lncRNA DLEU2對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞行為影響

［摘要］ 目的 探討長鏈非編碼RNA（lncRNA）淋巴細(xì)胞白血病缺失基因2（DLEU2）在肝細(xì)胞癌（HCC）中的生物學(xué)功能及潛在的分子作用機(jī)制。

方法 通過檢索GEPIA數(shù)據(jù)庫，預(yù)測lncRNA DLEU2在HCC組織和癌旁組織中的表達(dá)情況；利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測標(biāo)本中l(wèi)ncRNA DLEU2表達(dá)情況；采用qRT-PCR確定體外培養(yǎng)人正常肝細(xì)胞HL-7702和HCC細(xì)胞系（Huh7、HepG2和MHCC97-H）細(xì)胞中DLEU2表達(dá)。在Huh7和MHCC97-H細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染si-DLEU 通過qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染效率；采用CCK-8法檢測各組細(xì)胞增殖能力；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞遷移和侵襲能力；小管形成實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的血管生成能力；蛋白免疫印跡（Western blot）檢測血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K）、蘇氨酸蛋白激酶（AKT）及磷酸化蘇氨酸蛋白激酶（p-AKT）蛋白表達(dá)。

結(jié)果 與癌旁組織相比，DLEU2在HCC組織中高表達(dá)（t=17.89 Plt;0.05）。與人正常肝細(xì)胞HL-7702相比，DLEU2在HCC細(xì)胞系Huh7、HepG2和MHCC97-H中均高表達(dá)（t=5.412～8.988，Plt;0.05）。下調(diào)lncRNA DLEU2表達(dá)可抑制HCC細(xì)胞Huh7和MHCC97-H細(xì)胞增殖、遷移和侵襲、血管生成（t=4.012～56.51 Plt;0.05），并降低VEGFA、p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT水平（t=7.903～24.71 Plt;0.05）。

結(jié)論 lncRNA DLEU2在HCC組織和HCC細(xì)胞系中高表達(dá)，下調(diào)lncRNA DLEU2的表達(dá)可以降低PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)，從而抑制HCC細(xì)胞Huh7和MHCC97-H的增殖、遷移、侵襲以及血管生成。

［關(guān)鍵詞］ 癌，肝細(xì)胞；RNA，長鏈非編碼；細(xì)胞增殖；腫瘤浸潤；新生血管化，病理性；PI3K/AKT信號(hào)通路

［中圖分類號(hào)］ R730.261;R342.2

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

［文章編號(hào)］ 2096-5532（2024）06-0825-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.179

［開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）］

［網(wǎng)絡(luò)出版］ https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20241231.1451.008;2025-01-02 13：06：27

Effects of lncRNA DLEU2 on the behavior of hepatocellular carcinoma cells

ZHANG Xinliang， YANG Nanmu

（Department of General Surgery， Henan Veterans Hospital， Xinxiang 453000， China）

［Abstract］ Objective To investigate the biological functions of the long non-coding RNA deleted in lymphocytic leukemia 2 （DLEU2） in hepatocellular carcinoma （HCC） and the potential molecular mechanisms.

Methods "The expression of DLEU2 in HCC and paracancerous tissues was analyzed using Gene Expression Profiling Interactive Analysis. Quantitative real-time polyme-

rase chain reaction （qRT-PCR） was used to measure the expression of DLEU2 in collected samples and in-vitro cultured normal human hepatic cell line HL-7702 and HCC cell lines （Huh7， HepG "and MHCC97-H）. Huh7 and MHCC97-H cells were transfected with si-DLEU2. The transfection efficiency was determined by qRT-PCR. Cell proliferation was determined using Cell Counting Kit-8. Cell migration and invasion were measured by wound healing assay and Transwell assay. The angiogenesis of cells was mea-

sured by tube formation assay. Western blot was used to determine the protein expression levels of vascular endothelial growth factor A （VEGFA）， phosphatidylinositol-3-kinase （PI3K）， phosphorylated phosphatidylinositol-3-kinase （p-PI3K）， threonine protein kinase （AKT）， and phosphorylated threonine protein kinase （p-AKT）.

Results "The expression of DLEU2 in HCC tissues was significantly higher than that in paracancerous tissues （t=17.89 Plt;0.05）. DLEU2 expression was significantly higher in Huh7， HepG "and MHCC97-H cells than in HL-7702 cells （t=5.412-8.988，Plt;0.05）. Down-regulating the expression of DLEU2 significantly inhibited the proliferation， migration， invasion， and angiogenesis of Huh7 and MHCC97-H cells （t=4.012-56.51 Plt;0.05）， and significantly reduced the protein expression of VEGFA， p-PI3K/PI3K， and p-AKT/AKT （t=7.903-24.71 Plt;0.05）.

