萬壽菊花瓣葉黃素含量與顏色系數(shù)的相關(guān)性分析

摘要 為建立一種快速測(cè)定萬壽菊（Tagetes erecta）花瓣葉黃素含量的方法，利用色差儀測(cè)得萬壽菊花瓣的亮度值L*、紅綠值a*、黃藍(lán)值b*，并計(jì)算a*/b*、（a*/b*）2、色度值、色調(diào)值和色光值等顏色系數(shù)，同時(shí)采用紫外-可見分光光度法結(jié)合HPLC 法測(cè)定花瓣葉黃素含量，分析葉黃素含量與這些顏色系數(shù)的相關(guān)性，建立回歸方程并進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，萬壽菊花瓣葉黃素含量與a*、a*/b*、（a*/b*）2、色調(diào)值和色光值極顯著相關(guān)；用三次函數(shù)模型構(gòu)建的萬壽菊葉黃素含量與a*值之間的回歸方程擬合程度最高，且葉黃素含量的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間差異不顯著。結(jié)果表明，基于a*值構(gòu)建的三次函數(shù)模型可以快速、無損預(yù)測(cè)萬壽菊花瓣葉黃素含量。

關(guān)鍵詞 葉黃素； 萬壽菊； 色差儀； 顏色系數(shù)； 回歸分析

中圖分類號(hào) S682.1+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1000-2421（2024）06-0261-09

葉黃素（lutein）是一種天然色素，屬于類胡蘿卜素，它不僅具有著色作用［1］，還在保護(hù)視覺、預(yù)防白內(nèi)障［2］、治療心血管疾?。?］、抗氧化［4］和抗癌［5］等方面具有重要功效，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品、化妝品、食品和飼料添加劑等領(lǐng)域［6］。萬壽菊（Tageteserecta）是提取葉黃素的重要原料，其花瓣的葉黃素類（xanthophylls）物質(zhì)主要包括葉黃素（又名黃體素）和玉米黃質(zhì)［7-8］，可占總類胡蘿卜素含量的88% 以上［9-10］。雖然我國在萬壽菊種植、加工和銷售等方面取得了快速發(fā)展，但在自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)品種研發(fā)等方面仍比較落后，培育和選育高葉黃素含量的萬壽菊品種是萬壽菊產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。

目前常用的葉黃素檢測(cè)方法有高效液相色譜法（HPLC）和紫外-可見分光光度法［11-12］。HPLC 法穩(wěn)定性強(qiáng)、靈敏性高，能精確檢測(cè)各種成分在樣品中的含量。紫外-可見分光光度法根據(jù)被測(cè)物質(zhì)濃度與吸光度成正比來分析色素含量，是一種較為簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法［13］。但是，HPLC 法和紫外-可見分光光度法均需要進(jìn)行樣本前處理和葉黃素提取步驟，存在試驗(yàn)所需時(shí)間長、測(cè)試費(fèi)用較高、操作不便利等缺點(diǎn)［6］。因此，探索研究更簡(jiǎn)便、快速、無損的萬壽菊葉黃素含量檢測(cè)方法非常重要，而目前關(guān)于這方面的研究較少。

色差儀是一種運(yùn)用國際通用的CIE Lab 顏色空間，通過輸出亮度值L*、紅綠值a*、黃藍(lán)值b*，直接測(cè)量物體表面色度學(xué)指標(biāo)的儀器，具有操作簡(jiǎn)單、測(cè)量速度快、精度較高的優(yōu)點(diǎn)［14-15］。目前，色差儀被廣泛應(yīng)用于花卉［16］、水果［17］、蔬菜［18］及茶葉［19］等產(chǎn)品顏色的測(cè)量。利用色差儀測(cè)得的L*、a*、b*值等顏色系數(shù)評(píng)估色素物質(zhì)含量的研究也有相關(guān)報(bào)道。Ameny等［20］研究了馬鈴薯顏色的L*、a*、b*值與β-胡蘿卜素含量的關(guān)系；Meiendez-Martinez 等［21］利用L*、a*、b*值評(píng)估了不同橙汁顏色和維生素A 活性的相關(guān)性；路緒強(qiáng)等［22］建立了西瓜番茄紅素含量與果實(shí)顏色系數(shù)Chroma（色度值）的回歸方程。但仍未有利用L*、a*、b*值等顏色系數(shù)預(yù)測(cè)萬壽菊花瓣中葉黃素含量的研究報(bào)道。

