PRP對膝骨關節(jié)炎大鼠滑膜巨噬細胞極化影響及機制

［摘要］ 目的 探討富血小板血漿（PRP）對膝骨關節(jié)炎（KOA）大鼠滑膜巨噬細胞的影響及其機制。

方法選取健康雄性SD大鼠9只，隨機分成假手術組、碘乙酸單鈉（MIA）組和PRP組。通過在關節(jié)腔內(nèi)注射1 mg的MIA建立KOA大鼠模型。采用免疫組織化學染色方法檢測滑膜組織誘導型一氧化氮合酶（iNOS）和清道夫受體163（CD163）蛋白表達水平。同時，體外采用PRP處理脂多糖（LPS）誘導后的RAW264.7細胞，采用Western blot檢測細胞中iNOS、CD163、絲氨酸/蘇氨酸激酶蛋白（Akt）和磷酸化Akt（p-Akt）蛋白的表達量；采用ELISA方法檢測巨噬細胞分泌的細胞因子白細胞介素-1β和10（IL-1β和IL-10）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達。

結果 與MIA組大鼠相比，PRP組滑膜組織中iNOS蛋白（M 1型巨噬細胞標志物）水平顯著降低，CD163蛋白（M 2型巨噬細胞標志物）水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（F=191.30、28.70，q=6.44～27.5 P＜0.01）。體外實驗結果顯示，與LPS組相比，經(jīng)PRP處理后的RAW264.7細胞的iNOS蛋白及p-Akt/Akt蛋白的表達顯著降低，CD163蛋白表達顯著升高，TNF-α和IL-1β表達顯著降低，IL-10表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（F=8.64～257.50，q=2.73～37.05，P＜0.05）。

結論 PRP可調(diào)節(jié)KOA滑膜中M 1型巨噬細胞向M 2型巨噬細胞轉(zhuǎn)化，延緩KOA的進展，其機制可能與抑制巨噬細胞的PI3K/Akt信號通路活化有關。

［關鍵詞］ 骨關節(jié)炎，膝；富血小板血漿；巨噬細胞活化；滑膜；一氧化氮合酶；大鼠，Sprague-Dawley

［中圖分類號］ R684.3;R457.14

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 2096-5532（2024）06-0835-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.192

［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

［網(wǎng)絡出版］ https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20250107.1658.001;2025-01-08 10：05：05

Effect of platelet-rich plasma on synovial macrophage polarization in rats with knee osteoarthritis and its mechanism

XU Jiawei， ZHANG Xiyue， ZHAO Ge， WANG Lin， WANG Junwei， LI Tieshan

（Department of Rehabilitation Medicine， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 26600 "China）

［Abstract］ Objective To investigate the effect of platelet-rich plasma （PRP） on synovial macrophages and its mechanism in rats with knee osteoarthritis （KOA）.

Methods "Nine healthy male Sprague-Dawley rats were selected and randomly divided into sham-operation group， monosodium iodoacetate （MIA） group， and PRP group. Intra-articular injection of 1 mg MIA was used to establish a rat model of KOA， and immunohistochemistry was used to measure the protein expression levels of inducible nitric oxi-

de synthase （iNOS） and scavenger receptor 163 （CD163） in synovial tissue. Meanwhile， RAW264.7 cells induced by lipopolysaccharide （LPS） were treated with PRP in vitro， and Western blot was used to measure the protein expression levels of iNOS， CD16 "serine/threonine kinase protein （Akt）， and phosphorylated Akt （p-Akt） in cells. ELISA was used to measure the expression of the cytokines interleukin-1β （IL-1β）， interleukin-10 （IL-10）， and tumor necrosis factor-α （TNF-α） secreted by macrophages.

Results "Compared with the MIA group， the PRP group had a significant reduction in the level of the M 1 macrophage mar-

ker iNOS protein and a significant increase in the level of the M 2 macrophage marker CD163 proteinin synovial tissue （F=191.30，28.70;q=6.44-27.51;Plt;0.01）. In vitro experiments showed that compared with the LPS group， the RAW264.7 cells treated by PRP had significant reductions in the protein expression levels of iNOS and p-Akt/Akt and a significant increase in the protein expression level of CD16 "as well as significant reductions in the expression levels of TNF-α and IL-1β， and a significant increase in the expression level of IL-10 （F=8.64-257.50，q=2.73-37.05，Plt;0.05）.

Conclusion PRP can regulate the transformation of M 1 macrophages into M 2 macrophages in the synovial membrane of KOA and delay the progression of KOA， possibly by inhibiting the activation of the PI3K/AKT signaling pathway in macrophages.

