香葉木素對RSL3 誘導(dǎo)小鼠精母細(xì)胞GC-2 鐵死亡的抑制作用及其機(jī)制

［摘 要］ 目的：探討香葉木素（DIO） 對谷胱甘肽過氧化物酶 （GSH-Px） 抑制劑 （1S，3R）-RSL3（RSL3） 誘導(dǎo)小鼠精母細(xì)胞GC-2鐵死亡的抑制作用，并闡明相關(guān)作用機(jī)制。方法：GC-2細(xì)胞分為對照組、RSL3 組、RSL3+0. 8 nmol·L-1 DIO 組、RSL3+4. 0 nmol·L-1 DIO 組、RSL3+20. 0 nmol·L-1DIO 組和RSL3+ 鐵死亡抑制劑Ferrostain-1 （Fer-1） 組（200 nmol·L-1 Fer-1）。分別采用0、1、5、10、50、100、500 和1 000 nmol·L-1 RSL3 溶液及0、0. 1、0. 5、1. 0、5. 0、10. 0 和50. 0 μmol·L-1DIO 溶液處理細(xì)胞。另取GC-2 細(xì)胞，分為空白組、模型組和給藥組，給藥組GC-2 細(xì)胞按照處理方式分為0. 8、4. 0 和20. 0 nmol·L-1 DIO 組及RSL3+0. 8 nmol·L-1 DIO 組、RSL3+4. 0 nmol·L-1 DIO 組和RSL3+20. 0 nmol·L-1 DIO 組。噻唑藍(lán)（MTT） 法檢測各組GC-2 細(xì)胞存活率。采用100 nmol·L-1RSL3 分別作用GC-2 細(xì)胞0、6、12、24、36 和48 h，Western blotting 法檢測各組GC-2 細(xì)胞中鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平。試劑盒檢測各組GC-2 細(xì)胞中超氧化物歧化酶（SOD） 活性和丙二醛（MDA） 水平及谷胱甘肽（GSH） /氧化型谷胱甘肽（GSSG） 比值，免疫熒光法觀察各組GC-2 細(xì)胞中?；o酶A合成酶長鏈家族成員4（ACSL4） 蛋白熒光強(qiáng)度。結(jié)果：MTT法檢測，與0 nmo·l L－1 RSL3 組比較，50、100、500 和1 000 nmol·L-1 RSL3 組GC-2 細(xì)胞存活率均明顯降低（Plt;0. 01）； 與0 μmol·L-1DIO 組比較，0. 5、1. 0、5. 0、10. 0 和50. 0 μmol·L-1 DIO 組GC-2 細(xì)胞存活率均明顯降低（Plt;0. 01），后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇100 nmol·L-1 RSL3 作用GC-2 細(xì)胞，DIO 作用濃度lt;0. 1 μmol·L-1。與空白組比較，模型組GC-2 細(xì)胞存活率明顯降低（Plt;0. 01）；與模型組比較，RSL3+20. 0 nmol·L-1 DIO 組細(xì)胞存活率明顯升高（Plt;0. 01）。Western blotting 法檢測，與0 h 比較，RSL3 作用6 h 時GC-2 細(xì)胞中GPX4蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 01），RSL3 作用12 h 時GC-2 細(xì)胞中HO-1 蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 05），GPX4 和FTH1 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），RSL3 作用24 h 時GC-2 細(xì)胞中GPX4 和HO-1 蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），RSL3 作用36 和48 h 時GC-2 細(xì)胞中HO-1 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 01）；將100 nmol·L-1 RSL3 作用GC-2 細(xì)胞12 h 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件。與對照組比較，RSL3 組GC-2 細(xì)胞中MDA 水平明顯升高（Plt;0. 01），SOD 活性和GSH/GSSG比值均明顯降低（Plt;0. 05）；與RSL3 組比較，RSL3+0. 8 nmol·L-1 DIO 組、RSL3+4. 0 nmol·L-1DIO 組、RSL3+20. 0 nmol·L-1 DIO 組和RSL3+Fer-1 組GC-2 細(xì)胞中SOD 活性均明顯升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），RSL3+20. 0 nmol·L-1 DIO 組和RSL3+Fer-1 組GC-2 細(xì)胞中MDA 水平均明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），RSL3+4. 0 nmol·L-1 DIO 組、RSL3+20. 0 nmol·L-1 DIO 組和RSL3+Fer-1組GC-2 細(xì)胞中GSH/GSSG 比值均明顯升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。免疫熒光法觀察，與對照組比較， RSL3 組GC-2 細(xì)胞中ACSL4 蛋白熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)； 與RSL3 組比較， RSL3+0. 8 nmol·L-1DIO 組、RSL3+4. 0 nmol·L-1 DIO 組、RSL3+20. 0 nmol·L-1 DIO 組和RSL3+Fer-1 組GC-2 細(xì)胞中ACSL4 蛋白熒光強(qiáng)度均明顯減弱。Western blotting 法檢測，與對照組比較，RSL3 組GC-2 細(xì)胞中HO-1蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0. 05），GPX4 和FTH1 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）；與RSL3 組比較， RSL3+0. 8 nmol·L-1 DIO 組、RSL3+4. 0 nmol·L-1 DIO 組、RSL3+20. 0 nmol·L-1DIO 組和RSL3+Fer-1 組GC-2 細(xì)胞中HO-1 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），GPX4和FTH1蛋白表達(dá)水平均明顯升高 （Plt;0. 05或Plt;0. 01）。結(jié)論：DOI能夠減輕RSL3誘導(dǎo)的小鼠精母細(xì)胞GC-2 鐵死亡，其機(jī)制可能與抑制HO-1 蛋白表達(dá)，上調(diào)GPX4 和FTH1 蛋白表達(dá)有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］ 鐵死亡； 香葉木素； 小鼠精母細(xì)胞GC-2 ； 谷胱甘肽過氧化酶4 ； 鐵蛋白重鏈1；?；o酶A 合成酶長鏈家族成員4

