大黃酚對H2O2誘導EA.hy926 細胞凋亡的改善作用及其機制

［摘 要］ 目的：探討大黃酚對過氧化氫（H2O2）誘導EA. hy926細胞氧化損傷的作用，并闡明其對支氣管肺發(fā)育不良（BPD）的治療作用及其相關機制。方法：分別采用25、50、100、200、400、800和1 600 μmol·L-1 H2O2及0、8、16、32、64、128 和256 μmol·L-1大黃酚誘導EA. hy926 細胞，CCK-8法檢測不同濃度H2O2 和大黃酚處理后EA. hy926 細胞活性。將細胞分為對照組、模型組（200 μmol·L-1H2O2）、低劑量大黃酚組（8 μmol·L-1大黃酚和200 μmol·L-1 H2O2） 和高劑量大黃酚組（256 μmol·L-1大黃酚和200 μmol·L-1 H2O2）。Western blotting 法檢測各組細胞質和細胞核中凋亡誘導因子（AIF） 蛋白表達水平，免疫熒光法檢測各組細胞AIF 核轉位情況，試劑盒檢測各組細胞中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-8及Caspase-9水平。結果：不同濃度H2O2 作用下，EA. hy926 細胞呈倒置S 形細胞活性曲線，細胞活性良好，半數(shù)抑制濃度（IC50） 為261. 52 μmol·L-1，采用200 μmol·L-1 H2O2 干預24 h 誘導建立細胞模型。隨著大黃酚藥物濃度升高，EA. hy926 細胞活性無明顯變化（Pgt;0. 05）， 采用8 和256 μmol·L-1 大黃酚進行細胞干預。Westernblotting 法檢測，與對照組比較，模型組細胞核中AIF 蛋白表達水平明顯升高（Plt;0. 05），細胞質中AIF 蛋白表達水平明顯降低（Plt;0. 05）；與模型組比較，低和高劑量大黃酚組細胞核中AIF 蛋白表達水平均明顯降低（Plt;0. 05），細胞質中AIF 蛋白表達水平均明顯升高（Plt;0. 05）。免疫熒光法檢測，對照組細胞AIF 定位于細胞核內較少；與對照組比較，模型組細胞AIF 核轉位陽性值明顯升高（Plt;0. 05）；與模型組比較，低和高劑量大黃酚組細胞AIF 核轉位陽性值均明顯降低（Plt;0. 05）。與對照組比較，模型組細胞中SOD 活性明顯降低（Plt;0. 05），MDA 水平明顯升高（Plt;0. 01）；與模型組比較，低和高劑量大黃酚組細胞中SOD 活性均明顯升高（Plt;0. 05），MDA 水平均明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）；各組細胞中Caspase-8和Caspase-9水平比較差異均無統(tǒng)計學意義 （Pgt;0. 05）。結論：大黃酚通過抑制氧化應激和AIF 核轉位改善H2O2誘導的EA. hy926 細胞凋亡，有助于治療BPD。

［關鍵詞］ 大黃酚； 支氣管肺發(fā)育不良； 凋亡誘導因子； 核轉位； 細胞凋亡； 氧化應激

［中圖分類號］ R725.6 ［文獻標志碼］ A

支氣管肺發(fā)育不良（bronchopulmonarydysplasia，BPD） 是威脅早產兒生命的常見慢性呼吸系統(tǒng)疾病， 可以導致反復住院并引起多種后遺癥，嚴重影響患兒生活質量，遠期影響甚至可能持續(xù)至青春期和成年期，給患兒、家庭和社會帶來巨大的經濟和心理負擔［1］。研究［2］ 顯示： 經典型BPD 發(fā)病率已明顯降低，然而新型BPD 發(fā)病率呈上升趨勢。不同于以肺部感染及炎癥、肺纖維化和氧化應激為特征的經典型BPD，新型BPD 以肺泡結構簡化、毛細血管形態(tài)畸形、間質細胞變化和纖維增生為主要特征。目前，BPD 的潛在發(fā)病機制及其具體病因尚未完全闡明，仍然缺乏有效的治療手段和干預藥物，是全球性的婦幼重點健康問題［1］。

