抑制miR-193a-5p 表達(dá)對(duì)急性呼吸窘迫綜合征大鼠肺纖維化的改善作用及其機(jī)制

［摘 要］ 目的：探討抑制微小RNA（miR）-193a-5p表達(dá)對(duì)急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）大鼠肺纖維化的影響，并闡明相關(guān)作用機(jī)制。方法：60只雄性SD大鼠分為假手術(shù)組、模型組、miR-193a-5p拮抗劑組（Antagomir 組） 和陰性對(duì)照組（Antagomir-NC 組），每組15 只。采用暴露氣管法滴注10 mg·kg-1脂多糖（LPS） 誘導(dǎo)構(gòu)建ARDS 大鼠模型， 假手術(shù)組大鼠滴注等體積生理鹽水， 造模成功后Antagomir 組和Antagomir-NC 組大鼠給予miR-193a-5p Antagomir 或Antagomir-NC 尾靜脈注射。測(cè)定各組大鼠動(dòng)脈血氧分壓（PaO2） 和氧合指數(shù)（OI），HE 和Masson 染色觀察各組大鼠肺組織病理形態(tài)表現(xiàn)及肺組織中膠原纖維沉積情況，試劑盒檢測(cè)各組大鼠肺組織中羥脯氨酸（Hyp） 水平，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 法檢測(cè)各組大鼠肺泡灌洗液（BALF） 中炎性因子腫瘤壞死因子α （TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-1β 和IL-6 水平，實(shí)時(shí)熒光定量PCR （RT-qPCR） 法檢測(cè)各組大鼠肺組織中miR-193a-5p表達(dá)水平，Western blotting 法檢測(cè)各組大鼠肺組織中β 連環(huán)蛋白（β-catenin）、蝸牛家族轉(zhuǎn)錄抑制因子1（Snail1） 和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白 （α-SMA） 蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠PaO2和OI 均明顯降低（Plt;0. 05）；與模型組比較，Antagomir 組大鼠PaO2 和OI 均明顯升高（Plt;0. 05）。HE 染色觀察， 假手術(shù)組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常， 未見(jiàn)明顯的炎性改變； 與假手術(shù)組比較， 模型組和Antagomir-NC 組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)輕度異常，肺泡萎縮塌陷，肺泡腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)有大量的淋巴細(xì)胞和少量的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隙增寬；與模型組比較，Antagomir 組大鼠肺組織的肺泡腔內(nèi)淋巴細(xì)胞明顯減少，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)較少，未見(jiàn)明顯增生。Masson 染色觀察，假手術(shù)組大鼠肺組織無(wú)明顯藍(lán)色膠原纖維沉積；與假手術(shù)組比較，模型組和Antagomir-NC 組大鼠肺組織中出現(xiàn)大量藍(lán)色膠原纖維沉積，肺泡結(jié)構(gòu)損壞嚴(yán)重，呈現(xiàn)明顯的肺纖維化情況；與模型組比較，Antagomir 組大鼠肺組織黏液中藍(lán)色染色的膠原纖維沉積明顯減少。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肺組織中Hyp 水平明顯升高（Plt;0. 05）；與模型組比較，Antagomir組大鼠肺組織中Hyp 水平明顯降低（Plt;0. 05）。ELISA 法檢測(cè)，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠BALF 中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平均明顯升高（Plt;0. 05）；與模型組比較，Antagomir 組大鼠BALF 中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平均明顯降低（Plt;0. 05）。RT-qPCR 法檢測(cè)，與假手術(shù)組比較， 模型組大鼠肺組織中miR-193a-5p 表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 05）； 與模型組比較，Antagomir 組大鼠肺組織中miR-193a-5p 表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 05）。Western blotting 法檢測(cè)，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肺組織中β-catenin、Snail1 和α-SMA 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 05）；與模型組比較，Antagomir 組大鼠肺組織中β-catenin、Snail1 和α-SMA 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05）。結(jié)論：抑制miR-193a-5p表達(dá)可通過(guò)降低肺組織炎癥反應(yīng)和下調(diào)β-catenin、Snail1及α-SMA等蛋白表達(dá)，改善ARDS 大鼠肺功能和肺纖維化。