［中圖分類號］ R966 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

男性不育是全球范圍內(nèi)普遍存在的現(xiàn)象，近年來其發(fā)病率呈上升趨勢。精子的生成和發(fā)育是男性生殖能力的重要組成部分，精母細(xì)胞作為精子的祖細(xì)胞在精子發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，主要負(fù)責(zé)生殖細(xì)胞的生成和發(fā)育［1］。研究［2］ 顯示： 鄰苯二甲酸單2 乙基己酯通過與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（transferrinreceptor protein， TFR） 1 作用介導(dǎo)睪丸支持細(xì)胞出現(xiàn)谷胱甘肽（glutathione，GSH） 代謝紊亂、氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化，從而引起鐵死亡，最終導(dǎo)致血睪屏障受損，并產(chǎn)生雄性生殖毒性。由于鐵對雄性生殖能力具有重要作用，因此，探討鐵死亡對生殖活性的影響為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。鐵死亡是一種由于鐵離子在細(xì)胞內(nèi)積累過多而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡方式［3］。血紅素加氧酶1 （hemeoxygenase-1，HO-1）是細(xì)胞中鐵的重要來源之一，可以誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)從而導(dǎo)致鐵死亡的發(fā)生［4］。除此之外，轉(zhuǎn)鐵蛋白通過TFR 介導(dǎo)鐵攝取，鐵蛋白重鏈1 （ferritin heavychain 1， FTH1） /鐵蛋白輕鏈（ferritin light chain，F(xiàn)TL） 通過自噬降解可以升高細(xì)胞內(nèi)鐵水平，從而促進(jìn)鐵死亡發(fā)生［5］。谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4） 是細(xì)胞中唯一能夠?qū)⒅|(zhì)過氧化物還原成脂質(zhì)的酶，也在鐵死亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用［6］。在小鼠精母細(xì)胞中，適量的鐵是必需的，但過量的鐵會導(dǎo)致細(xì)胞中氧化應(yīng)激反應(yīng)增加， 從而損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能［7］。研究［8］ 發(fā)現(xiàn)：鐵離子平衡失調(diào)和鐵離子過載可能與男性不育有關(guān)。過量的鐵離子會引發(fā)精子發(fā)生過程中的氧化損傷，導(dǎo)致精子形態(tài)異常、運(yùn)動能力降低和DNA 損傷，從而影響精子質(zhì)量和生育能力［9］。提示小鼠精母細(xì)胞鐵死亡可能與男性不育有關(guān)，但仍需要進(jìn)一步的研究分析二者之間的具體關(guān)系和作用機(jī)制。香葉木素（diosmetin，DIO） 是一種天然黃酮類化合物，在自然界中分布廣泛，多存在于菊花、檸檬、柑橘和橄欖葉等多種植物中［10］。DIO 因其抗炎、抗氧化、抗菌和抗癌特性等多種生物活性在非酒精性脂肪性肝病、炎癥性腸病及急性腎損傷等疾病中表現(xiàn)出保護(hù)作用［11-14］，但DIO 能否通過調(diào)節(jié)鐵死亡改善男性不育尚未完全闡明。本研究探討DIO 對谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione， peroxidase，GSH-Px） 抑制劑（1S， 3R）-RSL3 （RSL3） 誘導(dǎo)的GC-2 細(xì)胞鐵死亡的影響，闡明其調(diào)控小鼠精母細(xì)胞鐵死亡抑制生殖毒性的作用，以期為臨床治療男性不育提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 細(xì)胞、主要試劑和儀器 小鼠精母細(xì)胞 GC-2購自美國ATCC 細(xì)胞庫。鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL3 購自美國Selleck 公司， DIO 購自美國Sigma 公司， 高糖培養(yǎng)基購自上海源培生物科技股份有限公司，胎牛血清購自上海VivaCell 公司， 噻唑藍(lán)（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）和鐵死亡抑制劑Ferrostain-1 （Fer-1） 購自上海MCE 公司， 還原型GSH、氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione， GSSG）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD） 試劑盒和DAPI 購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，胰酶、1% 青- 鏈霉素和二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購自生工生物工程（上海） 股份有限公司，丙二醛（malondialdehyde， MDA） 試劑盒購自安徽Biosharp 公司，F(xiàn)TH1 抗體（批號：A19544） 購自武漢Abclonal公司，GPX4抗體（批號：381958） 購自成都ZEN-BIOSCIENCE 公司，?；o酶A 合成酶長鏈家族成員4 （acyl-CoA synthetase long-chainfamily member 4， ACSL4） 抗體（ 批號：22401-1-AP）、HO-1 抗體（批號：10701-1-AP） 和β -tubulin 抗體（批號： 00124309） 購自美國Proteintech 公司， 山羊抗鼠IgG 和山羊抗兔IgG 購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司， 山羊抗兔紅色熒光二抗購自美國Jackson 公司。蛋白電泳儀購自美國Bio-Rad 公司，5804 R 超速冷凍離心機(jī)購自德國Eppendorf 公司，AI600 成像儀購自美國General Electric 公司，倒置熒光顯微鏡和NIS-Elements 激光共聚焦顯微鏡購自日本Nikon 公司， SYNERGY H1 多功能酶標(biāo)儀購自美國 BioTek 公司， CO2 培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher Scientific 公司。