生命早期高濃度氧暴露是最終導致BPD 的獨立危險因素［3］。氧化應激在高氧誘導的肺泡上皮細胞和血管內皮細胞損傷中發(fā)揮重要作用，細胞凋亡過度是氧化應激導致肺泡上皮細胞和血管內皮細胞損傷的重要機制之一［4］。研究［5］ 發(fā)現(xiàn)： 肺泡上皮細胞和血管內皮細胞過度凋亡是BPD 的重要組織學特點，肺組織凋亡細胞數(shù)隨高氧暴露時間延長而明顯增加。新型BPD 病理損傷明顯減輕， 因此內源性凋亡途徑激活可能在新型BPD 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，凋亡誘導因子（apoptosis-inducingfactor， AIF） 核轉位是內源性凋亡通路激活的標志［6-7］。當機體處于高氧刺激下，活性氧（reactiveoxygen species， ROS） 產生增加和線粒體通透性轉變孔開放，致使線粒體內膜電位喪失、基質腫脹及外膜破裂，AIF 由線粒體釋放并向細胞核轉移，啟動細胞凋亡程序。

大黃是我國傳統(tǒng)中草藥， 已證實有助于治療BPD［8-9］。蒽醌類化合物是大黃的主要有效化學成分，其中大黃酚結構較為簡單，可由此合成其他蒽醌類化合物［10］。研究［11］ 顯示：大黃酚可以減輕肺損傷， 但大黃酚改善BPD 的臨床療效及其作用機制尚未完全闡明。因此本研究以人臍靜脈內皮細胞株EA. hy926 通過過氧化氫（hydrogen peroxidesolution， H2O2） 誘導其凋亡建立高氧損傷模型，探討大黃酚治療對EA. hy926 高氧損傷細胞模型AIF 核轉位及氧化應激的影響， 旨在為BPD 的治療提供參考。

1 材料與方法

1. 1 細胞、主要試劑和儀器 人臍靜脈內皮細胞株EA. hy926 （CL-0272） 購自武漢普諾賽生命科技公司。H2O2 溶液（CAS： 7722-84-1）、大黃酚粉（CAS： 481-74-3）、N-N- 二甲基乙酰胺（CAS：127-19-5） 和聚山梨酯80 （CAS：9005-65-6） 均購自上海阿拉丁生化科技公司，胰蛋白酶（25200056）和DMEM 培養(yǎng)基（12100046） 均購自美國Gibico公 司， 胎 牛 血 清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（FSP500） 購自上海依科賽生物爾科技公司， 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）、丙二醛（malondialdehyde， MDA） 檢測試劑盒、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartatespecific proteinase， Caspase）-8 活性檢測試劑盒、Caspase-9 活性檢測試劑盒、Hoechst 染色試劑盒、細胞核蛋白和細胞漿蛋白抽提試劑盒、BCA 檢測試劑盒及蛋白濃度測定試劑盒均購自江蘇海門碧云天生物技術研究所， CCK-8 檢測試劑盒（K1018）購自美國APExBIO公司，AIF抗體（17984-1-AP）和HistoneH3 （17168-1-AP） 均購自武漢Proteintech公司， β -actin （T0022） 購自江蘇Affinity 公司。CO2 培養(yǎng)箱購自美國賽默飛公司，酶聯(lián)免疫檢測儀購自美國NanoDrop 公司，聚焦光學顯微鏡購自日本Nikon 公司。

1. 2 大黃酚和 H2O2應用液制備和 EA. hy926細胞培養(yǎng) 大黃酚采用N-N-二甲基乙酰胺和聚山梨酯-80 溶解后混勻，實驗前用0. 9% 氯化鈉溶液稀釋至0、8、16、32、64、128 和256 μmol·L-1 藥物濃度。取453 μL 30% H2O2 溶液配制為母液后，定容至100 mL 備用。本研究已通過廣東省婦幼保健院醫(yī)學倫理委員會批準，倫理審查編號：202001075。采用含1% 青-鏈霉素和10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，EA. hy926 細胞復蘇后，置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，顯微鏡下觀察EA. hy926 細胞生長至匯合后，采用0. 25% 胰酶消化細胞，分瓶傳代培養(yǎng)，備用。

