藁本內(nèi)酯對慢性神經(jīng)病理性疼痛模型小鼠的鎮(zhèn)痛作用研究

[摘" "要]" "目的：觀察藁本內(nèi)酯（ligustilide， LIG）對神經(jīng)病理性疼痛（neuropathic pain， NP）模型小鼠疼痛的干預(yù)作用以及初步機(jī)制探索。方法：建立經(jīng)典的坐骨神經(jīng)保留性神經(jīng)損傷（spared nerve injury， SNI）和慢性壓迫性損傷（chronic constriction injury， CCI）誘導(dǎo)的小鼠NP模型，觀察LIG單次給藥（20、40、80 mg/kg，腹腔注射）以及反復(fù)多次給藥（40、80 mg/kg，腹腔注射，1次/d，連續(xù)7 d）對SNI以及CCI誘導(dǎo)的機(jī)械性觸誘發(fā)痛的影響；在LIG反復(fù)多次給藥處理（40、80 mg/kg，腹腔注射，1次/d，連續(xù)7 d）末次給藥的當(dāng)天行SNI和CCI手術(shù)，觀察LIG處理對NP的預(yù)防作用；在LIG 80 mg/kg反復(fù)給藥條件下，于SNI術(shù)后第5天，ELISA法測定脊髓L4～5節(jié)段中促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量；免疫熒光觀察小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物離子鈣結(jié)合銜接分子1（ionized calcium binding adaptor molecule 1， IBA-1）的陽性細(xì)胞數(shù)以分析小膠質(zhì)細(xì)胞激活的情況。結(jié)果：成功建立SNI和CCI誘導(dǎo)的小鼠NP模型，LIG單次給藥與重復(fù)多次給藥均能顯著緩解SNI和CCI誘導(dǎo)的NP癥狀，作用至少能維持7 d，無耐受性產(chǎn)生傾向。在有效劑量下，LIG并不干擾動物的運(yùn)動功能，說明其鎮(zhèn)痛作用具有特異性。術(shù)前LIG反復(fù)多次給藥，能預(yù)防SNI與CCI誘導(dǎo)的早期機(jī)械性觸誘發(fā)痛，但維持時(shí)間有限（1～2 d）。LIG反復(fù)給藥處理能降低SNI模型中促炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，抑制SNI誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活。結(jié)論：LIG對NP癥狀具有改善作用，不產(chǎn)生耐受性，術(shù)前反復(fù)給藥對NP有一定的預(yù)防作用。LIG抗NP機(jī)制可能與其抑制神經(jīng)炎癥及膠質(zhì)細(xì)胞的激活有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]" "神經(jīng)病理性疼痛；藁本內(nèi)酯；神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活；保留性神經(jīng)損傷；慢性壓迫性損傷；小鼠

[中圖分類號]" "R741" " " " " " " "[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]" "A" " " " " " " "[文章編號]" "1674-7887（2024）05-0403-08

Analgesic effect of ligustilide on chronic neuropathic pain mouse model*

LI Jiejia1**， WANG Liyun2， ZHANG Hao2， YOU Wenhui2， ZHU Qing2***" " " " （1Center for Translational Research in Neuroscience， the Second Affiliated Hospital of Nantong University， Jiangsu 226014; 2School of Pharmacy， Nantong University）

[Abstract]" "Objective： To investigate the analgesic effect of ligustilide（LIG） on neuropathic pain（NP） mouse model and its possible mechanism. Methods： The mouse models of NP induced by classic spared nerve injury（SNI） and chronic constriction injury（CCI） of the sciatic nerve were established. The effects of a single administration of LIG（20， 40， 80 mg/kg， intraperitoneal injection） and repeated administration of LIG（40， 80 mg/kg， intraperitoneal injection， once per day， for 7 consecutive days） on mechanical allodynia induced by SNI and CCI were investigated. SNI and CCI were performed on the day of the last administration of LIG（40， 80 mg/kg， intraperitoneal injection， once a day for 7 consecutive days）， and the preventive effect of LIG treatment on NP was observed. Under the condition of repeated administration of LIG 80 mg/kg， the contents of pro-inflammatory factors such as TNF-α， IL-1β， and IL-6 in the L4-5 spinal cord segment were detected by ELISA on the 5th day after SNI surgery. Immunofluorescence assay was used to observe the number of positive cells for the microglia marker ionized calcium binding adapter molecule 1（IBA-1） to analyze the activation status of microglia. Results： SNI- and CCI-induced NP mouse models were successfully established. Both single administration of LIG and repeated administration of LIG could significantly alleviate SNI- and CCI-induced NP symptoms， and this effect could be maintained for at least 7 days， with no tendency to develop drug tolerance. With an effective dose， LIG did not interfere with the motor function of animals， indicating that its analgesic effect was specific. Repeated administration of LIG before surgery could prevent early mechanical allodynia induced by SNI and CCI， but its maintenance time was limited to 1-2 days. Repeated administration of LIG can decrease the contents of TNF-α， IL-1β and IL-6 in SNI models， and inhibit the SNI-induced activation of microglia. Conclusion： LIG can exert a ameliorative effect on NP symptoms and does not develop tolerance， and repeated administration of LIG before surgery can exert a certain preventive effect on NP. The anti-NP mechanism of LIG may be related to its inhibition of neuroinflammation and activation of glial cells.