［Key words］ osteoarthritis， knee; platelet-rich plasma; macrophage activation; synovial membrane; nitric oxide synthase; rats， Sprague-Dawley

膝骨關節(jié)炎（KOA）是一種以滑膜炎和關節(jié)軟骨退變?yōu)樘卣鞯穆?、低度炎癥性關節(jié)疾病^[1]。大量研究表明，M 1/M 2型滑膜巨噬細胞的極化失衡在KOA的發(fā)生發(fā)展中起著關鍵作用^[2-4]。M 1型巨噬細胞又稱促炎性巨噬細胞，可分泌多種炎性物質(zhì)，包括白細胞介素（IL）-1β和6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，主要參與炎癥的啟動和放大過程^[5]。相反，M 2型巨噬細胞為抗炎表型的巨噬細胞，可分泌IL-10等細胞因子，這些細胞因子對血管重塑和組織愈合至關重要^[6]。因此，調(diào)節(jié)M 1/M 2型巨噬細胞平衡可能是一種很有前景的KOA治療策略。富血小板血漿（PRP）是從自體全血中提取的血小板濃縮物，通過釋放多種生長因子和細胞因子發(fā)揮抗炎和再生作用，在臨床上可用于治療KOA^[7]。研究表明，由于濃縮的血小板的特性，PRP不僅對軟骨細胞具有修復作用，還可以啟動和調(diào)節(jié)先天免疫系統(tǒng)，減弱炎癥反應^[8-9]。有研究結果顯示，多次注射PRP可能會調(diào)節(jié)KOA滑膜中M 1和M 2型巨噬細胞之間的平衡，減輕疼痛和滑膜炎癥^[10]。但是，關于PRP調(diào)節(jié)KOA滑膜巨噬細胞表型轉(zhuǎn)化的具體機制尚未明確。因此，本研究通過建立KOA大鼠模型和體外細胞模型，進一步探究PRP對滑膜巨噬細胞影響及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑及來源 碘乙酸單鈉（MIA）、異氟烷購自美國Sigma公司，β-actin單克隆抗體、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）重組抗體以及HRP 標記的山羊抗鼠IgG二抗購自武漢Proteintech公司，清道夫受體163（CD163）多克隆抗體購自北京Bioss公司，絲氨酸/蘇氨酸激酶蛋白（Akt）和磷酸化Akt（p-Akt）抗體購自武漢abclonal公司，TNF-α、IL-1β和IL-10 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自江蘇晶美生物科技有限公司。小鼠RAW264.7細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.2 PRP制備 選取6只健康雄性大鼠，用含體積分數(shù)0.05異氟烷的氧氣麻醉，經(jīng)腹主動脈穿刺采集大鼠全血，注入含38 g/L枸櫞酸鈉的離心管中，以800 r/min離心15 min，從抗凝血液中獲得PRP。將得到的PRP在－80 ℃冷凍24 h，然后于37 ℃孵育1 h以活化PRP，最后將活化的PRP以12 000 r/min離心5 min分離碎片，收集上清液置于－80 ℃保存待用。

1.1.3 動物分組及處理 15只8周齡的SPF級雄性SD大鼠由青島大學實驗動物中心提供，所有大鼠適應環(huán)境1周后再進行實驗。將9只大鼠按照數(shù)字表法隨機分成假手術組、MIA組和PRP組。將1 mg的MIA溶解于60 μL生理鹽水中，注入MIA組和PRP組大鼠的左膝關節(jié)腔內(nèi)構建KOA模型，假手術組注射等量生理鹽水。在MIA注射后第3、5、7天，PRP組分別于左膝關節(jié)腔內(nèi)注射60 μL的PRP，假手術組和MIA組注射等量生理鹽水。在第12天處死各組大鼠分別取其滑膜組織進行分子生物學檢測。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及處理 RAW264.7細胞在37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO 2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含體積分數(shù)0.10胎牛血清的DMEM。將細胞分為對照組（A組）、脂多糖（LPS）組（B組）、PRP組（C組）和抑制劑組（D組）共4組。各組處理方法如下：A組，不做任何處理；B和C組，加1 mg/L LPS，C組再加體積分數(shù)0.1 PRP；D組，加10 mmol/L PI3K抑制劑（LY294002）和1 mg/L LPS。

1.2.2 免疫組織化學染色 按照文獻方法^[11]，將采集的滑膜組織在40 g/L多聚甲醛溶液中固定24 h，石蠟包埋切片，置檸檬酸鈉緩沖液中并微波爐加熱10 min。PBS洗滌后，加入2滴體積分數(shù)0.03的H 2O 2-甲醇溶液，室溫封閉10 min。PBS洗滌后，將切片置于體積分數(shù)0.01牛血清清蛋白中室溫孵育20 min，然后與CD163抗體或iNOS抗體4 ℃孵育過夜。PBS沖洗切片后，加入二抗室溫孵育20 min，顯色復染，脫水密封。倒置熒光顯微鏡下觀察染色切片并獲得免疫組化圖像，通過Image J軟件計算CD163和iNOS的表達面積及其細胞染色陽性率。