1. 2 GC-2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 GC-2 細(xì)胞采用含10% 胎牛血清和1% 青-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，于5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d 換液1 次，待細(xì)胞生長2～3 d，細(xì)胞融合度約80% 時，加入胰酶消化30 s， 進(jìn)行細(xì)胞傳代處理。GC-2 細(xì)胞分為對照組、RSL3 組、RSL3+0. 8 nmol·L-1 DIO 組、RSL3+4. 0 nmo·l L-1 DIO組、RSL3+20. 0 nmo·l L-1DIO 組和RSL3+Fer-1 組（200 nmol·L-1 Fer-1）。

1. 3 MTT 法檢測不同濃度 RSL3 和 DIO 作用后GC-2 細(xì)胞存活率 取對數(shù)生長期 GC-2 細(xì)胞，以5×104 mL-1的細(xì)胞密度接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入500 μL DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基，按十字形晃動孔板，使細(xì)胞均勻分散，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分別采用500 μL 終濃度為0、1、5、10、50、100、500 和1 000 nmol·L-1 RSL3 溶液處理細(xì)胞。另取GC-2 細(xì)胞，按上述方式培養(yǎng)后，分別采用500 μL終濃度為0、0. 1、0. 5、1. 0、5. 0、10. 0 和50. 0 μmol·L-1 DIO 溶液處理細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)12 h， 取出后每孔加入5 g·L-1 MTT 溶液50 μL，培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，輕輕吸棄培養(yǎng)基，每孔加入500 μL DMSO 溶液， 放置于搖床上振蕩15 min， 采用酶標(biāo)儀于波長570 nm 和630 nm 處測定吸光度（A） 值， 計算GC-2 細(xì)胞存活率， 篩選RSL3 和DIO 最適作用濃度。細(xì)胞存活率= （實(shí)驗(yàn)孔A 值- 空白孔A 值） / （對照孔A 值- 空白孔A 值） ×100%。