［關(guān)鍵詞］ 微小RNA-193a-5p； 急性呼吸窘迫綜合征； 肺纖維化； Wnt/β-catenin 信號(hào)通路

［中圖分類號(hào)］ R563.9 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratorydistress syndrome， ARDS） 是由休克、創(chuàng)傷或嚴(yán)重感染等肺內(nèi)外多種直接或間接病因引起的，以肺實(shí)質(zhì)和脈管系統(tǒng)損傷為主要特征的臨床綜合征，主要表現(xiàn)為進(jìn)行性呼吸困難和頑固性低氧血癥［1］。ARDS 是更嚴(yán)重的急性肺損傷（acute lung injury，ALI）， 其病理特征為肺間質(zhì)和肺泡水腫、肺小血管內(nèi)微血栓形成、呼吸性細(xì)支氣管和肺泡內(nèi)透明膜形成及肺泡萎陷，晚期可發(fā)展為肺纖維化［2］。肺纖維化是受損的肺組織自我修復(fù)留下瘢痕的過(guò)程，可導(dǎo)致肺換氣功能障礙且不可逆，持續(xù)進(jìn)展會(huì)出現(xiàn)呼吸衰竭［3］。臨床上肺纖維化一般指間質(zhì)性肺疾病的終末期改變，由于其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，確診后生存期短，目前缺乏確切有效的臨床治療方法。因此，明確ARDS 轉(zhuǎn)變成肺纖維化疾病的發(fā)病和分子調(diào)控機(jī)制對(duì)于尋找有效的臨床治療靶點(diǎn)十分重要。微小RNA （micro RNA， miRNA） 是一種天然存在于體內(nèi)的微小型內(nèi)源性非編碼RNA，其通過(guò)與靶基因mRNA 的3'-UTR 區(qū)域結(jié)合，抑制靶基因翻譯或降解靶基因mRNA，行使生物學(xué)功能［4］。近年來(lái)，miRNA 的生物學(xué)作用成為研究熱點(diǎn)，作為研究較為成熟的非編碼RNA，miRNA 在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域逐漸深入和完善，通過(guò)將miRNA 或miRNA 拮抗劑導(dǎo)入患者體內(nèi)，以升高或降低miRNA 表達(dá)水平，從而調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)， 最終實(shí)現(xiàn)治療效果［5］。PARZIBUT 等［6］ 研究表明： 與健康對(duì)照者比較，ARDS 患者血液外泌體中miR-193a-5p 表達(dá)水平明顯升高， 并對(duì)ARDS 具有較高的診斷潛能。JOHNSON 等［7］ 研究顯示：血清miR-193a-5p 水平與非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD） 患者活動(dòng)等級(jí)和纖維化分期呈正向關(guān)系。ROY 等［8］ 發(fā)現(xiàn)： miR-193 是肝纖維化中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β （transforming growth factor- β， TGF- β） 依賴細(xì)胞外基質(zhì)形成的重要調(diào)控基因。研究［9］ 顯示：Wnt/β 連環(huán)蛋白（β-catenin） 信號(hào)通路參與早期纖維化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路可減輕細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變，減少肺纖維化發(fā)生。然而，miR-193a-5p 通過(guò)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路參與調(diào)控ARDS 患者肺纖維化進(jìn)程尚未完全闡明。本研究構(gòu)建ARDS 大鼠模型，采用分子生物學(xué)方法，探討抑制miR-193a-5p 表達(dá)對(duì)ARDS 模型大鼠肺纖維化的影響， 并闡明其可能的分子機(jī)制， 為臨床治療ARDS 提供參考。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器 SPF 級(jí)雄性SD 大鼠60 只， 體質(zhì)量240～280 g， 鼠齡8 周， 購(gòu)自西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心， 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYSK （川） 2018-065。動(dòng)物均飼養(yǎng)于溫度為22 ℃～24 ℃，濕度為50%～70% 的SPF 環(huán)境下，自由飲水進(jìn)食， 每日光照12 h， 定期更換墊料。miR-193a-5p 拮抗劑Antagomir 及其陰性對(duì)照試劑Antagomir-NC （廣州銳博生物科技有限公司），腫瘤壞死因子α （tumor necrosis factor- α， TNF- α）、白細(xì)胞介素（interleukin， IL）-1β 和IL-6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 試劑盒［生工生物工程（上海） 股份有限公司］， 羥脯氨酸（hydroxyproline， Hyp） 檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），HE 染色試劑盒和Masson 染色試劑盒（上?？道噬锟萍加邢薰荆瑢?shí)時(shí)熒光定量PCR （real-time fluorenscencequantitative PCR， RT-qPCR） 試劑盒（北京締一生物科技有限公司）。光學(xué)顯微鏡（日本Nikon 公司），ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司）， 7500 RT-qPCR 儀（美國(guó)ABI公司）。