1.2.3 Western blot檢測 各組細胞經(jīng)處理后裂解并4 ℃離心收集上清液，使用BCA試劑盒測量蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)樣品通過SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上并用50 g/L脫脂奶粉在室溫下封閉1 h，加入一抗4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次后加入二抗室溫孵育1 h。TBST洗膜后顯影，使用凝膠成像系統(tǒng)定量蛋白質(zhì)，用Image J軟件測量條帶灰度值并計算蛋白相對表達量。

1.2.4 ELISA檢測 各組細胞經(jīng)過處理后，收集培養(yǎng)液并離心取上清，用相應的ELISA試劑盒并按照說明書要求分別測量細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-10的表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理

使用Graph Pad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料數(shù)據(jù)以±s形式表示，所有實驗均重復3次。多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，繼以Tukey’s多重對比法進行兩兩比較。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結" 果

2.1 PRP對大鼠滑膜巨噬細胞極化的影響

免疫組織化學染色檢測結果表明，各組iNOS（M 1型巨噬細胞標志物）和CD163（M 2型巨噬細胞標志物）陽性細胞染色比例的相對表達量比較，差異具有顯著性（F=191.30、28.70，P＜0.01）。與假手術組相比，MIA組iNOS陽性細胞染色比例顯著升高（q=27.5 P＜0.01），CD163陽性細胞染色比例差異無顯著性（q=4.19，P＞0.05）；與MIA組相比，PRP組iNOS陽性細胞染色比例顯著降低（q=11.2 P＜0.01），CD163陽性細胞染色比例顯著升高（q=6.4 P＜0.01）。見表1。

2.2 PRP對RAW264.7細胞M 1極化影響

Western blot結果顯示，4組iNOS和CD163蛋白表達比較，差異具有顯著性（F=37.78、8.6 P＜0.01）。與對照組比較，LPS組細胞iNOS蛋白相對表達量顯著升高（q=14.08，P＜0.01），CD163表達顯著降低（q=7.06，P＜0.01）；與LPS組比較，PRP組細胞iNOS蛋白相對表達量顯著降低（q=9.5 P＜0.01），CD163表達則顯著升高（q=2.7 P＜0.05）；與抑制劑組相比，PRP組細胞iNOS和CD163蛋白相對表達量差異均無顯著性（q=2.02、0.90，P＞0.05）。見圖1和表2。

2.3 PRP對RAW264.7細胞p-Akt磷酸化蛋白表達影響

Western blot結果顯示，各組間p-Akt磷酸化蛋白的相對表達量比較，差異具有顯著意義（F=44.66，P＜0.01）。與對照組比較，LPS組細胞的p-Akt磷酸化蛋白的相對表達量顯著升高（q=15.4 P＜0.01）；與LPS組相比較，PRP組細胞的p-Akt磷酸化蛋白的相對表達量顯著降低（q=7.8 P＜0.01）。見圖2和表2。

2.4 PRP對RAW264.7細胞因子表達影響

ELISA檢測結果顯示，4組細胞分泌的細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-10的表達水平比較，差異具有顯著性（F=74.58～257.50，P＜0.01）。與對照組相比較，LPS組細胞TNF-α和IL-1β含量均明顯升高（q=22.42、37.05，P＜0.01），IL-10含量明顯降低（q=13.86，P＜0.01）。與LPS組相比，PRP組細胞TNF-α和IL-1β的含量明顯降低（q=12.23、15.4 P＜0.01），IL-10的含量則明顯升高（q=20.39，P＜0.01）；抑制劑組細胞TNF-α和IL-1β含量均明顯降低（q=17.35、27.79，P＜0.01），IL-10含量則明顯升高（q=8.39，P＜0.01）。見表2。

3 討" 論

在病理學上，KOA是一種慢性炎癥狀態(tài)，可導致疼痛、進行性軟骨功能破壞和退化^[12-13]。當關節(jié)受到破壞產(chǎn)生炎癥時，骨髓來源的單核細胞遷移到損傷部位進一步分化為M 1型或M 2型巨噬細胞^[14]，并且滑膜巨噬細胞向M 1表型的極化失衡已經(jīng)在KOA病人和小鼠模型中得到證實^[15-16]。本文研究結果顯示，與假手術組相比，MIA組大鼠滑膜M 1型巨噬細胞標記物iNOS蛋白表達顯著升高，M 2型標記物CD163蛋白表達無顯著變化，表明M 1/M 2巨噬細胞的比例顯著升高，提示KOA大鼠滑膜巨噬細胞極化為M 1表型。有研究發(fā)現(xiàn)，在KOA炎癥的早期階段，M 1型巨噬細胞占主要地位，其數(shù)量約是M 2型巨噬細胞的4.8倍^[17]。有研究結果表明，M 1型巨噬細胞過度釋放破壞性細胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6等）和趨化因子可導致關節(jié)軟骨損傷^[18]。但DAI等^[19]報道，促進巨噬細胞向M 2型極化，釋放IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子-α等，可促進骨關節(jié)炎的軟骨修復。因此，靶向巨噬細胞極化是延緩KOA進展的有效手段之一。