[Key words]" "neuropathic pain; ligustilide; glial cell activation; spared nerve injury; chronic constriction injury; mouse

神經(jīng)病理性疼痛（neuropathic pain， NP）是由軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或疾病引起的疼痛，臨床表現(xiàn)為持續(xù)或間歇性的自發(fā)性痛、誘發(fā)痛、痛覺過敏或感覺異常等[1]。NP按損傷或疾病的解剖位置分為周圍NP和中樞NP[2]。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查[3]，美國大約有1/3人口，歐洲有25%～30%人口患有慢性疼痛，其中約有1/5患者經(jīng)受NP的折磨。NP的人口總體患病率為6.9%～10%[4]，據(jù)此估計(jì)，我國將有數(shù)千萬甚至上億人口遭受NP的困擾。NP給患者帶來持久的難以忍受的痛苦，并常伴隨著焦慮、抑郁及睡眠障礙的發(fā)生，給家庭和社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。

NP因病程長、病因復(fù)雜、病理機(jī)制不明確和對治療藥物產(chǎn)生耐受性，被認(rèn)為是最難治的疼痛綜合征之一，給臨床治療帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。目前，臨床上廣泛使用的鎮(zhèn)痛藥物常因療效欠佳及不良反應(yīng)嚴(yán)重而受限。如傳統(tǒng)的非甾體類抗炎藥，療效有限且有胃腸道損傷、肝腎功能損害等不良反應(yīng)；阿片類鎮(zhèn)痛藥如嗎啡等，長期使用會有呼吸抑制、成癮、耐受等不良反應(yīng)；其他藥物如抗抑郁藥、抗癲癇藥等為治療NP的一線用藥，但對中、重度疼痛患者效果不佳[5]。因此，尋找有效、不良反應(yīng)小、無耐受性及成癮性的新型治療靶點(diǎn)的鎮(zhèn)痛藥物，具有重要的社會和經(jīng)濟(jì)學(xué)意義。從中草藥中尋找抗NP的活性成分并進(jìn)行相關(guān)機(jī)制探索是研發(fā)新型抗NP藥物的重要途徑。

藁本內(nèi)酯（ligustilide， LIG）是傳統(tǒng)中藥傘形科植物當(dāng)歸揮發(fā)油的主要活性成分，也是具有止痛作用的傳統(tǒng)中藥川芎的主要有效成分之一，分子式為C12H14O2，相對分子質(zhì)量為190.238。LIG可透過血腦屏障，改善腦微循環(huán)和能量代謝，抑制神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡，對急慢性腦缺血有明顯的治療作用，可用于防治微循環(huán)障礙相關(guān)疾病[6-9]。同時(shí)，LIG能緩解脂多糖、醋酸或甲醛及完全弗氏佐劑誘導(dǎo)的炎癥性疼痛[10-13]。但LIG能否緩解NP，目前尚無報(bào)道。由于脊髓神經(jīng)炎癥和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活可能是NP啟動和維持所必須經(jīng)歷的一個(gè)病理過程[14-15]，而LIG被證實(shí)具有抑制神經(jīng)炎癥的作用，因此推測LIG對NP也有良好的防治作用。本研究利用經(jīng)典的保留性神經(jīng)損傷（spared nerve injury， SNI）和慢性壓迫性損傷（chronic constric-tion injury， CCI）動物模型觀察LIG對NP的改善作用，并探討其作用機(jī)制是否與神經(jīng)炎癥有關(guān)。

