反復(fù)禁錮應(yīng)激對(duì)小鼠情緒及記憶連接的影響

［摘要］ 目的 探討反復(fù)禁錮應(yīng)激（RRS）對(duì)小鼠情緒以及記憶連接時(shí)間窗的影響。

方法 8周齡雄性C57BL/6小鼠20只，隨機(jī)分為對(duì)照組和RRS組，每組10只。對(duì)照組不做任何處理；RRS組將小鼠輕微麻醉后放入禁錮器，連續(xù)禁錮4 d，每天禁錮1 h，盡量保持在每天同一時(shí)間段進(jìn)行禁錮。1周后對(duì)兩組小鼠進(jìn)行高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)及記憶連接行為學(xué)測(cè)試。

結(jié)果 與對(duì)照組相比，RRS組小鼠停留在開放臂的時(shí)間明顯減少（t=5.01 Plt;0.05），但是其記憶連接的時(shí)間窗并沒有明顯變化（Pgt;0.05）。

結(jié)論 RRS能夠提高小鼠的焦慮水平，但是在短時(shí)間內(nèi)不會(huì)影響小鼠的記憶連接時(shí)程。

［關(guān)鍵詞］ 應(yīng)激障礙，創(chuàng)傷性；情緒；焦慮；記憶；小鼠

［中圖分類號(hào)］ R338.2

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

［文章編號(hào)］ 2096-5532（2024）06-0815-03

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.144

［開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）］

［網(wǎng)絡(luò)出版］ https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.r.20241028.0848.001;2024-10-28 18：31：53

Effect of repeated restraint stress on emotion and memory connection in mice

CUI Yansong， ZHANG Jingsai， ZHOU Yu

（Department of Physiology and Pathophysiology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 26607 "China）

［Abstract］ Objective To explore the effect of repeated restraint stress （RRS） on emotion and memory connection time window in mice.

Methods "Twenty 8-week-old male C57BL/6 mice were randomly divided into control group and RRS group， with 10 mice in each group. The control group did not receive any treatment. Mice in the RRS group were anesthetized slightly， and then treated with daily 1 h restraint at the same time period （as far as possible） on each of four consecutive days. After one week， mice in the two groups were subjected to an elevated plus maze test and a behavioral memory connection test.

Results "Compared with the control group， the RRS group showed significantly reduced open arm time （t=5.01 Plt;0.05）， but no significant difference in the time window of memory connection （Pgt;0.05）.

Conclusion RRS can increase the anxiety level of mice， but it will not affect the memory connection duration of mice in a short time.

［Key words］ stress disorders， traumatic; emotions; anxiety; memory; mice

反復(fù)禁錮應(yīng)激（RRS）能夠引起小鼠的焦慮障礙，從而對(duì)記憶的儲(chǔ)存與提取產(chǎn)生一定的影響^[1]。記憶連接是指對(duì)于多段不相關(guān)的記憶，當(dāng)某一段記憶被提取的時(shí)候，其他記憶也會(huì)相關(guān)地被提取，從而使兩段或多段記憶連接起來，但是每一段記憶又會(huì)保留其自身的特異性^[2]。記憶連接的特點(diǎn)是會(huì)有一個(gè)明確的時(shí)間窗，一旦過了時(shí)間窗，記憶將不再連接^[3-4]。而一些異常的記憶連接可能會(huì)干擾正常的記憶連接從而產(chǎn)生記憶連接障礙，如創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（PTSD）相關(guān)的源記憶和關(guān)系記憶缺陷^[5]。有研究顯示，反復(fù)應(yīng)激對(duì)PTSD也會(huì)存在一定的影響，反復(fù)應(yīng)激造成的創(chuàng)傷暴露與PTSD之間存在線性關(guān)系^[6-7]。記憶連接的發(fā)生及其調(diào)控機(jī)制目前仍不十分清楚。大量的研究結(jié)果表明，PTSD伴發(fā)多方面認(rèn)知和記憶的異常，例如恐懼記憶過度泛化、恐懼記憶消退障礙等。RRS可能導(dǎo)致基礎(chǔ)焦慮異常，而基礎(chǔ)焦慮異常又會(huì)加重PTSD的記憶障礙。本研究旨在探討RRS對(duì)于正常小鼠基礎(chǔ)焦慮水平和記憶連接時(shí)間窗的影響，以便為PTSD認(rèn)知及情感異常的治療或干預(yù)提供新的思路和作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6J小鼠（8周齡，體質(zhì)量25～30 g），購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。小鼠均在約4周齡時(shí)進(jìn)行分籠飼養(yǎng)，每籠4～5只，避免出現(xiàn)雌雄混籠的情況。飼養(yǎng)條件：（21±2）℃恒溫，（50±10）%恒濕，12 h/12 h晝夜循環(huán)光照，可以自由進(jìn)食和飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理 取8周齡雄性C57BL/6小鼠20只，隨機(jī)分為對(duì)照組和RRS組，每組10只。對(duì)照組小鼠不做任何處理；RRS組將小鼠輕微麻醉后放入禁錮器，連續(xù)禁錮4 d，每天禁錮1 h，盡量保持在每天同一時(shí)間段進(jìn)行禁錮。在RRS 1周后對(duì)兩組小鼠進(jìn)行高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)及記憶連接行為學(xué)測(cè)試。