1. 4 MTT法檢測各組 GC-2細(xì)胞存活率 取對數(shù)生長期GC-2 細(xì)胞，按照“ 1. 3” 中方法培養(yǎng)。將GC-2 細(xì)胞分為空白組、模型組和給藥組。空白組使用完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)GC-2 細(xì)胞，模型組GC-2細(xì)胞加入500 μ L 終濃度為100 nmol·L-1 RSL3溶 液， 給 藥 組 GC-2 細(xì) 胞 分 為 0. 8、 4. 0 和20. 0 nmol·L-1 DIO 組（分別加入終濃度為0. 8、4. 0 和 20. 0 nmol·L-1 DIO 溶 液） 及 RSL3 +0. 8 nmo·l L-1 DIO組、RSL3+4. 0 nmo·l L-1 DIO組和RSL3+20. 0 nmol·L-1 DIO 組（ 分別加入100 nmol·L-1 RSL3 溶液和終濃度為0. 8、4. 0 及20. 0 nmol·L-1 DIO 溶液）。繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，每孔加入5 g·L-1 MTT 溶液50 μL，繼續(xù)孵育4 h 后，按照“1. 3”中方法，計算GC-2 細(xì)胞存活率。

1. 5 Western blotting法檢測 RSL3作用不同時間后各組GC-2細(xì)胞中鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平 取對數(shù)生長期GC-2 細(xì)胞，以4×105 mL-1 的細(xì)胞密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， 每孔加入2 mLDMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中過夜，取出后加入100 nmol·L-1 RSL3 溶液分別處理細(xì)胞0、6、12、24、36 和48 h。預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS） 洗滌1 次，裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白并測定蛋白含量，100 ℃加熱10 min 使蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)凝膠電泳轉(zhuǎn)至PVDF 膜后，于5% 脫脂奶粉中封閉1 h。分別加入FTH1（1∶1 000）、GPX4 （1∶1 000）、HO-1 （1∶2 000） 和β-tubulin抗體（1∶40 000），室溫孵育2 h 或4 ℃孵育過夜?；厥找豢?，TBST 溶液洗滌3 次，每次10 min，二抗室溫孵育1 h，TBST 溶液洗滌3 次，每次10 min。于PVDF 膜上滴加化學(xué)發(fā)光液，在凝膠成像儀顯影成像， 以β-tubulin 為內(nèi)參，采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1. 6 試劑盒檢測各組 GC-2 細(xì)胞中 SOD 活性和MDA水平及GSH/GSSG比值 取對數(shù)生長期GC-2細(xì)胞， 以4×105 mL-1 的細(xì)胞密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入2 mL DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。按照“1. 2”中分組及給藥，按照試劑盒說明書操作， 檢測各組GC-2 細(xì)胞中SOD 活性和MDA 水平及GSH/GSSG 比值。

1. 7 免疫熒光法觀察各組 GC-2 細(xì)胞中 ACSL4蛋 白熒光強(qiáng)度 取對數(shù)生長期 GC-2細(xì)胞，以 2×105 mL-1 的細(xì)胞密度接種于預(yù)先加入爬片的6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過夜。按照“1. 2”中分組及給藥，吸去培養(yǎng)基，PBS 緩沖液洗滌1 次。加入1 mL4% 多聚甲醛組織固定液， 固定30 min 后吸棄干凈，PBS 緩沖液洗滌3 次，將爬片取1 塊放置于載玻片上， 圈出染色區(qū)域， PBS 緩沖液輕輕潤洗1 次， 每次5 min。0. 5% Triton X-100 作用10 min后， PBS 緩沖液洗滌3 次， 每次3 min； 用染色封閉液于37 ℃封閉1 h，ACSL4 一抗（1∶100） 滴加至染色區(qū)域，4 ℃孵育過夜；回收一抗，PBS 緩沖液洗滌3 次， 每次5 min； 山羊抗兔二抗（1∶ 10 000）滴加至染色區(qū)域，濕盒中室溫孵育1 h；吸棄二抗，PBS 緩沖液洗滌3 次， 每次5 min， 避光； DAPI溶液（1 ∶ 1 000） 滴加至染色區(qū)域，室溫孵育10 min；吸棄溶液，PBS 緩沖液洗滌3 次，每次5 min， 避光。激光共聚焦顯微鏡采集圖片， 觀察CG-2 細(xì)胞中ACSL4 蛋白熒光強(qiáng)度。以紅色熒光代表ACSL4 蛋白表達(dá)情況，紅色熒光越強(qiáng)，ACSL4蛋白表達(dá)越強(qiáng)； 紅色熒光越弱， ACSL4 蛋白表達(dá)越弱。