1" "材料與方法

1.1 " 實(shí)驗(yàn)動物" "雄性ICR小鼠，體質(zhì)量20～22 g，購于南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。實(shí)驗(yàn)室保持恒溫恒濕：溫度（23±1） ℃，濕度（55±10）%，12 h光照（6：00—18：00）。實(shí)驗(yàn)之前小鼠適應(yīng)環(huán)境5 d，實(shí)驗(yàn)期間小鼠飲食飲水自由。

1.2 " 藥品與試劑" "LIG購于南通啟翔生物科技有限公司；BCA法蛋白定量試劑盒、NP-40組織蛋白裂解液、PMSF、SDS-PAGE試劑盒、一抗稀釋液、二抗稀釋液、無RNA酶水、TEMED購于碧云天生物科技有限公司；Tris、甘氨酸、SDS、5×上樣緩沖液、蛋白Marker、密理博PVDF膜購于上海優(yōu)寧維生物科技有限公司。

1.3 " 儀器與設(shè)備" "Von-Frey纖維絲：美國Stoelting有限責(zé)任公司；YLS-1A多功能小鼠自主活動儀：山東省濟(jì)南益延儀器科技有限公司；小動物氣體麻醉機(jī)：上海玉研科學(xué)儀器有限公司；多功能酶標(biāo)儀：美國Bio-Tek公司；BIO-RAD電泳及轉(zhuǎn)印儀、實(shí)時(shí)熒光PCR儀：美國Bio-Rad公司；化學(xué)發(fā)光顯影儀以及凝膠成像分析系統(tǒng)：美國Thermo Fisher公司；手持式高速勻漿機(jī)：上海凈信實(shí)業(yè)公司。

1.4 " SNI模型制備" "SNI手術(shù)如文獻(xiàn)[16]所述，模型組（Model）小鼠用異氟烷（2%異氟烷混合100%氧氣，流速為3 L/min）麻醉，皮膚消毒后，以股骨為標(biāo)記，在大腿中部做1個(gè)1 cm的皮膚切口，鈍性分離其肌肉層，暴露其左側(cè)坐骨神經(jīng)及其3個(gè)分支（即腓總神經(jīng)、脛神經(jīng)和腓腸神經(jīng)），在坐骨神經(jīng)分叉遠(yuǎn)端，用8-0尼龍縫合結(jié)扎腓總神經(jīng)和脛神經(jīng)，然后用眼科剪刀剪除這2個(gè)分支，每個(gè)遠(yuǎn)端神經(jīng)殘端切除2～4 mm，同時(shí)保持腓腸神經(jīng)完整，避免任何牽拉或接觸保留的腓腸神經(jīng)。同時(shí)設(shè)立假手術(shù)組（Sham），即完成切開皮膚工作，暴露出坐骨神經(jīng)及其分支，但并不進(jìn)行對坐骨神經(jīng)及其分支的手術(shù)。然后將肌肉和皮膚縫合。術(shù)后置于飼養(yǎng)籠中，正常飲食飲水，第2天測量機(jī)械痛縮爪閾值（paw withdrawal threshold， PWT）。

1.5" "CCI模型制備" "如前所述[16]，先用2%～3%的異氟烷誘導(dǎo)麻醉，然后1.5%的異氟烷維持麻醉。手術(shù)暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)，用6.0號鉻制羊腸線將坐骨神經(jīng)主干松結(jié)扎3道，每根結(jié)扎線間隔1～2 mm，逐層縫合肌肉和皮膚。術(shù)后置于飼養(yǎng)籠中恢復(fù)，正常飲食飲水，第2天測量PWT。

1.6" "機(jī)械性痛覺閾值測定" "使用Von-Frey纖維絲測定小鼠的PWT。將小鼠置于底部為金屬網(wǎng)格的有機(jī)分隔玻璃箱中，適應(yīng)10 min。使用纖維絲對小鼠手術(shù)側(cè)后爪的足底邊緣腳掌面施加壓力（纖維絲稍微彎曲即可）。Von-Frey纖維絲強(qiáng)度按照對數(shù)型增加刺激力度（纖維絲彎曲張力等效于0.07、0.16、0.4、0.6、1.0、1.6、2.0 g），每個(gè)強(qiáng)度纖維絲在足底測定3次，疼痛閾值記為3次連續(xù)測定中至少2次抬足的最小強(qiáng)度。以2.0 g為測量的截?cái)嘀担╟ut-off）。