1.2.2 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn) 高架十字迷宮是由兩個(gè)相對(duì)開放臂（35 cm×5 cm）和兩個(gè)相對(duì)閉合臂（35 cm×5 cm）組成的。實(shí)驗(yàn)開始，將小鼠放在迷宮的中央?yún)^(qū)域，頭朝開放臂，記錄5 min內(nèi)小鼠停留在開放臂的時(shí)間。

1.2.3 記憶連接行為學(xué)測(cè)試 記憶連接行為學(xué)測(cè)試設(shè)置4個(gè)場(chǎng)景。每天撫摸小鼠1 min，之后讓小鼠去適應(yīng)箱適應(yīng)1 min，連續(xù)3 d，實(shí)驗(yàn)第7天開始進(jìn)行場(chǎng)景暴露。每只實(shí)驗(yàn)小鼠分別探索不同的場(chǎng)景（電擊場(chǎng)景、5 h連接場(chǎng)景、24 h連接場(chǎng)景），在每個(gè)場(chǎng)景進(jìn)行10 min的場(chǎng)景探索。為了消除小鼠可能存在的環(huán)境偏好，要讓不同連接場(chǎng)景暴露的先后順序保持均衡。將實(shí)驗(yàn)小鼠放于電擊場(chǎng)景中，第11秒給予1次0.65 mA（2 s）的足底電擊，第18秒給予第2次0.65 mA（2 s）的足底電擊，在電擊結(jié)束后58 s，將小鼠放回生活籠。在進(jìn)行場(chǎng)景測(cè)試時(shí)，將小鼠放入5 h連接場(chǎng)景、24 h連接場(chǎng)景、電擊場(chǎng)景以及新場(chǎng)景中，每個(gè)場(chǎng)景進(jìn)行5 min的測(cè)試，每個(gè)場(chǎng)景測(cè)試的間隔時(shí)間為1 d。使用自動(dòng)評(píng)分系統(tǒng)（Med Asso-

ciates公司）對(duì)小鼠5 min內(nèi)的僵立行為（即小鼠除呼吸外所有的運(yùn)動(dòng)都停止且至少持續(xù)1 s時(shí)間的狀態(tài)）進(jìn)行評(píng)估。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并作圖。所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較采用t檢驗(yàn)，記憶連接行為學(xué)測(cè)試結(jié)果比較采用雙因素方差分析。Plt;0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)" 果

2.1 RRS對(duì)小鼠焦慮水平的影響

高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組和RRS組小鼠停留在開放臂的時(shí)間分別為（80±40）、（45±20）s，與對(duì)照組相比，RRS組小鼠停留在開放臂的時(shí)間明顯減少（t=5.01 Plt;0.05），說明RRS能明顯提高小鼠的焦慮水平。