1. 2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備和分組 將60只適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后的雄性SD 大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組、Antagomir組和Antagomir-NC 組，每組15只。開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前，大鼠禁食12 h，假手術(shù)組大鼠經(jīng)氣管暴露后滴注等體積生理鹽水，模型組、Antagomir 組和Antagomir-NC 組大鼠均經(jīng)氣管暴露后滴注10 mg·kg-1 脂 多 糖（lipopolysaccharide，LPS），構(gòu)建ARDS 大鼠模型［10-11］。假手術(shù)組大鼠毛發(fā)光滑，好動(dòng)， 食欲佳； 行ARDS 造模的大鼠出現(xiàn)呼吸急促、精神萎靡和食欲不佳等癥狀且肺呼吸功能指標(biāo)氧合指數(shù)（oxygenation index， OI） lt;200 mmHg（1 mmHg=0. 133 kPa），表明ARDS 模型構(gòu)建成功［12］。造模成功后， Antagomir 組和Antagomir-NC 組大鼠經(jīng)尾靜脈注射75 nmol Antagomir-NC和75 nmol miR-193a-5p Antagomir，假手術(shù)組和模型組大鼠經(jīng)尾靜脈注射同等體積的生理鹽水，每周1 次，2 周后處死大鼠，取樣進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1. 3 采用試劑盒檢測(cè)各組大鼠動(dòng)脈血氧分壓（partial pressure of oxygen in arterial blood，PaO2）和OI 應(yīng)用呼吸麻醉機(jī)吸入麻醉大鼠后， 將大鼠固定于手術(shù)臺(tái)上，仰臥姿勢(shì)，常規(guī)消毒后，行中線切口開(kāi)腹手術(shù)，推開(kāi)腸管后，完全暴露腹主動(dòng)脈。于腹主動(dòng)脈分叉處采用含肝素鈉的注射器針刺抽取1 mL 大鼠主動(dòng)脈血，通過(guò)血?dú)夥治鰞x和PT1000 血?dú)鉁y(cè)定試劑盒檢測(cè)大鼠OI 和PaO2。OI=PaO2/吸入氣中的氧濃度分?jǐn)?shù)（fraction of inspiration O2，F(xiàn)iO2）［13］。

1. 4 HE和Masson染色觀察各組大鼠肺組織病理形態(tài)表現(xiàn)及肺組織中膠原纖維沉積情況 取大鼠肺組織，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 清洗后，4% 多聚甲醛固定24～48 h，石蠟包埋， 制備3 μm 厚的切片， 進(jìn)行HE 染色和Masson染色。HE 染色：切片經(jīng)過(guò)二甲苯脫蠟和乙醇梯度水化后，分別用蘇木精和伊紅染色，乙醇梯度脫水和二甲苯透明化，最后封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠肺組織病理形態(tài)表現(xiàn)。Masson 染色：切片經(jīng)二甲苯脫蠟和乙醇梯度脫水后，依次使用Weigert鐵蘇木精、酸性乙醇、Masson 藍(lán)化液、麗春紅品紅和苯胺藍(lán)染色，脫水、透明化并封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠肺組織中膠原纖維沉積情況。