本研究利用色差儀測(cè)量萬壽菊舌狀花花瓣的顏色，通過L*、a*、b*值計(jì)算相應(yīng)的a*/b*、（a*/b*）2、色度值、色調(diào)值和色光值等顏色系數(shù)，同時(shí)利用紫外-可見分光光度法結(jié)合HPLC 法測(cè)定舌狀花花瓣葉黃素含量，分析顏色系數(shù)與葉黃素含量的相關(guān)性，建立回歸方程并進(jìn)行驗(yàn)證，從而得到一種利用色差儀快速測(cè)定萬壽菊舌狀花花瓣葉黃素含量的方法，為加快萬壽菊高葉黃素種質(zhì)資源檢測(cè)和優(yōu)良品種選育提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料為商業(yè)購買的萬壽菊F1雜交種和培育的自交系共16 個(gè)基因型（表1，圖1）。香草、148、9906、里程碑、6170、6210、豐盛桔色、發(fā)現(xiàn)橙色、金盾桔色、9904、貴夫人色素和菊花萬壽菊12 個(gè)基因型在2022 年7 月中旬播種于72 孔穴盤中，8 月中旬移栽至雙色塑料盆中，于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)花卉基地進(jìn)行露地栽培（30°28′36.5″N，114°21′59.4″E），常規(guī)管理。老印卡、6155、GH、橙玉4 個(gè)基因型于2023 年7 月中旬播種，其他栽培管理措施保持一致。

1.2 萬壽菊舌狀花花瓣葉黃素含量測(cè)定

隨機(jī)摘取盛花期頭狀花序外輪1～2 層舌狀花的花瓣，于?80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。使用GenesisSQ super ES-55 型冷凍干燥機(jī)（SP Scientific，美國）干燥樣品3 d，用SCIENTZ-48 型高通量組織研磨器（寧波新芝生物科技股份有限公司）將干燥后的花瓣樣品研磨至顆粒狀，葉黃素含量的測(cè)定方法參照中國食品添加劑和配料協(xié)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/CFAA 0005—2021并稍作修改。其中，總?cè)~黃素類物質(zhì)含量的測(cè)定采用紫外-可見分光光度法：采用1/10 000 天平稱取0.1～0.2 g 顆粒狀花瓣樣品于100mL 棕色容量瓶（3 次生物學(xué)重復(fù)），加入30 mL 萃取劑（正己烷∶丙酮∶甲苯∶無水乙醇=10∶7∶7∶6）和2 mL 含有40% KOH 的甲醇溶液；將容量瓶放在JP-080S 型超聲波清洗機(jī)（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司）震蕩40 s，然后放入56 ℃水浴鍋中皂化20 min；皂化完成后將樣品冷卻至室溫，加入30 mL 正己烷，用10% 無水硫酸鈉溶液定容后振搖1 min，于暗處靜置1 h 進(jìn)行色層分離；靜置完畢后的上層清液體積即萬壽菊總?cè)~黃素類提取液的體積（50 mL）；準(zhǔn)確吸取上層清液1 mL 移到25 mL 容量瓶中，用總?cè)~黃素類物質(zhì)洗脫液（正己烷）定容后搖勻，得到稀釋后的萬壽菊總?cè)~黃素類物質(zhì)提取液。將樣品溶液置于1 cm比色皿中，用正己烷作空白對(duì)照，采用UV-1800 型紫外‐可見分光光度計(jì)（島津，日本）測(cè)定樣品在474 nm處吸光度值?？?cè)~黃素類物質(zhì)含量計(jì)算公式如式（1）所示：

W0=A×V/（236×m） （1）

式（1）中，W0：總?cè)~黃素類物質(zhì)含量，g/kg；A：474 nm 時(shí)樣品吸光度；V：稀釋倍數(shù)；m：樣品質(zhì)量，g；236：質(zhì)量濃度為1 g/L 的總?cè)~黃素類物質(zhì)樣液在正己烷中波長474 nm 處的吸收系數(shù)。