1. 8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用 Graphpad Prism 8. 0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。各組細(xì)胞存活率， 細(xì)胞中SOD 活性、MDA 水平和GSH/GSSG 比值及鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布， 以x±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以Plt;0. 05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 不同濃度RSL3和DIO作用后GC-2細(xì)胞存活率 與0 nmol·L-1 RSL3 組比較，50、100、500 和1 000 nmol·L-1 RSL3 組GC-2 細(xì)胞存活率均明顯降低（Plt;0. 01）。與0 μmol·L-1 DIO 組比較， 0. 5、1. 0、5. 0、10. 0 和50. 0 μmol·L-1 DIO 組GC-2 細(xì)胞存活率均明顯降低（Plt;0. 01）。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇100 nmol·L-1 RSL3 作用GC-2 細(xì)胞， DIO 作用濃度lt;0. 1 μmol·L-1。見表1 和2。

2. 2 各組GC-2細(xì)胞存活率 與空白組比較，模型組GC-2 細(xì)胞存活率明顯降低（Plt;0. 01）。與模型組比較，RSL3+20. 0 nmol·L-1 DIO 組細(xì)胞存活率明顯升高（Plt;0. 01）。見表3。

2. 3 RSL3作用不同時間后GC-2細(xì)胞中鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平 與 0 h 比較，RSL3 作用 6 h 時GC-2 細(xì)胞中GPX4 蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 01）， RSL3 作用12 h 時GC-2 細(xì)胞中HO-1 蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 05），GPX4 和FTH1 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），RSL3 作用24 h 時GC-2 細(xì)胞中GPX4 和HO-1 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），RSL3 作用36 和48 h 時GC-2 細(xì)胞中HO-1 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 01）。將100 nmol·L-1RSL3 作用GC-2 細(xì)胞12 h 作為構(gòu)建GC-2 細(xì)胞鐵死亡細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)條件。見圖1 和表4。

2. 4 各組 GC-2 細(xì)胞中 SOD 活性和 MDA 水平及GSH/GSSG比值 與對照組比較，RSL3組GC-2細(xì)胞中MDA 水平明顯升高（Plt;0. 01），SOD 活性和GSH/GSSG 比值均明顯降低（Plt;0. 05）。與RSL3 組 比 較， RSL3 + 0. 8 nmol·L-1 DIO 組、RSL3 + 4. 0 nmol· L-1 DIO 組、 RSL3 +20. 0 nmol·L-1 DIO 組和RSL3+Fer-1 組GC-2 細(xì)胞中SOD 活性均明顯升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），RSL3+20. 0 nmol·L-1 DIO 組和RSL3+Fer-1 組GC-2 細(xì)胞中MDA 水平均明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）， RSL3+4. 0 nmol·L-1 DIO 組、RSL3+20. 0 nmol·L-1 DIO 組和RSL3+Fer-1 組GC-2 細(xì)胞中GSH/GSSG 比值均明顯升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。見表5。

2. 5 各組 GC-2細(xì)胞中 ACSL4蛋白熒光強(qiáng)度 與對照組比較， RSL3 組GC-2 細(xì)胞中ACSL4 蛋白熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。與RSL3 組比較， RSL3+0. 8 nmol·L-1 DIO 組、 RSL3 + 4. 0 nmol·L-1DIO 組、RSL3+20. 0 nmol·L-1 DIO 組和RSL3+Fer-1 組GC-2 細(xì)胞中ACSL4 蛋白熒光強(qiáng)度均明顯減弱。見圖2。

2. 6 各組 GC-2細(xì)胞中鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平 與對照組比較， RSL3 組GC-2 細(xì)胞中HO-1 蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 05），GPX4 和FTH1蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。與RSL3 組比較， RSL3+0. 8 nmol·L-1 DIO 組、RSL3+4. 0 nmol·L-1 DIO 組、RSL3+20. 0 nmol·L-1DIO 組和RSL3+Fer-1 組GC-2 細(xì)胞中HO-1 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），GPX4 和FTH1 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。見圖3 和表6。