1.7" "小鼠自主活動測定" "使用YLS-1A多功能小鼠自主活動記錄儀進(jìn)行，該設(shè)備由1個(gè)控制器單元和5個(gè)獨(dú)立的黑色亞克力材質(zhì)運(yùn)動腔室組成。每個(gè)腔室（12 cm ×15 cm×15 cm）內(nèi)由四周具有發(fā)光束的單元所環(huán)繞，并連接到主控制器單元。小鼠在黑暗中被單獨(dú)放入這些腔室中，在60 min的測試期間記錄小鼠自發(fā)的運(yùn)動，當(dāng)動物穿過1根光束使其被打斷時(shí)，計(jì)為1次。

1.8" "ELISA檢測TNF-α、IL-6和IL-1β的含量" "按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測各組小鼠L4～5節(jié)段脊髓組織中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量。使用全自動酶標(biāo)儀檢測各組樣本的光密度值，計(jì)算TNF-α、IL-6和IL-1β的相對含量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.9" "免疫熒光檢測神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活" "小鼠麻醉后，用預(yù)冷至4 ℃的生理鹽水行快速透心灌注，接著灌注4%多聚甲醛溶液約50 mL/只，先快后慢，待小鼠出現(xiàn)全身抽搐的癥狀時(shí)，將滴速調(diào)慢約1 滴/min，整個(gè)灌注過程約30 min。灌注結(jié)束后將脊髓L4～5段小心取出，在4%多聚甲醛溶液中浸泡2 h后固定，隨后用20%、30%蔗糖的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer， PB）進(jìn)行梯度脫水。然后進(jìn)行冰凍切片，切片厚25 μm，存放于切片保護(hù)液中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

每張切片加入含10%山羊血清的工作液（0.5% Triton X-100），在室溫下封閉1 h，加入一抗離子鈣結(jié)合銜接分子1（ionized calcium binding adaptor molecule 1， IBA-1）（1∶500稀釋），4 ℃下孵育過夜，第2天加入帶熒光標(biāo)記的二抗（IgG）室溫條件下孵育2 h，貼片，用90%甘油防熒光淬滅封片液封片，拍照。在加入各個(gè)試劑之前，切片均用0.01 mol/L PB漂洗5 min×3次；在孵育二抗時(shí)避光。運(yùn)用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.10" "實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.10.1" "LIG單次給藥對SNI和CCI誘導(dǎo)NP的急性鎮(zhèn)痛作用nbsp; "所有小鼠分別于術(shù)前測定其PWT基礎(chǔ)值（baseline， BL），然后行SNI或CCI手術(shù)造模。同時(shí)設(shè)立假手術(shù)組作為空白對照（Sham）。將SNI與CCI模型組各自分成4個(gè)組：模型對照組（Vehicle）、LIG 20、40、80 mg/kg 3個(gè)劑量組，各組小鼠8只。SNI或CCI術(shù)后1 d，即出現(xiàn)明顯機(jī)械痛閾值降低，給藥前測定1次PWT值，然后LIG各劑量組給予各自質(zhì)量濃度的LIG腹腔注射（10 mL/kg體質(zhì)量），而Vehicle組給予同等體積的溶劑即0.5%羧甲基纖維素鈉（sodium carboxymethyl cellulose， CMC-Na）。給藥后30 min開始測定每組PWT值，30 min/次，測定截止時(shí)間為4 h。

1.10.2" "LIG反復(fù)給藥對SNI和CCI誘導(dǎo)的NP的慢性鎮(zhèn)痛作用" "上述實(shí)驗(yàn)中，LIG 20 mg/kg因?yàn)樽饔貌幻黠@，所以只做了LIG 40、80 mg/kg兩個(gè)質(zhì)量濃度的慢性給藥實(shí)驗(yàn)。SNI術(shù)后1 d，LIG腹腔注射給藥連續(xù)7 d，1次/d，并于給藥后2 h測定其PWT值（根據(jù)急性實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知其最大效應(yīng)時(shí)間為2 h），第8天時(shí)不給藥，測定其停藥后機(jī)械痛閾值。