1. 5 試劑盒檢測(cè)各組大鼠肺組織中Hyp水平 取各組大鼠肺組織約50 mg，用生理鹽水充分清洗干凈，加入1 mL 水解液混勻后，沸水浴水解1 h，按照Hyp 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，分別加入蒸餾水、標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液、檢測(cè)液和試劑應(yīng)用液，混勻后室溫靜置10 min，加入0. 5 mL 試劑二，室溫靜置10 min，加入0. 5 mL 試劑三，混勻后置于60 ℃水浴15 min。待冷卻至室溫后，3 500 g 離心10 min，取上清，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)560 nm 處吸光度（A）值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各組大鼠肺組織中Hyp 水平。Hyp 水平= （實(shí)驗(yàn)管A 值- 空白管A 值） / （標(biāo)準(zhǔn)管A 值-空白管A 值） ×標(biāo)準(zhǔn)管濃度（5 mg·L-1） ×稀釋倍數(shù)。

1. 6 ELISA 法檢測(cè)各組大鼠支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid， BALF）中TNF- α、IL-1β和IL-6水平 處死各組大鼠后，剪開(kāi)大鼠胸腔， 去除心臟， 取預(yù)冷的生理鹽水沖洗肺部2 次后，利用手術(shù)線小心將左肺肺門(mén)結(jié)扎，分離頸部氣管，于氣管分叉處作T 形切口，插入靜脈留置針套管至支氣管下端分叉處， 緩慢注入37 ℃ 預(yù)熱的500 μL 生理鹽水，肉眼可見(jiàn)肺部膨隆， 隨機(jī)緩慢抽回灌洗液， 反復(fù)抽注支氣管肺泡3 次后，用無(wú)菌管收集BALF，4 ℃、3 000 g 離心10 min，取上清液。按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)各組大鼠BALF 中炎性因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平。

1. 7 RT-qPCR 法檢測(cè)各組大鼠肺組織中 miR-193a-5p表達(dá)水平 采用TRIzol法提取各組大鼠肺組織總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定所提樣本RNA 的濃度和純度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將濃度和純度達(dá)標(biāo)的RNA 樣本經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶于50 ℃水浴1 h 逆轉(zhuǎn)錄后，合成單鏈cDNA。根據(jù)RT-qPCR 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，使用7500 RT-qPCR 儀進(jìn)行RT-qPCR 反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s；60 ℃、30 s，45 個(gè)循環(huán)。以U6 為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt法計(jì)算目的基因表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。

1. 8 Western blotting 法檢測(cè)各組大鼠肺組織中β 連環(huán)蛋白（β-catenin）、蝸牛家族轉(zhuǎn)錄抑制因子 1（snail family transcriptional repressor 1，Snail1）和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）蛋白表達(dá)水平 取大鼠右肺葉組織約 100 mg，剪碎后加入1 mL 預(yù)冷RIPA 裂解液，于4 ℃制備勻漿并冰浴 10 min。4 ℃、12 000 r·min－1 離 心10 min，取上清， 收集蛋白。SDS-PAGE 電泳分離， 濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜。封閉后，加入β-catenin （1∶1 000）、Snail1 （1∶ 1 000）、α -SMA （1∶ 1 000） 和GAPDH 抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜。次日，洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶10 000）孵育30 min。使用ECL 發(fā)光液處理PVDF 膜后，進(jìn)行X 光膠片曝光、顯影和定影。采用QuantityOne 軟件分析蛋白條帶灰度值， 以GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1. 9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS 22. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組大鼠PaO2和OI，BALF 中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平， 肺組織中β-catenin、Snail1 和α-SMA 蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以x±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以Plt;0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 各組大鼠 PaO2和 OI 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠PaO2 和OI 均明顯降低（Plt;0. 05）。與模型組比較， Antagomir 組大鼠PaO2 和OI 均明顯升高（Plt;0. 05）， Antagomir-NC 組大鼠上述指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。見(jiàn)表2。