3 討 論

男性不育與細(xì)胞中鐵水平有密切關(guān)聯(lián)。研究［15］ 顯示：鐵水平不足時精子數(shù)量減少，進(jìn)而影響男性不育。鐵離子在鐵死亡過程中發(fā)揮重要作用，血液循環(huán)中的Fe3+與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合并運(yùn)輸，通過TFR1 進(jìn)入細(xì)胞后，被還原并釋放至細(xì)胞質(zhì)的不穩(wěn)定鐵池中，多余的鐵貯存于鐵蛋白中。細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定鐵池主要以Fe2+的形式存在，由于Fe2+的不穩(wěn)定性和高反應(yīng)活性， 鐵通過芬頓反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，可直接與細(xì)胞膜和質(zhì)膜中的多不飽和脂肪酸反應(yīng)，產(chǎn)生大量脂質(zhì)活性氧（reactive oxygen species，ROS）， 導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生鐵死亡［16］。研究［17］ 發(fā)現(xiàn)：RSL3 能夠直接抑制GPX4 誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。本研究結(jié)果顯示：RSL3 處理12 h 時鐵死亡相關(guān)蛋白FTH1 和GPX4 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，HO-1 蛋白表達(dá)上調(diào)， 表明RSL3 處理12 h 是GC-2 細(xì)胞鐵死亡模型建立的最適條件。經(jīng)RSL3 處理后GC-2 細(xì)胞中MDA 水平明顯升高， SOD 活性和GSH/GSSG 比值明顯降低， HO-1 蛋白表達(dá)水平明顯升高，GPX4 和FTH1 蛋白表達(dá)水平明顯降低且ACSL4蛋白熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，提示GC-2 細(xì)胞鐵死亡模型造模成功，RSL3 作用的GC-2 細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。

鐵死亡是與鐵代謝及脂質(zhì)代謝相關(guān)的一種新型細(xì)胞死亡方式， 其主要的生化特征表現(xiàn)為ROS聚積、GSH 合成減少、過氧化產(chǎn)物MDA 堆積和Fe2+水平升高［18］。GPX4 作為GSH-Px 家族成員，能夠抑制脂質(zhì)過氧化過程， 將脂質(zhì)氫過氧化物還原為脂質(zhì)醇，使得ROS 累積減少，從而抑制細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生［19］。GSH 是GSH-Px 清除脂質(zhì)過氧化物的必需輔助因子， GSH 減少， GSH-Px 活性降低，細(xì)胞抗過氧化能力降低，脂質(zhì)過氧化物堆積，最后細(xì)胞發(fā)生鐵死亡［20］。HO-1 是由Hmox1 基因編碼的應(yīng)激反應(yīng)酶， 能夠催化血紅素的分解， 產(chǎn)生一氧化碳、亞鐵和膽紅素等一系列具有生物學(xué)效應(yīng)的代謝產(chǎn)物。鐵是血紅素中的重要元素， 因此HO-1 也與鐵代謝密切相關(guān)［21］。HO-1 在組織損傷、炎癥、缺氧和氧化應(yīng)激等情況下會被誘導(dǎo)表達(dá)， 進(jìn)而減少血紅素的蓄積， 促進(jìn)鐵的釋放和轉(zhuǎn)運(yùn)［22］。同時， HO-1 的誘導(dǎo)也可促進(jìn)鐵的儲存和利用， 通過參與鐵代謝調(diào)節(jié)保護(hù)人體免受氧化應(yīng)激等傷害［23-24］。研究［25］ 發(fā)現(xiàn)：肝星狀細(xì)胞中HO-1敲低導(dǎo)致細(xì)胞中ROS 水平升高并誘導(dǎo)鐵死亡，表明HO-1 作為鐵死亡相關(guān)蛋白之一，在鐵死亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。生物體內(nèi)的鐵元素除結(jié)合在血紅蛋白中的鐵離子外， 還有部分儲存于鐵蛋白中。鐵蛋白以可溶性、無毒和易獲取的形式儲存鐵， 對于維持鐵穩(wěn)態(tài)和保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷至關(guān)重要［26］。鐵蛋白主要由FTH1 和FTL 2 個亞基組成。其中FTH1 具有亞鐵氧化酶活性， 可將機(jī)體內(nèi)過剩的鐵催化成Fe3+并儲存于鐵蛋白復(fù)合物中，維持正常的鐵穩(wěn)態(tài)，同時也具有抗氧化應(yīng)激功能，在吸收和釋放鐵方面， 能夠降解自由基有效阻止由過量鐵引起的氧化損害［27-28］。FTH1 參與調(diào)節(jié)多種重要的細(xì)胞過程， 包括細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期和鐵死亡等，與疾病發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)［29-31］。