Conclusion DLEU2 is highly expressed in HCC tissues and HCC cell lines. Down-regulating DLEU2 expression can reduce the expression of PI3K/AKT pathway-related proteins， thereby inhibiting the proliferation， migration， invasion， and angiogenesis of HCC Huh7 and MHCC97-H cells.

［Key words］ carcinoma， hepatocellular; RNA， long non-coding; cell proliferation; neoplasm invasiveness; neovascularization， pathologic; PI3K/AKT signaling pathway

肝癌是第六大最常見的癌癥類型，而肝細(xì)胞癌 （HCC）占所有肝癌的90% ^[1-2]。目前，HCC病人的5年生存率不到20%，轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率較高^[3]。臨床上受多種因素影響，HCC的靶標(biāo)分子仍難確定，難以實(shí)現(xiàn)早期診斷。因此，迫切需要對(duì)HCC的分子異質(zhì)性及其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入闡釋。長鏈非編碼RNA （lncRNA）是長度超過200個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄本，在癌癥發(fā)生和發(fā)展中具有致癌或抑癌功能^[4-6]。淋巴細(xì)胞白血病缺失基因2（DLEU2） 被證實(shí)與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)^[7-9]，但其在HCC中的分子作用機(jī)制仍然不清楚。本研究旨在探討lncRNA DLEU2在HCC中的表達(dá)水平及其對(duì)HCC發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)作用及分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞和試劑 人肝癌細(xì)胞系（Huh7、HepG2和MHCC97-H）和人正常肝細(xì)胞（HL-7702）均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC，美國）；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)液均購自美國HyClone公司；10 g/L青霉素-鏈霉素溶液、CCK-8試劑、RIPA蛋白裂解液及BCA蛋白定量試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；TRIzol試劑、SYBR Green和Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司；Transwell小室和Matrigel膠均購自美國Corning公司；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（ECL）和聚偏氟乙烯（PVDF）膜試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；蘇氨酸蛋白激酶（AKT）抗體、磷酸化蘇氨酸蛋白激酶（p-AKT）抗體、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抗體、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K）抗體、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）抗體、GAPDH和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗小鼠IgG均購自美國Proteintech公司；Prime Script First Strand cDNA Synthesis試劑盒購自日本Takara公司；靶向lncRNA DLEU2（si-DLEU2）及其陰性對(duì)照物（si-NC）購自廣州銳博生物科技有限公司。

1.1.2 標(biāo)本收集 選取2021年1月—2022年6月在河南省榮軍醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療的15例HCC病人的癌組織及其癌旁正常組織，-80 ℃保存。其中HCC組織標(biāo)本經(jīng)本院病理科醫(yī)生診斷，并且本研究得到該醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 通過檢索GEPIA數(shù)據(jù)庫（http：//gepia.cancer-pku.cn/），確定HCC組織和癌旁組織中l(wèi)ncRNA DLEU2的表達(dá)水平。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 所有細(xì)胞置于溫度為37 ℃和含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO 2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，應(yīng)用含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清和10 g/L青霉素-鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)液行常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將5×10⁵個(gè)處于對(duì)數(shù)生長期的Huh7和MHCC97-H細(xì)胞分別鋪于6孔板中。待細(xì)胞貼壁后，按照ZHOU等^[10]的操作方法，將si-DLEU2及si-NC轉(zhuǎn)染到Huh7和MHCC97-H細(xì)胞中。隨后，利用qRT-PCR確定si-DLEU2的試劑用量和收集時(shí)間。

1.2.4 CCK-8實(shí)驗(yàn) 將CCK-8試劑分別于0、24、48、72 h加入96孔板（含Huh7或MHCC97-H細(xì)胞，每孔2×10³個(gè)）中。37 ℃避光孵育60 min后，使用多功能酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific公司，美國）測定450 nm波長處的吸光度。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)與Transwell實(shí)驗(yàn) 將經(jīng)過轉(zhuǎn)染處理的Huh7或MHCC97-H細(xì)胞以每孔1×10⁶個(gè)的密度接種于6孔板中進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)，48 h后，培養(yǎng)至80%匯合率。用10 μL無菌移液器在6孔板中劃直線，使用PBS清洗去除未貼壁細(xì)胞。24 h后，使用光學(xué)顯微鏡獲取鏡下細(xì)胞劃痕。使用Matrigel膠灌注的Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞侵襲檢測。Huh7或者M(jìn)HCC97-H細(xì)胞（均為8×10⁴個(gè)）培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基的上室，下室則添加含有體積分?jǐn)?shù)0.10 FBS的培養(yǎng)基。孵育48 h后，將膜上的細(xì)胞用甲醇25 ℃固定20 min，然后用1 g/L結(jié)晶紫孵育15 min。最后，使用光鏡獲取圖像。

