示： 與BMSC-CS 組比較， CGF/BMSC-CS 組CS 在韌性及厚度方面更有優(yōu)勢，方便獲取緊密連接的完整膜片，含有更多數(shù)量的細(xì)胞，ECM 更加豐富，加強了細(xì)胞與細(xì)胞的連接及信號通路作用。同時豐富的ECM 包裹細(xì)胞連成一個整體結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞的生長、增殖和分化提供良好的支架，有利于細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用。

ALP 作為成骨細(xì)胞分化的標(biāo)志物， 最先出現(xiàn)于細(xì)胞礦化的早期階段，可作為早期成骨標(biāo)志物，鈣鹽水平代表了骨細(xì)胞增殖、分化和骨組織的成骨潛能， 因此采用ALP 染色和茜素紅染色分別評價早期和晚期成骨作用［19-20］。本研究中茜素紅和ALP染色結(jié)果顯示： CGF/BMSC-CS 組成骨細(xì)胞及鈣化結(jié)節(jié)數(shù)最多，提示其成骨能力較強。與BMSCCS組比較，CGF/BMSC-CS 組ALP 活性和礦化提升值明顯升高，提示CGF 在整個成骨過程中均促進(jìn)了BMSCs 的成骨分化，維持了成骨誘導(dǎo)的連續(xù)性。細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果顯示： CGF 可以有效促進(jìn)BMSCs 的增殖和遷移，提高細(xì)胞的再生修復(fù)作用。CGF/BMSC-CS 通過上調(diào)成骨相關(guān)基因ALP、COL-1、OCN 和RUNX-2 mRNA 表達(dá)， 促進(jìn)BMSCs 的增殖和成骨分化，其中對ALP 的上調(diào)作用最為明顯，可能是由于豐富的ECM 提供了良好的成骨微環(huán)境。

三維重建圖和HE 及Masson 染色結(jié)果顯示：CGF/BMSC-CS 組大鼠顱骨缺損處新骨不僅沿骨缺損邊緣形成， 同時在缺損中心區(qū)域也有新骨單獨形成。一般情況下， 誘導(dǎo)骨形成的細(xì)胞主要來源于骨缺損區(qū)的邊緣， 新骨主要從骨缺損周圍逐漸向中心發(fā)展［21］。本研究結(jié)果顯示： CGF/BMSC-CS 組大鼠顱骨缺損處形成了不與缺損邊緣相連的新骨， 提示CGF 不僅促進(jìn)BMSCs 的成骨向分化，同時也促進(jìn)BMSCs 生成新骨并促進(jìn)新骨成熟。本研究結(jié)果顯示：CGF/BMSC-CS 組CS 對新生骨形成和成熟均具有促進(jìn)作用， CGF/BMSC-CS 組大鼠顱骨缺損組織新生骨周圍也存在新生血管， CGF 中包含CD34 陽性細(xì)胞及VEGF、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growthfactor， bFGF）、基 質(zhì) 金 屬 蛋 白 酶（matrixmetalloproteinase， MMP）-2 和MMP-9 等多種血管生成生長因子， 可以刺激受損血管生成， 為組織再生提供足夠的營養(yǎng)、生長因子、礦物質(zhì)和氧，血液的供應(yīng)有利于成骨，證實CGF 具有指導(dǎo)骨再生和促進(jìn)局部血管化的雙重作用， 在一定程度上彌補了傳統(tǒng)CS 因缺乏血液供應(yīng)導(dǎo)致的骨再生能力不足［22-24］。

研究［25］ 顯示：CGF 中IGF-1 可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞ECM 的合成。本研究結(jié)果顯示：ECM 豐度升高提示CGF 可能通過IGF-1 促進(jìn)BMSCs 的ECM 合成；同時ECM 蛋白可結(jié)合并儲存CGF 釋放出的生長因子，調(diào)節(jié)其在細(xì)胞中的分布、激活和呈遞，達(dá)到長期的效果。此相互作用可能是CGF/BMSCCS表現(xiàn)出良好成骨能力的原因之一。

綜上所述， CGF 可以提供細(xì)胞增殖和分化所需的因子，促進(jìn)ECM 分泌，CGF/BMSC-CS 復(fù)合膜片具有適宜的厚度，增強了可塑性，且細(xì)胞成骨向分化明顯，細(xì)胞狀態(tài)良好，ECM 豐富，同時具備了較強的骨再生能力，是一種理想和安全的促骨再生材料。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：石劍虹參與文獻(xiàn)檢索、實驗設(shè)計、實驗操作、數(shù)據(jù)整理和論文撰寫，田原野、陳楷、孫高和吳國民參與文獻(xiàn)檢索及論文審校。

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