研究［32］ 證實(shí)：DIO 通過抑制細(xì)胞中ROS 產(chǎn)生和MDA 形成發(fā)揮較強(qiáng)的抗氧化作用，還可通過減輕炎癥和鐵死亡抑制金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的乳腺炎。本研究結(jié)果顯示：DIO 能夠降低RSL3 誘導(dǎo)的小鼠精母細(xì)胞GC-2 中MDA 水平，升高GSH/GSSG 比值和SOD 活性， 并下調(diào)鐵死亡相關(guān)蛋白HO-1 蛋白表達(dá)，上調(diào)GPX4 和FTH1 蛋白表達(dá)。

綜上所述， DIO 可減輕RSL3 處理的GC-2 細(xì)胞中脂質(zhì)過氧化物積累，其機(jī)制可能與抑制HO-1蛋白表達(dá)和上調(diào)GPX4 及FTH1 蛋白表達(dá)有關(guān)。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：馬寶蓮參與研究選題、實(shí)驗(yàn)操作、數(shù)據(jù)收集、整理和統(tǒng)計學(xué)分析及論文撰寫，胡曉雪和艾霄文參與實(shí)驗(yàn)操作及統(tǒng)計學(xué)分析，張永蘭參與研究選題、數(shù)據(jù)收集和整理及論文撰寫和審校。

[參考文獻(xiàn)]

［1］ 石 敏， 桂耀庭， 龍 霞， 等. 小鼠精母細(xì)胞在體外分

化為精子細(xì)胞［J］. 生殖與避孕， 2007， 27（3）： 173-177.

［2］ ZHAO Y， ZHANG H， CUI J G， et al. Ferroptosis is

critical for phthalates driving the blood-testis barrier

dysfunction via targeting transferrin receptor［J］. Redox

Biol， 2023， 59： 102584.

［3］ TANG D L， KROEMER G. Ferroptosis［J］. Curr Biol，

2020， 30（21）： R1292-R1297.

［4］ RYTER S W. Heme oxgenase-1， a cardinal modulator

of regulated cell death and inflammation［J］. Cells，

2021， 10（3）： 515.

［5］ DAI C S， CHEN X， LI J B， et al. Transcription factors

in ferroptotic cell death［J］. Cancer Gene Ther， 2020，

27（9）： 645-656.

［6］ LIU Y， WAN Y C， JIANG Y， et al. GPX4： the hub of

lipid oxidation， ferroptosis， disease and treatment［J］.

Biochim Biophys Acta Rev Cancer， 2023， 1878（3）：

188890.

［7］ WANG J K， ZHANG Z H， SHI F Q， et al.

PM2.5 caused ferroptosis in spermatocyte via overloading

iron and disrupting redox homeostasis［J］. Sci Total

Environ， 2023， 872： 162089.

［8］ RADAELLI E， ASSENMACHER C A， VERRELLE J，

et al. Mitochondrial defects caused by PARL deficiency

lead to arrested spermatogenesis and ferroptosis［J］.

eLife， 2023， 12： e84710.

［9］ HASHEMI M M， BEHNAMPOUR N， NEJABAT M，

et al. Impact of seminal plasma trace elements on human

sperm motility parameters［J］. Rom J Intern Med， 2018，

56（1）： 15-20.

［10］蔡雙蓮， 吳 崢， 吳 進(jìn)， 等. 天然黃酮香葉木素類及

其衍生物的合成與生物活性研究［J］. 有機(jī)化學(xué)， 2012，

32（3）： 560-566.

［11］CHOI J， LEE D H， PARK S Y， et al. Diosmetin

inhibits tumor development and block tumor

angiogenesis in skin cancer［J］. Biomed Pharmacother，

2019， 117： 109091.

［12］LEE H N， SUNG J， KIM Y， et al. Inhibitory effect of

diosmetin on inflammation and lipolysis in coculture of

adipocytes and macrophages ［J］. J Food Biochem，

2020， 44（7）： e13261.

［13］YANG K， LI W F， YU J F， et al. Diosmetin protects

against ischemia/reperfusion-induced acute kidney injury

in mice［J］. J Surg Res， 2017， 214： 69-78.

［14］LIU J F， FU L， YIN F， et al. Diosmetin maintains

barrier integrity by reducing the expression of ABCG2 in

colonic epithelial cells［J］. J Agric Food Chem， 2023，

71（23）： 8931-8940.