2. 2 各組大鼠肺組織病理形態(tài)表現(xiàn)和肺組織中膠原纖維沉積情況 HE染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)明顯的炎性改變。與假手術(shù)組比較， 模型組和Antagomir-NC 組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)輕度異常，肺泡萎縮塌陷，肺泡腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)有大量的淋巴細(xì)胞和少量的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隙增寬。與模型組比較，Antagomir 組大鼠肺組織的肺泡腔內(nèi)淋巴細(xì)胞明顯減少， 中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)較少， 未見(jiàn)明顯增生。見(jiàn)圖1。Masson 染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠肺組織無(wú)明顯藍(lán)色膠原纖維沉積。與假手術(shù)組比較， 模型組和Antagomir-NC 組大鼠肺組織中出現(xiàn)大量藍(lán)色膠原纖維沉積，肺泡結(jié)構(gòu)損壞嚴(yán)重， 呈現(xiàn)明顯的肺纖維化情況。與模型組比較，Antagomir 組大鼠肺組織黏液中藍(lán)色染色的膠原纖維沉積明顯減少。見(jiàn)圖2。

2. 3 各組大鼠肺組織中Hyp水平 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肺組織中Hyp 水平明顯升高（Plt;0. 05）。與模型組比較，Antagomir 組大鼠肺組織中Hyp 水平明顯降低（Plt;0. 05），Antagomir-NC 組大鼠Hyp水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。見(jiàn)表3。

2. 4 各組大鼠 BALF中 TNF-α、IL-6和 IL-1β水平 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠BALF 中TNF-α、IL-1 β 和IL-6 水平均明顯升高（Plt;0. 05）。與模型組比較， Antagomir 組大鼠BALF 中TNF- α、IL-1 β 和IL-6 水平均明顯降低（ Plt;0. 05），Antagomir-NC 組大鼠上述指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。見(jiàn)表4。

2. 5 各組大鼠肺組織中 miR-193a-5p 表達(dá)水平 與假手術(shù)組比較， 模型組大鼠肺組織中miR-193a-5p 表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 05）。與模型組比較， Antagomir 組大鼠肺組織中miR-193a-5p 表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 05）， Antagomir-NC 組大鼠肺組織中miR-193a-5p 表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。見(jiàn)表5。

2. 6 各組大鼠肺組織中β-catenin、Snail1和α-SMA蛋白表達(dá)水平 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肺組織中β-catenin、Snail1和α-SMA 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 05）。與模型組比較，Antagomir 組大鼠肺組織中β-catenin、Snail1 和α-SMA 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05）， Antagomir-NC 組大鼠上述指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ Pgt;0. 05）。見(jiàn)圖3。

3 討 論

ALI 是一種與肺泡毛細(xì)血管屏障有關(guān)的常見(jiàn)臨床急危重癥，其嚴(yán)重程度與ARDS 患者的死亡率有密切關(guān)聯(lián)［14-15］。近年來(lái)，隨著LPS 構(gòu)建ALI 動(dòng)物模型研究的不斷深入，有望降低ALI 和ARDS 患者的死亡率，但目前尚無(wú)積極有效的治療方法。本研究結(jié)果顯示：LPS 可誘導(dǎo)炎癥的物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后快速誘發(fā)大鼠炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致大鼠肺損傷。BOWMAN等［16］研究表明：肺纖維化是ARDS 的關(guān)鍵病理過(guò)程，其病變情況在肺組織中分布不一，能夠在同一低倍視野內(nèi)觀察到正常肺組織、肺間質(zhì)炎癥、肺纖維增生和蜂窩肺的細(xì)微變化，以下肺和胸膜下區(qū)域病變表現(xiàn)較為明顯。肺纖維化病理表現(xiàn)為肺泡壁增厚，同時(shí)有膠原沉積、細(xì)胞外基質(zhì)增加和灶性單核細(xì)胞浸潤(rùn)［17］。本研究結(jié)果顯示：大鼠經(jīng)頸部氣管滴注LPS誘導(dǎo)后出現(xiàn)肺功能障礙和肺組織炎性浸潤(rùn)及呈纖維化的表現(xiàn)，肺組織miR-193a-5p 表達(dá)水平和Hyp 水平明顯升高，且BALF 中炎癥因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平明顯升高，提示ARDS 模型制備成功。