采用SPD-M20A 型高效液相色譜儀（島津，日本）檢測(cè)葉黃素含量占總?cè)~黃素類物質(zhì)含量的比值。取1 mL上述萬壽菊總?cè)~黃素類物質(zhì)提取液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后上機(jī)檢測(cè)，固定相為4.6×250 mm 色譜柱（安捷倫，美國），流動(dòng)相為正己烷∶乙酸乙酯∶異丙醇=73∶27∶1.5，流速為1.5 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL，柱溫為室溫，檢測(cè)波長為446 nm，檢測(cè)時(shí)間為20 min。葉黃素含量計(jì)算公式如式（2）所示：

W=W0×P （2）

式（2）中，W：葉黃素含量，g/kg；W0：總?cè)~黃素類物質(zhì)含量，g/kg；P：葉黃素峰面積/總?cè)~黃素類物質(zhì)峰面積。

1.3 萬壽菊花瓣L*、a?、b*值測(cè)定

利用SPECTROPHOTOMETER CM-5 型色彩色差儀（KONICA MINOLTA，日本）測(cè)量萬壽菊舌狀花的顏色。待萬壽菊進(jìn)入盛花期（所有小花均盛開），隨機(jī)選擇2 個(gè)頭狀花序，采集外輪1～2 層舌狀花的花瓣4 片，取花瓣正面中心點(diǎn)，測(cè)得L*、a?、b*值后取平均值；利用這些值分別計(jì)算5 個(gè)顏色系數(shù)：a*/b*、（a*/b*）2 、色度值（chroma value，CV）、色調(diào)值（hue value，HV）和色光值（shade value，SV）。色度值代表所測(cè)顏色到亮度軸的垂直距離，色度值越大，彩度越大；色調(diào)值反映的是紅橙綠藍(lán)紫等顏色類型，180°代表純綠色，0°代表純紅色；色光值可以反映物質(zhì)的表面顏色［23-24］。色度值、色調(diào)值、色光值計(jì)算公式如式（3）～（5）：

CV=（a*2+b*2）? （3）

HV=tan-1（b*/a*）（a*gt;0，b*gt;0）或180° + tan-1（b*/a*）（a*lt;0，b*gt;0） （4）

SV=2000×a*/L*×（ a*2 + b*2）? （5）

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2022 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，柱形圖繪制；采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行顯著性分析、相關(guān)性分析、回歸分析和t 檢驗(yàn)。其中顯著性分析采用Duncan’s新復(fù)極差法，顯著性水平為0.05；相關(guān)性分析采用雙變量分析、斯皮爾曼（Spearman）相關(guān)系數(shù)；回歸分析模型采用線性、二次、三次和指數(shù)函數(shù)模型；t 檢驗(yàn)采用兩樣本平均數(shù)配對(duì)法。

2 結(jié)果與分析

2.1 萬壽菊花瓣葉黃素含量

采用紫外-可見分光光度法結(jié)合HPLC 法測(cè)定萬壽菊花瓣葉黃素含量，結(jié)果如圖2 所示。米白色香草的葉黃素含量為0.087 3 g/kg，顯著低于其他花色的萬壽菊；3 種淺黃色的萬壽菊葉黃素含量平均值為0.509 2 g/kg；黃色的萬壽菊葉黃素含量平均值為1.635 3 g/kg；桔黃色萬壽菊的葉黃素含量為4.277 8～10.091 5 g/kg；桔紅色萬壽菊的葉黃素含量為13.101 4～24.762 7 g/kg。萬壽菊花瓣顏色越深，葉黃素含量越高。

2.2 萬壽菊花瓣顏色系數(shù)