1.2.6 小管形成實(shí)驗(yàn) 將Matrigel膠溶解后用緩沖液等量稀釋，于37 ℃下至基質(zhì)膠成固體狀。利用DMEM完全培養(yǎng)液重懸Huh7或MHCC97-H細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，以每孔1×10⁴個(gè)的密度接種于鋪有Matrigel膠的96孔板內(nèi)，培養(yǎng)12 h后，觀察各組成管效果。采用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.2.7 總蛋白的提取及Western blot實(shí)驗(yàn) 使用RIPA緩沖液從待測細(xì)胞中獲得細(xì)胞裂解液，20 μg蛋白樣本經(jīng)100 g/L 的SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用50 g/L脫脂牛奶室溫封閉2 h后，分別用anti-GAPDH（1∶3 000）、anti-AKT（1∶500）、anti-p-AKT（1∶1 000）、anti-PI3K（1∶1 000）、anti-p-PI3K（1∶1 000）、anti-VEGFA一抗（1∶100）4 ℃孵育過夜。以PBS清洗3次。用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗小鼠IgG （H+L）二抗室溫孵育2 h，PBS清洗3次后，使用ECL試劑對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行可視化分析。

1.2.8 總RNA提取及qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 按照說明書方法利用TRIzol試劑分別提取待測細(xì)胞和組織樣本中的總RNA。根據(jù)Prime Script First Strand cDNA Synthesis試劑盒說明書方法合成cDNA，以GAPDH作為內(nèi)參照。隨后使用SYBR Green進(jìn)行l(wèi)ncRNA和mRNA的qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)條件：95 ℃、10 min，55 ℃、2 min，72 ℃、2 min，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，共40個(gè)循環(huán)。用2^-△△Ct法計(jì)算lncRNA DLEU2相對(duì)表達(dá)量。PCR所用引物及其序列見表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s形式表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以Plt;0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)" 果

2.1 lncRNA DLEU2在HCC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)

通過檢索GEPIA數(shù)據(jù)庫預(yù)測lncRNA DLEU2在HCC組織和癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量的結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，lncRNA DLEU2在HCC組織中高表達(dá)（Plt;0.05）。見圖1A。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了上述預(yù)測結(jié)果（t=17.89 Plt;0.05）。見圖1B。同時(shí)，通過qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測了lncRNA DLEU2在人正常肝細(xì)胞HL-7702和HCC細(xì)胞系（Huh7、HepG2和MHCC97-H） 中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與人正常肝細(xì)胞HL-7702相比，lncRNA DLEU2在HCC細(xì)胞系中高表達(dá)（t=5.412～8.988，Plt;0.05）。見圖1C。

2.2 下調(diào)lncRNA DLEU2表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖影響

利用轉(zhuǎn)染si-DLEU2以降低細(xì)胞中l(wèi)ncRNA DLEU2表達(dá)量驗(yàn)證其在HCC中的生物學(xué)功能；利用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染不同用量si-DLEU2（50、100 nmol/L）在不同細(xì)胞收集時(shí)間（24和48 h）對(duì)lncRNA DLEU2相對(duì)表達(dá)量的影響確定轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，當(dāng)si-DLEU2用量為100 nmol/L且轉(zhuǎn)染后48 h時(shí)，轉(zhuǎn)染效率最佳。見圖2A～D。隨后，利用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測不同時(shí)間點(diǎn)（0、24、48和72 h）各組細(xì)胞的增殖能力。檢測結(jié)果顯示，與si-NC組相比較，在72 h時(shí)si-DLEU2組中Huh7和MHCC97-H細(xì)胞活力均顯著降低，差異有顯著性（t=7.221、9.21 Plt;0.05）。見圖2E、F。

2.3 低表達(dá)lncRNA DLEU2對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲影響

通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)以及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測lncRNA DLEU2對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的影響。細(xì)胞的遷移實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)Huh7和MHCC97-H細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-DLEU2后，細(xì)胞遷移能力受到明顯抑制（t=8.276、8.01 Plt;0.05）。見圖3A。與si-NC組相比，si-DLEU2組Huh7和MHCC97-H細(xì)胞的侵襲能力顯著下降（t=56.512、9.708，Plt;0.05）。見圖3B。

2.4 下調(diào)lncRNA DLEU2表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞血管生成能力影響