1.10.3" "LIG單次給藥對小鼠自主活動的影響" "正常雄性ICR小鼠32只，分成4組，每組8只，即模型對照組（Vehicle）、LIG 20、40、80 mg/kg 3個(gè)劑量組。模型對照組給予0.5% CMC-Na。給藥后1 h（此時(shí)LIG鎮(zhèn)痛已經(jīng)開始起效）在自主活動儀中測定其60 min內(nèi)自主活動情況。

1.10.4" "術(shù)前LIG反復(fù)給藥對SNI和CCI誘導(dǎo)的NP的預(yù)防作用" "正常雄性ICR小鼠24只，分成4組，每組8只，即模型對照組（Vehicle），LIG 40、80 mg/kg 兩個(gè)劑量組。模型對照組（Vehicle）給予0.5% CMC-Na。LIG 40、80 mg/kg組，給藥1 次/d，連續(xù)7 d，每隔1 d測定PWT值。于第7天末次給藥0.5 h則行SNI術(shù)及CCI術(shù)，術(shù)后24 h測定PWT值，但不予LIG處理，觀察其預(yù)防作用。

1.10.5" "LIG反復(fù)給藥對SNI模型誘導(dǎo)的脊髓促炎癥因子、膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響" "SNI術(shù)后1 d給予腹腔注射LIG（40、80 mg/kg）兩個(gè)劑量，1 次/d。于第5天時(shí)，在異氟烷麻醉后，處死小鼠，取材（脊髓L4～5段），分別用于ELISA和免疫熒光實(shí)驗(yàn)。研究方案通過南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心動物實(shí)驗(yàn)倫理審查（編號：P20230218-022）。

1.11" "統(tǒng)計(jì)學(xué)方法" "所有數(shù)據(jù)均以ｘ±s表示，用Graph Pad Prism 9.0（San Diego， CA， USA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。Von Frey檢驗(yàn)中組間差異采用雙因素方差分析（Two-way ANOVA），重復(fù)測量以時(shí)間為組內(nèi)因素，劑量為組間因素，采用Bonferroni post hoc分析；其他數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（One-way ANOVA），采用Tukey＇s HSD post-hoc分析。Plt;0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2" "結(jié)" " " 果

2.1" "SNI和CCI誘導(dǎo)的NP模型的建立" "SNI和CCI誘導(dǎo)的機(jī)械性觸誘發(fā)痛如圖1所示，術(shù)前各組小鼠機(jī)械痛閾BL均相同，而在SNI或CCI術(shù)后1 d，模型組（Model）小鼠即出現(xiàn)顯著的機(jī)械痛覺過敏，而且維持至少7 d，而假手術(shù)組（Sham）則在整個(gè)測定過程（術(shù)后1～7 d）中，均保持在術(shù)前的基線值。與假手術(shù)組（Sham）相比，在術(shù)后1～7 d，模型組（Model）PWT均顯著下降（Plt;0.001）。說明SNI和CCI誘導(dǎo)的NP模型建立成功。

2.2" "LIG單次給藥對SNI和CCI誘導(dǎo)的NP的急性鎮(zhèn)痛作用" "不同劑量LIG單次腹腔注射給藥對SNI和CCI誘導(dǎo)的NP的急性作用如圖2所示，LIG呈劑量依賴性緩解SNI和CCI誘導(dǎo)的NP。在SNI模型中，LIG 20 mg/kg組的PWT與Vehicle組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；LIG 40 mg/kg給藥后顯著提高1.5～3 h的小鼠PWT值（Plt;0.05或Plt;0.001），2 h達(dá)最大效應(yīng)；LIG 80 mg/kg給藥后顯著提高1.0～3 h的小鼠PWT值（Plt;0.05或Plt;0.001），2 h達(dá)最大效應(yīng)；LIG 80 mg/kg在1.5～2.5 h PWT值顯著高于LIG 20 mg/kg組（Plt;0.05）。在CCI模型中，LIG 20 mg/kg組顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；LIG 40 mg/kg給藥后顯著提高2～2.5 h的小鼠PWT值（Plt;0.05或Plt;0.001）；LIG 80 mg/kg給藥后顯著提高1.5～3 h的小鼠PWT值（Plt;0.05或Plt;0.001）。LIG 80 mg/kg在2～2.5 h PWT值顯著高于LIG 20 mg/kg組（Plt;0.01）。以上結(jié)果說明，LIG單次給藥（腹腔注射）對SNI和CCI誘導(dǎo)的NP模型均呈劑量依賴性緩解疼痛過敏的作用，其最大效應(yīng)時(shí)間為2 h，基本在3.5 h時(shí)完全消失。