2.2 RRS對(duì)小鼠場(chǎng)景恐懼記憶連接的影響

兩組小鼠在不同場(chǎng)景中的僵立行為時(shí)間百分比比較，組別效應(yīng)差異無顯著性（F 組別=0.78，Pgt;0.05），場(chǎng)景效應(yīng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F 場(chǎng)景=55.98，Plt;0.001），二者不存在交互效應(yīng)（F 交互=0.5 Pgt;0.05）。當(dāng)連接場(chǎng)景與電擊場(chǎng)景暴露間隔時(shí)間為5 h和24 h時(shí)，兩組小鼠在連接場(chǎng)景中的僵立行為時(shí)間百分比均明顯高于在新場(chǎng)景中的僵立行為時(shí)間百分比（F=19.84、17.65，Plt;0.001），說明5 h連接場(chǎng)景、24 h連接場(chǎng)景和電擊場(chǎng)景的場(chǎng)景記憶可以連接。但是兩組小鼠在同一場(chǎng)景中的僵立行為時(shí)間百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.56～0.78，Pgt;0.05），說明RRS不影響小鼠場(chǎng)景記憶連接時(shí)間。見圖1。

3 討" 論

焦慮是對(duì)厭惡事件預(yù)期的心理、生理以及行為反應(yīng)，同時(shí)還會(huì)放大對(duì)厭惡事件的心理和生理反應(yīng)^[8-9]。除了主觀上令人不快之外，焦慮也會(huì)引起情感障礙性疾病等^[10]。焦慮的功能是可以在避免預(yù)期的厭惡事件中發(fā)揮一定的作用^[11]。RRS模型是一種經(jīng)典的單一性應(yīng)激源焦慮模型，可明顯誘發(fā)小鼠的焦慮表型，并且對(duì)小鼠的傷害小，操作簡(jiǎn)單方便^[12-13]。本文結(jié)果顯示，與對(duì)照組小鼠相比，經(jīng)歷了RRS的小鼠焦慮樣行為明顯增加。而焦慮也會(huì)影響記憶的儲(chǔ)存與提取，記憶是對(duì)獲取信息進(jìn)行編碼、鞏固、儲(chǔ)存和提取的過程^[14-15]。目前，大多數(shù)的學(xué)習(xí)和記憶研究都集中在對(duì)單一記憶的編碼、鞏固和提取機(jī)制上，現(xiàn)階段對(duì)多段記憶的連接情況研究頗少。研究記憶連接有助于我們理解相似或時(shí)間臨近的記憶信息是如何連接的，從而在正常情況下能夠正確而高效地存儲(chǔ)和提取記憶^[16-18]。前期的研究發(fā)現(xiàn)，RRS可以暫時(shí)增加神經(jīng)元的興奮性，使后續(xù)記憶的編碼更傾向于利用編碼初始記憶的神經(jīng)元集群，因

此，一個(gè)記憶的提取增加了另一個(gè)記憶被提取的可能性，從而使兩個(gè)記憶聯(lián)系在一起^[4]。本研究記憶連接行為學(xué)測(cè)試結(jié)果顯示，雖然禁錮應(yīng)激小鼠和對(duì)照組小鼠在5 h和24 h都出現(xiàn)了記憶連接的現(xiàn)象，但是兩組小鼠的記憶連接情況差異并無顯著性，說明RRS并沒有影響單一記憶的編碼、鞏固和提取，單純的反復(fù)禁錮，可能不能影響小鼠的記憶提取和短期的記憶連接。因此反復(fù)的創(chuàng)傷暴露對(duì)PTSD可能具有更為復(fù)雜的影響。下一步我們打算將連接場(chǎng)景的時(shí)間間隔增加為3 d和7 d，來研究RRS是否對(duì)長(zhǎng)期的記憶連接有影響。

綜上所述，本研究通過記憶連接行為學(xué)測(cè)試，初步了解了RRS對(duì)焦慮以及短期記憶連接的作用，這為今后進(jìn)一步研究RRS對(duì)長(zhǎng)期記憶連接的影響提供了基礎(chǔ)。

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（本文編輯 馬偉平）