L*、a?、b*值等顏色系數(shù)可以用于花色的定量描述。L*代表亮度值，L*=0 代表黑色，L*=100 代表白色。米白色香草的L*值最大，為83.83；其次為淺黃色萬壽菊，L*值均大于70；黃色、桔黃色和桔紅色萬壽菊的L*值（59.91～66.21）顯著降低。a*值代表紅/綠色之間的變化，a*gt;0 表示顏色偏紅，a*lt;0 表示顏色偏綠。桔紅色的9904、貴夫人色素和菊花萬壽菊的a*值均值為25.69，顯著高于其他花色的萬壽菊；米白色和淺黃色的萬壽菊a*值均為負(fù)值，表明花色很淺且有綠色成分。b*值反映黃/藍(lán)色程度，正值是黃色，負(fù)值是藍(lán)色。米白色的萬壽菊b*值為6.93，其他花色萬壽菊的花瓣b*值為22.48～38.81。在其他5 個(gè)花瓣顏色系數(shù)中，隨著萬壽菊花色由淺至深，a*/b*和（a*/b*）2 值均逐漸升高；各類花色的萬壽菊色度值無明顯規(guī)律性變化；桔紅色的萬壽菊色調(diào)值最小，平均值為0.83，最接近0，即顏色更紅，與外觀相一致；桔黃、桔紅色萬壽菊的色光值顯著高于其他淺色品種（表2）。

2.3 萬壽菊花瓣葉黃素含量與顏色系數(shù)的相關(guān)性

由表3 可知，萬壽菊花瓣葉黃素含量與a*值、a*/b*、（a*/b*）2 和色光值極顯著正相關(guān)（Plt;0.01），其相關(guān)系數(shù)分別為0.965、0.989、0.935 和0.944；與色調(diào)值存在極顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.01），相關(guān)系數(shù)為-0.995；與L*值和色度值呈顯著相關(guān)（Plt;0.05），相關(guān)系數(shù)分別為-0.685、0.643；而與b* 值之間無顯著相關(guān)性（Pgt;0.05）。

2.4 萬壽菊花瓣葉黃素含量與顏色系數(shù)的回歸方程

選擇相關(guān)性極顯著的a*值、a*/b*、（a*/b*）2、色調(diào)值和色光值分別建立與葉黃素含量的回歸方程，結(jié)果如表4 所示。在萬壽菊花瓣中，a* 值、a*/b*、（a*/b*）2 和色光值與葉黃素含量的線性、二次、三次和指數(shù)函數(shù)模型擬合程度較好，且與葉黃素含量之間的最佳回歸方程均為三次函數(shù)，分別為y=0.4917+0.0061x+0.0158x2+0.0004x3 （R2=0.971） 、y=0.5906+3.9629x+8.4610x2+9.4740x3（R2=0.950）、y=0.4618+23.7843x―9.8562x2+8.0052x3 （R2=0.949） 和y=0.5276+5.6148x+2.3259×10-8x2―2.0200×10-13x3（R2=0.948）。

為進(jìn)一步驗(yàn)證上述4 個(gè)三次回歸方程預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，分別測(cè)量LYK、6155、CY、GH 這4 種萬壽菊花瓣的a*值、a*/b*、（a*/b*）2 和色光值，分別代入回歸方程得到相應(yīng)的葉黃素含量預(yù)測(cè)值，同時(shí)測(cè)定花瓣中葉黃素的實(shí)際含量。由圖3 可知，基于a*值、色光值分別建立的三次回歸方程得到的葉黃素含量預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值較為符合，特別是對(duì)于深色萬壽菊GH 的葉黃素含量預(yù)測(cè)。對(duì)葉黃素實(shí)測(cè)值和a*值、色光值模型預(yù)測(cè)值進(jìn)行t 檢驗(yàn)及總體均數(shù)的差異顯著性分析，結(jié)果如表5 所示：基于a*值、色光值建立的與葉黃素含量之間的回歸方程獲得的葉黃素預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的總體均數(shù)之間差異均不顯著（Pgt;0.05）；基于a*模型獲得的t=0.788 小于基于色光值模型獲得的t=1.534；基于a*值模型獲得的P=0.448 大于基于色光值模型獲得的P=0.223。因此，用三次函數(shù)建立的葉黃素含量（y）與a*（x）之間的回歸方程得到的萬壽菊花瓣葉黃素含量預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的符合程度更高，可以快速、有效地預(yù)測(cè)萬壽菊花瓣葉黃素含量。