2.3" "LIG反復(fù)給藥對SNI和CCI誘導(dǎo)的NP的慢性鎮(zhèn)痛作用" "進(jìn)一步觀察了LIG反復(fù)給藥對SNI和CCI模型的鎮(zhèn)痛作用是否有產(chǎn)生耐受性傾向，見圖3。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LIG反復(fù)給藥對SNI和CCI模型的鎮(zhèn)痛作用能至少維持7 d，無明顯耐受性傾向。LIG 40 mg/kg與80 mg/kg在反復(fù)給藥期間（1～7 d）均能顯著提高SNI模型以及CCI模型小鼠的PWT值（Plt;0.05或Plt;0.001）。LIG停藥后第2天，鎮(zhèn)痛效應(yīng)即消失，說明無積累效應(yīng)，對NP無治愈作用。

2.4" "術(shù)前LIG反復(fù)給藥對SNI和CCI誘導(dǎo)的NP的預(yù)防作用" "繼續(xù)觀察在手術(shù)造模前給予LIG反復(fù)給藥處理7 d，對SNI和CCI模型NP的預(yù)防作用，見圖4。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LIG反復(fù)給藥7 d，對SNI和CCI模型NP有一定的預(yù)防作用，但僅維持1～2 d。在SNI模型中，LIG 40 mg/kg術(shù)前反復(fù)給藥能提高術(shù)后第1天的小鼠PWT值，80 mg/kg術(shù)前反復(fù)給藥能顯著提高術(shù)后1～2 d的小鼠PWT值（Plt;0.05或Plt;0.001）；在CCI模型中，僅有LIG 80 mg/kg術(shù)前反復(fù)給藥能顯著提高術(shù)后第1天的小鼠PWT值（Plt;0.001），LIG 40 mg/kg術(shù)前反復(fù)給藥有提高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。說明術(shù)前LIG反復(fù)給藥對SNI和CCI誘導(dǎo)早期NP有一定的改善作用，但作用維持時(shí)間不長。

2.5" "LIG單次給藥對小鼠自主活動的影響" "為排除LIG通過影響小鼠的運(yùn)動功能來提高PWT值的假陽性結(jié)果，測量了LIG 3種劑量下單次給藥對小鼠自主活動的影響，見圖5。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LIG 3個(gè)劑量下對小鼠的自主活動均無影響，組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Pgt;0.05）。說明LIG在鎮(zhèn)痛劑量下無鎮(zhèn)靜效應(yīng)或損害運(yùn)動功能，LIG對疼痛過敏的改善作用具有特異性，并不是由鎮(zhèn)靜或運(yùn)動損傷等非特異性行為抑制所引起。

2.6" "LIG反復(fù)給藥降低SNI誘導(dǎo)的模型脊髓中促炎癥因子的含量增加" "檢測了LIG 80 mg/kg反復(fù)給藥期間，在SNI術(shù)后第5天小鼠脊髓L4～5中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量，見圖6。結(jié)果顯示，與Sham組比較，模型對照組（Vehicle）SNI術(shù)后第5天脊髓L4～5中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平均顯著增加（Plt;0.05或Plt;0.01）；而與模型對照組（Vehicle）比較，LIG 80 mg/kg反復(fù)給藥組3種因子的含量均下降（Plt;0.05或Plt;0.001），與Sham組基本齊平。結(jié)果表明LIG反復(fù)給藥能逆轉(zhuǎn)SNI誘導(dǎo)的脊髓促炎因子的增加，可能是LIG緩解神經(jīng)病理疼痛的作用機(jī)制。

2.7" "LIG反復(fù)給藥減少SNI模型脊髓中小膠質(zhì)細(xì)胞的激活" "檢測了LIG 80 mg/kg反復(fù)給藥期間，在SNI術(shù)后第5天小鼠脊髓L4～5中小膠質(zhì)細(xì)胞激活的情況，見圖7。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LIG 80 mg/kg反復(fù)給藥能抑制SNI誘導(dǎo)脊髓中小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物IBA-1免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)量的增加，說明LIG能抑制SNI誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。與Sham組相比，SNI模型對照組（Vehicle）小鼠IBA-1陽性細(xì)胞數(shù)目顯著增多（Plt;0.001）；而與模型對照組（Vehicle）比較，LIG處理則可明顯減少SNI模型中IBA-1陽性細(xì)胞數(shù)量（Plt;0.05），但并不能逆轉(zhuǎn)至術(shù)前正常水平[與Sham組比較，Plt;0.05）]。結(jié)果提示，SNI術(shù)后第5天時(shí)存在明顯的小膠質(zhì)細(xì)胞激活情況，而LIG反復(fù)給藥處理能抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活。