PRP具有抑制軟骨細胞凋亡、促進骨和血管重塑、調(diào)節(jié)炎癥等作用^[20]。由于這些特性，PRP已成為治療KOA一種可行的方法^[21]。但關于PRP治療KOA的機制目前尚不確切。本文研究結果顯示，與MIA組比較，PRP組大鼠M 1型巨噬細胞標記物iNOS蛋白表達顯著降低，M 2型標記物CD163蛋白表達顯著升高，表明經(jīng)PRP治療后，M 1/M 2巨噬細胞的比例顯著降低，證明PRP治療可以促進KOA滑膜中M 1型巨噬細胞向M 2型轉(zhuǎn)化。同時，本文體外實驗Western blot結果顯示，與LPS組相比，PRP組iNOS蛋白表達顯著降低，CD163蛋白表達顯著升高，與體內(nèi)實驗結果一致。有研究發(fā)現(xiàn)，在單核細胞和M 1型巨噬細胞的培養(yǎng)液中加入PRP上清液，都可以促進M 2型巨噬細胞的極化^[22]。研究也證實，促進M 1型巨噬細胞向M 2型轉(zhuǎn)化，可調(diào)控軟骨細胞外基質(zhì)的微環(huán)境，延緩KOA的發(fā)生發(fā)展^[23]。因此，PRP延緩KOA發(fā)生發(fā)展的機制可能是促進了滑膜M 1型巨噬細胞向M 2型極化，但關于PRP是如何調(diào)節(jié)滑膜巨噬細胞表型轉(zhuǎn)化的具體機制目前尚不清楚。

業(yè)已證實，PI3K/Akt/mTOR通路介導多種受體的信號，包括病原體相關分子模式受體、細胞因子受體等^[24]。PI3K/Akt信號通路在巨噬細胞生物功能和炎癥疾病調(diào)節(jié)中具有獨特的作用，已成為巨噬細胞活化表型的中心調(diào)節(jié)因子^[25]。本文體外實驗Western blot檢測結果顯示，與對照組相比，LPS組細胞iNOS蛋白的表達顯著升高，p-Akt磷酸化蛋白的表達顯著升高，提示LPS成功使巨噬細胞上的PI3K/Akt信號通路活化。與LPS組比較，PRP組細胞p-Akt磷酸化蛋白表達顯著降低，提示PRP能抑制Akt蛋白的磷酸化，其機制可能是通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路抑制滑膜巨噬細胞向M 1型巨噬細胞極化。大量研究表明，針對PI3K/Akt信號通路的各種藥物能抑制M 1型巨噬細胞的極化^[26]。YAN等^[27]研究發(fā)現(xiàn)，尼達尼布通過抑制MAPK/PI3K-Akt通路活化，抑制滑膜巨噬細胞向M 1型的極化，從而減輕小鼠骨關節(jié)炎引起的滑膜炎癥和纖維化。MENG等^[28]的研究顯示，二甲雙胍可以調(diào)節(jié)M 1巨噬細胞的PI3K/Akt及其下游通路，阻礙滑膜巨噬細胞向M 1型的極化，減輕軟骨丟失。因此，我們認為PRP可以通過抑制PI3K/Akt信號通路使巨噬細胞從M 1表型向M 2表型轉(zhuǎn)化，從而減緩KOA進展。此外，本研究還通過ELISA方法檢測了巨噬細胞分泌的下游細胞因子。本文研究結果顯示，與LPS組相比，PRP組M 1型巨噬細胞分泌的細胞因子TNF-α和IL-1β含量明顯降低，M 2型巨噬細胞分泌的細胞因子IL-10含量明顯升高，進一步表明PRP可抑制滑膜巨噬細胞向M 1型的極化。

綜上所述，本文PRP對KOA大鼠滑膜巨噬細胞極化影響的研究結果表明，PRP可以促進M 1型巨噬細胞向M 2型轉(zhuǎn)化，其機制可能與抑制滑膜巨噬細胞的PI3K/AKT信號通路活化有關，本研究結果可為臨床上使用PRP治療KOA提供理論依據(jù)。但是，由于本研究中體外實驗的M 1和M 2型巨噬細胞是兩個極端，它們可能并不能充分反映體內(nèi)組織巨噬細胞的復雜性和可塑性，因此，未來還需要進行進一步的研究。

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（本文編輯 于國藝）