1. 3 CCK-8法檢測不同濃度H2O2處理后EA. hy926細胞活性 取對數(shù)生長期 EA. hy926 細胞，采用0. 25% 胰酶消化細胞，DMEM 培養(yǎng)基稀釋細胞使細胞密度為1×105 mL-1，將細胞懸液轉移至96 孔細胞培養(yǎng)板中，分別用濃度為25、50、100、200、400、800 和1 600 μmol·L-1 H2O2 溶液干預24 h 后，根據(jù)CCK-8 試劑盒說明書操作，采用酶標儀檢測波長450 nm 處細胞吸光度（A） 值，計算細胞活性。細胞活性= （實驗孔A 值-對照孔A 值） /對照孔A 值×100%。

1. 4 CCK-8法檢測不同濃度大黃酚和H2O2處理后EA. hy926細胞活性 取對數(shù)生長期 EA. hy926細胞， 稀釋至細胞密度為1×105 mL-1 的細胞懸液，接種于96 孔細胞培養(yǎng)板， 待細胞貼壁匯合后， 生理鹽水溶解大黃酚溶液至0、8、16、32、64、128和256 μmol·L-1 濃度梯度， 細胞中加入不同濃度的大黃酚溶液和200 μmol·L-1 H2O2 溶液， 共同培養(yǎng)24 h，根據(jù)CCK-8 試劑盒說明書操作，采用酶標儀檢測波長450 nm 處細胞A 值， 計算細胞活性。細胞活性= （實驗孔A 值-對照孔A 值） /對照孔A 值×100%。

1. 5 實驗分組 取對數(shù)生長期 EA. hy926 細胞，分為對照組、模型組、低劑量大黃酚組和高劑量大黃酚組。對照組EA. hy926 細胞不作處理； 模型組EA. hy926 細胞加入200 μmol·L-1 H2O2溶液，培養(yǎng)24 h； 低和高劑量大黃酚組細胞培養(yǎng)至匯合后， 分別加入8 和256 μmol·L-1 大黃酚溶液及200 μmol·L-1 H2O2溶液，干預24 h。

1. 6 Western blotting 法檢測各組細胞核和細胞質中 AIF 蛋白表達水平 收集各組 EA. hy926細胞，按照細胞核蛋白和細胞漿蛋白抽提試劑盒說明書操作，分離提取細胞核和細胞質中蛋白，-80 ℃保存?zhèn)溆?。取各組EA. hy926 細胞， 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS） 清洗后裂解，收集細胞總蛋白，將提取的蛋白進行細胞質和細胞核中AIF 蛋白定量， 分離得到的細胞質蛋白和細胞核蛋白通過SDS-PAGE 電泳， 轉移至PVDF 膜上，5% 脫脂奶粉封閉1 h 后， 孵育AIF （1∶ 1 000）、Histone H3 （1∶ 5 000） 和β-actin （1∶ 10 000） 一抗， TBST 溶液中漂洗3 次， 二抗室溫孵育1 h，TBST 溶液中漂洗3 次， 經ECL 成像顯影。采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值， 以Histone H3和β-actin 為內參，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。

1. 7 免疫熒光法檢測各組細胞 AIF 核轉位情況 取對數(shù)生長期EA. hy926 細胞株，制備為細胞懸液， 接種至共聚焦皿中。按照上述分組干預后，PBS 漂洗3 次， 每次5 min， 4% 多聚甲醛固定，室 溫 作 用 15 min， PBS 緩 沖 液 漂 洗 3 次，0. 3%Triton X-100 溶液作用10 min， PBS 緩沖液漂洗3 次， 使用10% 正常山羊血清封閉， 室溫靜置孵育2 h，加入一抗，4 ℃孵育過夜，PBS 緩沖液漂洗3 次， 再加入二抗， 室溫孵育1 h， PBS 緩沖液漂洗3 次， 加入Hoechst 染色劑染色， 使用抗熒光淬滅封片液封片， 于光學顯微鏡下觀察并拍照， 每組隨機選取3 個視野， 采用Image J 軟件對發(fā)生AIF 核轉位的細胞進行計數(shù)， 計算各組細胞AIF 核轉位陽性值。AIF 核轉位陽性值= 實驗組AIF 核轉位陽性細胞數(shù)/對照組AIF 核轉位陽性細胞數(shù)。