3" "討" " " 論

本研究發(fā)現(xiàn)LIG單次給藥與反復(fù)多次給藥均能顯著緩解SNI及CCI誘導(dǎo)的NP癥狀，作用至少能維持7 d，無耐受性產(chǎn)生傾向。在有效劑量下LIG并不干擾動物的運(yùn)動功能，說明其鎮(zhèn)痛作用具有特異性。術(shù)前LIG反復(fù)給藥能預(yù)防SNI與CCI誘導(dǎo)的早期機(jī)械痛覺過敏，但維持時(shí)間有限（1～2 d）。LIG反復(fù)給藥處理能降低SNI模型促炎因子TNF-α、IL-1β及IL-6的水平，抑制SNI誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。表明LIG對外周神經(jīng)損傷導(dǎo)致的NP有防治作用，可能與其抑制神經(jīng)炎癥以及小膠質(zhì)細(xì)胞的激活有關(guān)。

NP是源于神經(jīng)系統(tǒng)病理性功能紊亂的疼痛，其主要原因有帶狀皰疹感染后引起的神經(jīng)痛、糖尿病引發(fā)的多發(fā)性神經(jīng)痛、三叉神經(jīng)痛、持續(xù)的術(shù)后或創(chuàng)傷后疼痛、癌癥患者的疼痛和AIDS病毒感染患者的疼痛等[17]。在此基礎(chǔ)上于CCI或SNI術(shù)后24 h進(jìn)行LIG單次給藥檢測其急性治療作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在這兩種慢性NP模型中，LIG治療以劑量和時(shí)間依賴性的方式減輕了機(jī)械性觸誘發(fā)痛，最大效應(yīng)時(shí)間為2 h，于3.5 h效應(yīng)基本消失。由于LIG所使用劑量（20～80 mg/kg）沒有顯著降低小鼠自發(fā)運(yùn)動活動，說明其對小鼠無鎮(zhèn)靜作用。因此認(rèn)為LIG對機(jī)械性觸誘發(fā)痛的改善作用具有特異性，并不是由于鎮(zhèn)靜或運(yùn)動損傷等非特異性行為抑制所引起。

慢性疼痛通常被描述為持續(xù)3個(gè)月以上的持續(xù)疼痛狀態(tài)。慢性疼痛的治療需要進(jìn)行反復(fù)給藥，這可能導(dǎo)致鎮(zhèn)痛耐受性。例如，在有效劑量水平，每日使用嗎啡等類阿片治療4～7 d足以產(chǎn)生顯著的抗傷害耐受性[18]。因此，檢測了LIG反復(fù)多次給藥對慢性NP的抗痛覺異常作用是否會導(dǎo)致耐受性。在SNI和CCI模型中，LIG（40、80 mg/kg）重復(fù)給藥治療呈劑量依賴性地減輕機(jī)械性觸誘發(fā)痛，并且在整個(gè)7 d的日常治療期間沒有顯示出耐受性的趨勢。故推測如果繼續(xù)延長LIG用于治療慢性疼痛，在此期間出現(xiàn)耐受性的可能性也比較低。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，反復(fù)每日用LIG（40、80 mg/kg）治療7 d，而在第8天停止用藥，測定其機(jī)械性觸誘發(fā)痛，發(fā)現(xiàn)作用消失，說明每次治療作用不能持續(xù)到第2天，無蓄積效應(yīng)產(chǎn)生，也說明LIG為期7 d的治療并未產(chǎn)生治愈效應(yīng)，需要長期服用藥物。這與急性LIG治療的效果在給藥3.5 h后幾乎完全消失的結(jié)果一致。結(jié)果表明，重復(fù)LIG治療可能是控制NP的有效策略。此外，在SNI及CCI術(shù)前每日用LIG（40、80 mg/kg）給藥，連續(xù)7 d，以觀察LIG對NP的預(yù)防作用。使用預(yù)防性藥物有利于降低疼痛敏感的程度。LIG術(shù)前反復(fù)處理能稍減輕SNI和CCI手術(shù)后1～2 d的機(jī)械性觸誘發(fā)痛程度，說明LIG對SNI與CCI誘導(dǎo)的早期機(jī)械性觸誘發(fā)痛有預(yù)防作用，但維持時(shí)間有限（1～2 d）。

