黑果枸杞SPL轉(zhuǎn)錄因子家族成員鑒定與生物信息學(xué)分析

摘要： SPL（SQUAMOSA promoter-binding protein-like）家族成員參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫響應(yīng)，為探究黑果枸杞SPL家族基因在鹽脅迫下的耐鹽分子機(jī)制，本研究對(duì)其基因家族成員進(jìn)行了鑒定和生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，從黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共篩選出20個(gè)SPL基因家族成員，分為8個(gè)亞家族，蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示SPL蛋白主要定位于細(xì)胞核，20個(gè)SPL蛋白均具有SBP保守結(jié)構(gòu)域。黑果枸杞SPL家族蛋白質(zhì)相對(duì)分子量為15 296.08～130 310.8；等電點(diǎn)為5.64～9.65；總原子數(shù)為2 106～18 214；氨基酸數(shù)量為133～1 176 aa；脂溶指數(shù)為46.35～87.53；均為親水性蛋白質(zhì)和不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。黑果枸杞SPL家族蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，無規(guī)則卷曲和α-螺旋占比較大。表達(dá)模式分析結(jié)果表明，在NaCl脅迫下不同器官中黑果枸杞SPL家族基因具有不同的表達(dá)趨勢(shì)，LrSPL9在根和葉中均為高表達(dá)。該研究結(jié)果可為黑果枸杞SPL基因家族成員鹽脅迫響應(yīng)方面的進(jìn)一步研究提供參考。

關(guān)鍵詞： 黑果枸杞；NaCl脅迫；SPL轉(zhuǎn)錄因子；生物信息學(xué)分析

中圖分類號(hào)： S722.3⁺6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1000-4440（2024）11-2001-12

Identification and bioinformatics analysis of SPL transcription factor family members in Lycium ruthenicum

LIU Yun¹， GUO Yi²， LI Xiaoxiong³， HU Xiaotong¹， MA Rui¹， DU Yu¹， JIA Xibei¹， LIU Di¹， MA Yanjun¹

（1.College of Forestry， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China;2.Gansu Forestry Polytechnic， Tianshui 741020， China;3.Lanzhou Resources amp; Environment Voc-Tech University， Lanzhou 730030， China）

Abstract： The SQUAMOSA promoter-binding protein-like （SPL） family members are involved in plant growth and development and stress response. To investigate the salt tolerance molecular mechanism of Lycium ruthenicum SPL family genes under salt stress， the gene family members were identified and analyzed by bioinformatics. The results showed that 20 SPL family members were screened from transcriptome data of Lycium ruthenicum， and they were divided into eight subfamilies. The results of protein subcellular localization prediction showed that SPL proteins were mainly located in the nucleus， and 20 SPL proteins had SBP conserved domains. The relative molecular weight of SPL family proteins in Lycium ruthenicum was 15 296.08-130 310.8. The isoelectric point was 5.64-9.65， the total number of atoms was 2 106-18 214， the number of amino acids was 133-1 176 aa， and the lipid solubility index was 46.35-87.53. All of them were hydrophilic proteins and unstable proteins. The results of protein structure analysis of SPL family in Lycium ruthenicum showed that random coil and α-helix accounted for a large proportion. The results of expression pattern analysis showed that the SPL family genes of Lycium ruthenicum had different expression trends in different organs under NaCl stress， and LrSPL9 was highly expressed in roots and leaves. The results of this study can provide a reference for further research on salt stress response of SPL gene family members in Lycium ruthenicum.

Key words： Lycium ruthenicum;NaCl stress;SPL transcription factor;bioinformatics analysis

SPL（SQUAMOSA promoter-binding protein-like）是一類廣泛存在于植物中的重要的特異性轉(zhuǎn)錄因子，其蛋白質(zhì)均具有SBP結(jié)構(gòu)域^[1-2]。SPL轉(zhuǎn)錄因子最初是在金魚草（Antirrhinum majus L.）中發(fā)現(xiàn)并由此得名^[3]，SPL在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中參與花的發(fā)育及調(diào)控、根的發(fā)育、非生物與生物的脅迫應(yīng)答^[4-5]。例如在鹽脅迫或干旱脅迫下SPL家族成員會(huì)通過調(diào)節(jié)基因參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的豐度、脯氨酸合成和花青素代謝等來響應(yīng)鹽脅迫或干旱脅迫^[2]。研究人員在對(duì)擬南芥（Arabidopsis thaliana）的研究中發(fā)現(xiàn)，沉默miR156靶向的SPL2、SPL9、SPL11基因，可增強(qiáng)擬南芥遭受高溫脅迫、鹽脅迫和干旱脅迫后的恢復(fù)能力^[6]；水稻（Oryza sativa）中miR156靶向調(diào)節(jié)SPL基因，可增強(qiáng)水稻遭受鹽脅迫、干旱脅迫后的恢復(fù)能力。白樺（Betula platyphylla）中BpSPL6基因轉(zhuǎn)至擬南芥后進(jìn)行鹽脅迫和干旱脅迫試驗(yàn)^[7]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脅迫發(fā)生后，BpSPL6基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因表達(dá)量有所下降。鐵皮石斛（Dendrobium officinale）中DoSTM3基因在NaCl脅迫下其相對(duì)表達(dá)水平與對(duì)照組相比顯著降低^[8]，推測(cè)SPL基因可能參與植物鹽脅迫和干旱脅迫的響應(yīng)。