1. 8 采用試劑盒檢測各組細胞中 SOD 活性和MDA 水平 收集細胞上清液，按照 SOD和 MDA檢測試劑盒說明書操作，各組細胞待測溶液加入至96 孔細胞培養(yǎng)板中，采用酶標儀于波長450 nm 和532 nm 處檢測細胞A 值， 按照試劑盒說明書方法計算各組細胞中SOD 活性和MDA 水平。

1. 9 采用試劑盒檢測各組細胞中 Caspase-8 和Caspase-9 水平 取對數(shù)生長期 EA. hy926 細胞，1∶ 3 傳代至75T 培養(yǎng)瓶中， 待細胞貼壁匯合后按照上述分組干預24 h，用胰蛋白酶消化細胞，按照Caspase-8 和Caspase-9 活性檢測試劑盒說明書操作，檢測各組細胞中Caspase-8 和Caspase-9 水平。

1. 10 統(tǒng)計學分析 采用 SPSS 22. 0 和 GraphpadPrism 8. 0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組細胞活性、細胞核和細胞質中AIF 蛋白表達水平、AIF 核轉位陽性值、細胞中SOD 活性和MDA 水平及Caspase-8 和Caspase-9 水平均符合正態(tài)分布， 以x±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析， 組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2. 1 不同濃度 H2O2處理后 EA. hy926 細胞活性 EA. hy926 細胞呈倒置S 形細胞活性曲線，細胞活 性 良 好，半 數(shù) 抑 制 濃 度（median inhibitionconcentration，IC50） 為261. 52 μmol·L-1，本研究采用200 μmol·L-1 H2O2 干預24 h 誘導建立細胞模型。見圖1。

2. 2 不同濃度大黃酚和H2O2處理后EA. hy926細胞活性 隨著大黃酚藥物濃度的升高，EA. hy926細胞活性無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0. 05）。本研究采用8 和256 μmol·L-1大黃酚進行細胞干預。見圖2。

2. 3 各組細胞核和細胞質中 AIF 蛋白表達水平 與對照組（1. 296±0. 014） 比較，模型組細胞核中AIF 蛋白表達水平（1. 692±0. 026） 明顯升高（Plt;0. 05）， 細胞質中AIF 蛋白表達水平（0. 910±0. 523） 明顯降低（Plt;0. 05）。與模型組比較，低和高劑量大黃酚組細胞核中AIF 蛋白表達水平（1. 583±0. 051 和1. 069±0. 043） 均明顯降低（Plt;0. 05）， 細胞質中AIF 蛋白表達水平（1. 566±0. 060 和1. 096±0. 013） 均明顯升高（Plt;0. 05）。見圖3。

2. 4 各組細胞 AIF核轉位情況 對照組細胞 AIF定位于核內較少。與對照組（1. 00±0. 00） 比較，模型組細胞AIF 核轉位陽性值（4. 00±0. 82） 明顯升高（Plt;0. 05）。與模型組比較， 低和高劑量大黃酚組細胞AIF 核轉位陽性值（2. 25±0. 95 和1. 50±0. 58） 均明顯降低（Plt;0. 05）。見圖4。

2. 5 各組細胞中 SOD 活性和 MDA、Caspase-8及Caspase-9水平 與對照組比較，模型組細胞中SOD 活性明顯降低（Plt;0. 05），MDA 水平明顯升高（Plt;0. 01）。與模型組比較， 低和高劑量大黃酚組細胞中SOD 活性均明顯升高（Plt;0. 05），MDA 水平均明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。各組細胞中Caspase-8 和Caspase-9 水平比較差異均無統(tǒng)計學意義（Pgt;0. 05）。見表1。