3 討論

利用色差儀測(cè)得的L*、a*、b*值等顏色系數(shù)可以實(shí)現(xiàn)顏色表型的數(shù)量化描述，且已經(jīng)廣泛用于多種園藝作物的顏色評(píng)價(jià)和分類，如易小艷等［25］利用色差儀檢測(cè)了不同處理下柑橘果實(shí)的著色變化；Wang等［26］基于L*、a*、b*值對(duì)24 個(gè)品種的桂花進(jìn)行了分類；周熠瑋等［27］利用色差儀對(duì)姜花的雜交后代群體進(jìn)行了花色檢測(cè)和分類。本研究中萬壽菊花瓣實(shí)際顏色與L*、a*、b*值等顏色系數(shù)的定義基本一致，且不同花色萬壽菊的花瓣顏色系數(shù)差異顯著，表明顏色系數(shù)也可以用于定量描述萬壽菊花色表型。

顏色系數(shù)的大小與類胡蘿卜素和花青素等色素物質(zhì)的含量相關(guān)。前人利用顏色系數(shù)預(yù)測(cè)了番茄果實(shí)中的番茄紅素含量［28］、橙汁中的類胡蘿卜素含量［29］、大白菜和菊花中的花青素含量［30-31］ 等。汪歡笑［32］于北京地區(qū)進(jìn)行了萬壽菊表型性狀研究，結(jié)果顯示萬壽菊花瓣的葉黃素含量與L*、a*、b*值之間的相關(guān)系數(shù)分別為―0.779、0.918、―0.258，與本研究的結(jié)果一致，表明萬壽菊花瓣葉黃素含量和顏色系數(shù)之間存在較穩(wěn)定的相關(guān)性，環(huán)境因素對(duì)其無顯著影響。本研究還分析了葉黃素含量與a*/b*、（a*/b*）2、色度值、色調(diào)值和色光值等其他顏色系數(shù)的相關(guān)性，為探究萬壽菊葉黃素含量與花瓣顏色的關(guān)聯(lián)性提供了更全面的理論依據(jù)。

在建立回歸方程預(yù)測(cè)色素含量方面，國艷梅等［33］利用多個(gè)顏色系數(shù)分別建立線性回歸方程對(duì)番茄果實(shí)番茄紅素進(jìn)行預(yù)測(cè)；周蓉等［34］分別建立了紅色和橙色番茄果實(shí)番茄紅素含量與最佳顏色系數(shù)間的回歸方程；王璐等［24］使用線性、二次、三次函數(shù)模型篩選了可用于預(yù)測(cè)紫色葉用萵苣花青素含量的最佳回歸方程。本研究基于篩選得到的與葉黃素含量極顯著相關(guān)的a*值、a*/b*、（a*/b*）2、色調(diào)值和色光值5 個(gè)顏色系數(shù)構(gòu)建了多種模型的回歸方程，經(jīng)過檢驗(yàn)表明基于a*值和萬壽菊葉黃素含量構(gòu)建的三次回歸方程得到的預(yù)測(cè)值與葉黃素實(shí)測(cè)值的符合程度最好。此外，本研究中回歸方程的建立與驗(yàn)證試驗(yàn)分別在不同年份進(jìn)行，檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性也在一定程度上反映出回歸方程適用的廣泛性。在實(shí)際應(yīng)用中，針對(duì)桔黃和桔紅色等深色系的色素萬壽菊，可以選擇大量的深色萬壽菊材料建立回歸方程預(yù)測(cè)葉黃素含量，以進(jìn)一步提高預(yù)測(cè)的精準(zhǔn)度。

本研究系統(tǒng)地分析了萬壽菊花瓣葉黃素含量與L*、a*、b*、a*/b*、（a*/b*）2 、色度值、色調(diào)值和色光值等多個(gè)顏色系數(shù)的相關(guān)性，建立了萬壽菊花瓣葉黃素含量與a*值之間的最佳回歸方程，即y=0.4917+0.0061x+0.0158x2+0.0004x3，為簡(jiǎn)便、快速、無損、有效地檢測(cè)萬壽菊花瓣葉黃素含量提供了新思路。

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（責(zé)任編輯：葛曉霞）

基金項(xiàng)目：中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展資金項(xiàng)目（YDZX20214400003224）