［15］JANISZEWSKA E， KOKOT I， KMIECIAK A， et al.

Are there associations between seminal plasma advanced

oxidation protein products and selected redox-associated

biochemical parameters in infertile male patients ？

A preliminary report［J］. Cells， 2022， 11（22）： 3667.

［16］CHEN J Y， YANG X， FANG X X， et al. The role of

ferroptosis in chronic diseases［J］. Zhejiang Da Xue Xue

Bao Yi Xue Ban， 2020， 49（1）： 44-57.

［17］YANG W S， STOCKWELL B R. Ferroptosis： death

by lipid peroxidation［J］. Trends Cell Biol， 2016，

26（3）： 165-176.

［18］ZHENG J S， CONRAD M. The metabolic

underpinnings of ferroptosis［J］. Cell Metab， 2020，

32（6）： 920-937.

［19］BERSUKER K， HENDRICKS J M， LI Z P， et al.

The CoQ oxidoreductase FSP1 acts parallel to GPX4 to

inhibit ferroptosis［J］. Nature， 2019， 575（7784）： 688-692.

［20］MAIORINO M， CONRAD M， URSINI F. GPx4，

lipid peroxidation， and cell death： discoveries，

rediscoveries， and open issues ［J］. Antioxid Redox

Signal， 2018， 29（1）： 61-74.

［21］CARR J， LA P， DENNERY P. Heme oxygenase-1 is

required for iron homeostasis and mitochondrial

respiration［J］. Free Radic Biol Med， 2018， 128： S81.

［22］YANATORI I， RICHARDSON D R， TOYOKUNI S，

et al. The iron chaperone poly（rC）-binding protein 2

forms a metabolon with the heme oxygenase 1/

cytochrome P450 reductase complex for heme catabolism

and iron transfer［J］. J Biol Chem， 2017， 292（32）：

13205-13229.

［23］NYBAKKEN G， GRATZINGER D. Myelodysplastic

syndrome macrophages have aberrant iron storage and

heme oxygenase-1 expression［J］. Leuk Lymphoma，

2016， 57（8）： 1893-1902.

［24］ROCHA E R， BERGONIA H A， GERDES S， et al.

Bacteroides fragilis requires the ferrous-iron transporter

FeoAB and the CobN-like proteins BtuS1 and BtuS2 for

assimilation of iron released from heme［J］. Microbiol

Open， 2019， 8（4）： e00669.

［25］LUO P， LIU D D， ZHANG Q， et al. Celastrol induces

ferroptosis in activated HSCs to ameliorate hepatic

fibrosis via targeting peroxiredoxins and HO-1［J］. Acta

Pharm Sin B， 2022， 12（5）： 2300-2314.

［26］AJOOLABADY A， ASLKHODAPASANDHOKMABAD H，

LIBBY P， et al. Ferritinophagy and ferroptosis in the

management of metabolic diseases ［J］. Trends

Endocrinol Metab， 2021， 32（7）： 444-462.

［27］HU W Y， ZHOU C T， JING Q G， et al. FTH

promotes the proliferation and renders the HCC cells

specifically resist to ferroptosis by maintaining iron

homeostasis［J］. Cancer Cell Int， 2021， 21（1）： 709.

［28］OMIYA S， ITO J， OTSU K. Labile iron derived from

autophagy-mediated ferritin degradation in

cardiomyocytes under pressure overload increases

myocardial oxidative stress and develops heart failure

in mice［J］. Eur Heart J， 2021， 42（Supplement 1）：

ehab724.0747.

［29］SHAO Y， ZUO X. PTPRC inhibits ferroptosis of

osteosarcoma cells via blocking TFEB/FTH1

signaling［J］. Mol Biotechnol， 2024， 66（10）： 2985-2994.

［30］LIU F， DU Z Y， HE J L， et al. FTH1 binds to Daxx

and inhibits Daxx-mediated cell apoptosis［J］. Mol Biol

Rep， 2012， 39（2）： 873-879.

［31］ZHANG R N， PAN T， XIANG Y， et al. Curcumenol

triggered ferroptosis in lung cancer cells via lncRNA

H19/miR-19b-3p/FTH1 axis［J］. Bioact Mater， 2021，

13： 23-36.

［32］ZHAO L H， JIN L， YANG B. Diosmetin alleviates S.

aureus-induced mastitis by inhibiting SIRT1/GPX4

mediated ferroptosis［J］. Life Sci， 2023， 331： 122060.