3 討 論

臍靜脈內皮細胞株Ea. hy926 的結構和功能均與人肺泡微血管內皮細胞相似， 可廣泛用于構建BPD 肺泡體外模型［12］。氧化應激在高氧誘導的肺泡上皮細胞和血管內皮細胞損傷中發(fā)揮重要作用，而H2O2 誘導的氧化應激細胞模型普遍用于研究內皮細胞發(fā)生氧化損傷的機制及藥物對氧化損傷的保護作用［13］。本研究設置不同濃度梯度H2O2 溶液干預EA. hy926 細胞24 h 后，細胞活性呈倒置S 形細胞活性曲線，提示造模成功。

氧化應激和細胞凋亡是BPD 發(fā)生發(fā)展的重要機制［4-5］。本研究結果顯示：在血管內皮細胞高氧損傷模型中，大黃酚可升高SOD 活性和降低MDA水平，提示其具有抗氧化應激作用。此外，與對照組比較，給予大黃酚和H2O2共同處理后Ea. hy926 細胞活性無明顯差異，提示大黃酚有助于減輕高氧誘導的EA. hy926 細胞凋亡。

過度細胞凋亡是氧化應激誘導肺泡上皮細胞和血管內皮細胞損傷的重要病理生理機制［14］。研究［15］ 證實：肺泡上皮細胞和血管內皮細胞過度凋亡是BPD 的重要組織學特點， 肺組織凋亡細胞數(shù)與BPD 肺損傷程度存在顯著正相關關系。由線粒體損傷介導的內源性凋亡通路和由死亡受體激活的外源性凋亡通路是目前已知的2 種細胞凋亡途徑，均被證實參與了BPD 的病理過程［8，16］。外源性凋亡通路激活啟動于Fas 與其受體結合，隨后與細胞質Fas 相關死亡結構域蛋白和Caspase-8 結合，進一步形成死亡誘導信號復合體，最終活化Caspase-3，并啟動細胞程序化死亡程序［17］。內源性凋亡通路是由于細胞受促凋亡因子刺激作用下，線粒體跨膜電位明顯降低，線粒體膜通透性明顯升高，從而導致多種促凋亡蛋白，如AIF 和細胞色素C 的釋放，細胞色素C 可先后激活Caspase-9 和Caspase-3 （依賴于Caspase 的凋亡途徑），AIF 則經核定位信號轉移至細胞核，直接引起染色體聚集和DNA 等大分子斷裂（非Caspase 依賴性通路）， 最終引起細胞凋亡［18］。新型BPD 病理損傷較傳統(tǒng)BPD 明顯減輕， 因此內源性凋亡通路可能在新型BPD 中發(fā)揮關鍵作用［6］。本研究結果顯示： 各組細胞中Caspase-8 和Caspase-9 水平比較差異均無統(tǒng)計學意義；與對照組比較，模型組細胞質中AIF 蛋白表達水平明顯降低，細胞核中AIF 蛋白表達水平明顯升高；而大黃酚干預下細胞質中AIF 蛋白表達水平較模型組明顯升高，而細胞核中AIF 蛋白水平明顯降低， 提示輕度BPD 主要為AIF 核轉位引發(fā)的非Caspase-3 依賴性凋亡通路發(fā)揮作用， 大黃酚可有效抑制AIF 核轉位引起的EA. hy926 細胞凋亡。而H2O2 處理和大黃酚干預后Caspase-9 水平變化不明顯，可能與Caspase-9 為線粒體損傷激活的Caspase依賴性通路的下游分子，而AIF 核轉位反映線粒體損傷后凋亡蛋白的早期變化有關，且AIF 的激活依賴于腺苷二磷酸核糖聚合酶-1，而非依賴于Caspase的外源性和內源性細胞凋亡信號通路［19-20］。

綜上所述，大黃酚通過抑制氧化應激和AIF 核轉位，改善H2O2誘導的EA. hy926 細胞凋亡，提示大黃酚有助于治療BPD。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：李思琪參與實驗操作、數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析和論文撰寫，陳廣道參與實驗設計、論文指導和審校，曾其毅參與研究選題。

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