通過小管形成實(shí)驗(yàn)檢測lncRNA DLEU2對(duì)HCC細(xì)胞Huh7和MHCC97-H血管分支點(diǎn)數(shù)的影響。結(jié)果顯示，與si-NC組相比較，si-DLEU2組Huh7和MHCC97-H細(xì)胞中形成的分支點(diǎn)數(shù)顯著減少（t=4.111、4.01 Plt;0.05）。見圖4A。通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測血管內(nèi)皮生長因子VEGFA的蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，與si-NC組細(xì)胞比較，si-DLEU2組MHCC97-H和Huh7細(xì)胞的VEGFA蛋白表達(dá)明顯降低（t=8.814、7.90 Plt;0.05）。見圖4B。

2.5 下調(diào)lncRNA DLEU2表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路活性影響

通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，確定lncRNA DLEU2對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的影響。結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-DLEU2組MHCC97-H和Huh7細(xì)胞中PI3K/p-PI3K和AKT/p-AKT蛋白表達(dá)比值均降低（t=8.134～24.71 Plt;0.05）。見圖5。

3 討" 論

HCC是原發(fā)性肝癌中最常見的病理類型，也是全球與癌癥相關(guān)死亡的第三大原因，主要與肝硬化和許多其他慢性肝病有關(guān)^[11]。我國HCC的發(fā)病率約占全球的50%左右。該病的特點(diǎn)是復(fù)發(fā)率高，手術(shù)切除后易轉(zhuǎn)移，對(duì)化療和放療耐受性較強(qiáng)，病人的生存率很低，預(yù)后很差。迄今為止，雖然已開發(fā)了許多新藥如索拉非尼等靶向藥物用于HCC治療，但HCC的5年總生存率僅為18.1%^[12]。因此，迫切需要深入探索HCC發(fā)病機(jī)制、尋找新的治療靶點(diǎn)，為HCC的早期發(fā)現(xiàn)和診治提供理論依據(jù)。

lncRNA具有重要的生物學(xué)功能，它們?cè)诎℉CC在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。例如，癌相關(guān)成纖維細(xì)胞分泌的CXCL11被發(fā)現(xiàn)通過介導(dǎo)LINC00152/miR-205-5p信號(hào)軸能夠促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖和遷移^[13]。有研究結(jié)果顯示，lncRNA EWSAT1通過促進(jìn)肉瘤基因（Src）誘導(dǎo)的Yes相關(guān)蛋白（YAP）的磷酸化，進(jìn)而激活參與癌癥進(jìn)化的Hippo-YAP信號(hào)靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)HCC轉(zhuǎn)移^[14]。本文研究結(jié)果顯示，lncRNA DLEU2作為致癌基因與HCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而下調(diào)lncRNA DLEU2能夠有效降低細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞遷移和侵襲。這提示lncRNA DLEU2作為促癌基因參與了HCC的發(fā)生發(fā)展，可以作為HCC的分子標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。HCC是一種典型的高血管性實(shí)體瘤，這將有助于其生長、進(jìn)展、侵襲和轉(zhuǎn)移。在HCC中，抑制血管生成有利于減少腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移^[15]。HCC中的血管生成受到低氧的強(qiáng)烈刺激，由于組織結(jié)構(gòu)致密和腫瘤生長迅速，腫瘤內(nèi)部經(jīng)常發(fā)生低氧^[16]。低氧誘導(dǎo)因子-1α是低氧誘導(dǎo)的主要轉(zhuǎn)錄因子，能夠激活一系列以VEGFA為代表的靶基因，它們?cè)诘脱鯒l件下參與細(xì)胞存活和血管生成^[17]。本研究結(jié)果顯示，干擾lncRNA DLEU2的表達(dá)后，細(xì)胞中形成的分支點(diǎn)數(shù)目明顯降低，并且VEGFA的蛋白表達(dá)水平明顯降低，提示HCC組織的血管生成能力減弱。PI3K/Akt信號(hào)通路在HCC血管生成中發(fā)揮重要作用，靶向PI3K/Akt信號(hào)通路能夠顯著抑制血管生成和HCC進(jìn)展^[18]。因此，PI3K/AKT信號(hào)通路與HCC細(xì)胞的血管新生密切相關(guān)。另外，本研究結(jié)果也顯示，干擾lncRNA DLEU2的表達(dá)后，Huh7細(xì)胞中PI3K/p-PI3K和AKT/p-AKT的比值均顯著降低。這些研究結(jié)果提示，lncRNA DLEU2表達(dá)失調(diào)可能通過抑制PIKT/AKT信號(hào)通路活性，抑制HCC進(jìn)展和血管生成能力。

綜上所述，lncRNA DLEU2在HCC中為癌基因，下調(diào)其表達(dá)可以抑制HCC細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和血管生成，作用機(jī)制可能與抑制PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)。由此可見，lncRNA DLEU2可能為HCC的診斷和治療提供一些有前景的策略。然而，lncRNA DLEU2在HCC中作用的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

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（本文編輯 牛兆山）