近年來，神經(jīng)炎癥以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活在神經(jīng)病理疼痛中發(fā)揮的重要作用受到越來越多的學(xué)者關(guān)注[15， 19]。當(dāng)外周神經(jīng)損傷時(shí)，在外周神經(jīng)與中樞神經(jīng)中一些促炎因子包括IL-1β、IL-6和TNF-α生成增加。這些促炎因子在神經(jīng)損傷后的神經(jīng)炎癥反應(yīng)以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的致敏中起著至關(guān)重要的作用，參與了痛覺過敏、機(jī)械性觸誘發(fā)痛以及神經(jīng)瘤的形成。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中膠質(zhì)細(xì)胞（主要是星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞），約占70%，其數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過神經(jīng)元，在維持系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)損傷后表現(xiàn)出動態(tài)可塑性，由靜止或靜止表型轉(zhuǎn)變?yōu)榉磻?yīng)性表型，然后作為免疫應(yīng)答細(xì)胞調(diào)節(jié)神經(jīng)元活動[3]。神經(jīng)損傷后，神經(jīng)元釋放的分子參與了小膠質(zhì)細(xì)胞的活動，導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，并遷移到損傷部位，促進(jìn)其增殖。周圍神經(jīng)損傷后，脊髓內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞被激活并發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)改變，且伴隨小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物如CD11b和IBA-1表達(dá)增加。另外，小膠質(zhì)細(xì)胞被激活后會導(dǎo)致促炎因子的合成和分泌增加，如TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)增加。而目前研究[13， 20]已證實(shí)這些促炎因子能增強(qiáng)與維持慢性疼痛，鞘內(nèi)注射促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6會誘發(fā)機(jī)械性觸摸誘發(fā)痛以及熱痛覺過敏。而給予這些促炎因子的抑制劑則能緩解慢性NP和炎癥痛[21]。小膠質(zhì)細(xì)胞激活不僅參與NP的起始階段，對于NP長期的維持與發(fā)展也是必不可少的[22]。本研究結(jié)果顯示在SNI術(shù)后第5天，即出現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞激活，而且促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)增加，和文獻(xiàn)[23]報(bào)道一致。而LIG反復(fù)給藥能降低脊髓促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)，抑制脊髓IBA-1的表達(dá)上調(diào)，提示可能通過抑制脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞激活，減少促炎因子的釋放，從而達(dá)到緩解NP的作用。而本課題組之前報(bào)道[13]的LIG能抑制完全弗式佐劑誘導(dǎo)的膠質(zhì)細(xì)胞激活，并減少促炎因子產(chǎn)生也有力支撐了本研究結(jié)果。令人奇怪的是，在術(shù)前反復(fù)給予LIG預(yù)防給藥7 d，而即使術(shù)后停藥，也能在一定程度上緩解早期（1～2 d）的NP癥狀，但是在術(shù)后反復(fù)給藥治療7 d時(shí)，需要長期給藥，一旦停藥，則對NP鎮(zhèn)痛作用消失。因此推測在術(shù)前以及圍術(shù)期給藥LIG，對NP的啟動因子可能有一定微弱的抑制作用。但術(shù)后NP的啟動開始后，由于神經(jīng)炎癥的級聯(lián)反應(yīng)作用，LIG處理只在有效濃度范圍內(nèi)能減輕炎癥，一旦濃度下降，則會導(dǎo)致鎮(zhèn)痛作用逐漸消失。

綜上所述，LIG劑量依賴性緩解SNI以及CCI誘導(dǎo)的NP癥狀，其作用能至少維持7 d且不產(chǎn)生耐受性，術(shù)前反復(fù)給藥對NP有一定預(yù)防作用，其治療機(jī)制可能與其抑制神經(jīng)炎癥以及小膠質(zhì)細(xì)胞的激活有關(guān)。這為LIG在臨床上用于NP的防治提供科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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[收稿日期] 2024-08-03