Wnt 蛋白是一類在機(jī)體各個(gè)器官組織中廣泛存在的分泌性糖蛋白，參與動(dòng)物胚胎的早期發(fā)育、器官形成、組織再生和其他生理過(guò)程，對(duì)機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用［18］。Wnt 分泌后能與細(xì)胞表面特異性受體互相作用，通過(guò)誘導(dǎo)下游蛋白的磷酸化和去磷酸化過(guò)程，引起β-catenin 在胞漿內(nèi)積累并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)下游基因（如Snail1 和α-SMA 等） 表達(dá)的調(diào)控， 參與調(diào)控組織器官纖維化進(jìn)展過(guò)程［19-21］。Snail1 是誘導(dǎo)上皮- 間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition， EMT） 的重要調(diào)控因子，可誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞通過(guò)EMT 過(guò)程轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞， 進(jìn)而促進(jìn)肺纖維化的形成［22-23］。α-SMA 是肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物， 而纖維細(xì)胞是致纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞。研究［24-25］ 顯示： 隨著器官纖維化程度的加重， α-SMA 在肺和其他器官纖維化中表達(dá)水平升高。本研究結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織中β-catenin、Snail1 和α-SMA 蛋白表達(dá)水平明顯升高， 提示ARDS 大鼠肺組織中Wnt/β-catenin 信號(hào)通路異?；罨?且可能與ARDS 大鼠肺纖維進(jìn)程有關(guān)。

miR-193 家族成員包括miR-193a-3p、miR-193a-5p、miR-193b-3p 和miR-193b-5p， 通過(guò)與特殊靶向基因和信號(hào)傳導(dǎo)相互作用，在健康和疾病生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究［26-27］ 顯示： miR-193a-5p 表達(dá)水平與肝臟和瘢痕疙瘩等纖維化進(jìn)程有關(guān)。miR-193a-5p 可激活Wnt/ β -catenin 信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)［28］。因此，miR-193a-5p 可能通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，參與ARDS 肺纖維化進(jìn)程。本研究結(jié)果顯示：miR-193a-5p 在ARDS 模型大鼠肺組織中高表達(dá)， 給予miR-193a-5p Antagomir 干預(yù)抑制miR-193a-5p 表達(dá)后，ARDS 大鼠肺功能和肺纖維化程度明顯改善，BALF 中炎性因子水平明顯降低，提示抑制miR-193a-5p 表達(dá)可改善ARDS 大鼠肺纖維化。抑制miR-193a-5p 表達(dá)可降低ARDS大鼠肺組織中β-catenin、Snail1 和α-SMA 蛋白表達(dá)水平， 提示抑制miR-193a-5p 表達(dá)可能通過(guò)下調(diào)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)而改善ARDS大鼠肺纖維化。

綜上所述，抑制miR-193a-5p 表達(dá)可通過(guò)降低肺組織炎癥反應(yīng)和下調(diào)β-catenin、Snail1 及α-SMA 蛋白表達(dá)，改善ARDS 大鼠肺功能和肺纖維化。靶向抑制miR-193a-5p 表達(dá)可能是研發(fā)治療ARDS 相關(guān)肺纖維藥物新的思路，但仍需進(jìn)行更加深入的研究。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：龍光文參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及論文撰寫(xiě)，張謙參與數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，楊秀林參與實(shí)驗(yàn)操作，吉春玲參與實(shí)驗(yàn)操作和論文審校。

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