黑果枸杞（Lycium ruthenicum）為茄科（Solanaceae）枸杞屬（Lycium）多年生落葉小灌木。因果實(shí)中含有豐富的花青素、維生素、蔗糖和脂肪等^[9]，并且可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、紡織、食品等領(lǐng)域，在植物中有“軟黃金”的美稱^[10]。它還是中國(guó)鹽堿地區(qū)和荒漠地區(qū)的重要建群樹^[11-12]。但是現(xiàn)在關(guān)于黑果枸杞耐鹽基因的相關(guān)報(bào)道相對(duì)較少，所以研究其耐鹽分子機(jī)理對(duì)于人工栽培和良種選育具有現(xiàn)實(shí)意義。

目前已從擬南芥^[6]、水稻^[13]、小麥（Triticum aestivum）^[14]、玉米（Zea mays）^[15]、番茄（Solanum lycopersicum）^[16]、圓齒野鴉椿（Euscaphis konishii）^[17]、紅花（Carthamus tinctorius）^[18]、芥藍(lán)（Brassica oleracea var.）^[19]、馬尾松（Pinus massoniana）^[20]和山羊草（Aegilops tauschii）^[21]等多種植物中鑒定出SPL轉(zhuǎn)錄因子家族基因，但在黑果枸杞中尚未有SPL基因的相關(guān)研究報(bào)道。本研究基于不同濃度NaCl在不同脅迫時(shí)間處理下的黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)方法系統(tǒng)鑒定黑果枸杞SPL基因家族成員，并分析其編碼的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、保守結(jié)構(gòu)域、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進(jìn)化樹及表達(dá)模式，為深入研究SPL基因在黑果枸杞抗鹽脅迫方面的作用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用植物材料是保存于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院組培實(shí)驗(yàn)室的黑果枸杞組培苗，組培苗培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基配方見表1。在配置好的培養(yǎng)基中快速繁殖黑果枸杞組培苗，14 d后選取生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)一致的黑果枸杞組培苗煉苗5 d，然后將其移栽到配置好的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液（pH為5.7）中再培養(yǎng)14 d，之后將其移入1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行鹽脅迫（NaCl）處理^[22-23]。鹽脅迫處理方式有3種，分別是不加NaCl、加入50 mmol/L NaCl、加入250 mmol/L NaCl，分別在鹽脅迫處理0 h、1 h和12 h進(jìn)行取樣^[24]。對(duì)相同的NaCl處理方式的樣品分別進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。經(jīng)過NaCl處理后，選擇不同方位生長(zhǎng)良好的主根和完整的葉片取樣，選取的測(cè)試樣品重量約0.1 g，采集樣品后用液氮速凍并保存于-80 ℃冰箱中備用。樣品密封后送至上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.2 生物信息學(xué)分析

1.2.1 黑果枸杞SPL基因家族成員的鑒定 在Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//pfam.xfam.org/）下載SPL家族（PF03110）^{[21，25]}的隱馬爾可夫模型文件，使用TBtools軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)初篩，然后根據(jù)SPL家族蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域SBP，用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）在線軟件和SMART（https：//smart.embl.de/）在線軟件再次篩選，最終得到黑果枸杞SPL基因家族成員。

1.2.2 黑果枸杞SPL家族蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)及理化性質(zhì)分析 應(yīng)用WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）在線軟件預(yù)測(cè)黑果枸杞SPL家族蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位，采用Expasy-ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）在線軟件對(duì)黑果枸杞SPL家族蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和親疏水性進(jìn)行分析，使用SignalP-6.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0/）在線軟件預(yù)測(cè)黑果枸杞SPL家族蛋白質(zhì)信號(hào)肽，使用ChiPlot（https：//www.chiplot.online/）在線軟件繪制黑果枸杞SPL家族蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果。

1.2.3 黑果枸杞SPL家族蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析 利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）在線軟件進(jìn)行黑果枸杞SPL家族蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和分析，采用MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）在線軟件分析黑果枸杞SPL家族蛋白質(zhì)保守基序，使用TBtools軟件對(duì)黑果枸杞SPL蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化、保守結(jié)構(gòu)域和保守基序進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化。

1.2.4 黑果枸杞SPL家族蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化分析 在TAIR（https：//www.arabidopsis.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)下載擬南芥SPL家族蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)，在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)下載番茄SPL家族蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)和煙草（Nicotiana tabacum）SPL家族蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)，利用MEGA-X軟件的MUSCLE工具進(jìn)行黑果枸杞、番茄、煙草和擬南芥SPL蛋白的多序列比對(duì)，然后使用MEGA-X軟件最大似然法（Maximum likelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并把Bootstrap參數(shù)設(shè)置為1 000。使用ChiPlot TVBOT（https：//www.chiplot.online/tvbot.html）^[26]在線軟件繪制黑果枸杞、番茄、煙草和擬南芥SPL家族蛋白質(zhì)的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5 黑果枸杞SPL基因家族成員的表達(dá)模式分析 根據(jù)軟件^[27-28]計(jì)算得到的FPKM（Fragments per kilobase per million reads sequenced）數(shù)據(jù)，使用ChiPlot在線軟件繪制黑果枸杞SPL基因家族成員在其根與葉中的表達(dá)模式以及黑果枸杞SPL基因響應(yīng)鹽脅迫的表達(dá)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑果枸杞SPL基因家族成員鑒定

黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra）的登錄號(hào)為SRR7700825^[29-31]。通過SPL家族的隱馬爾可夫模型文件和TBtools軟件初篩黑果枸杞SPL基因家族成員后，在NCBI Conserved Domains和SMART上進(jìn)一步去除無SBP保守結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，最終得到黑果枸杞SPL基因家族成員20個(gè)，分別命名為L(zhǎng)rSPL1～LrSPL20（表2）。

2.2 黑果枸杞SPL家族蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位及理化性質(zhì)

從圖1可知，黑果枸杞SPL家族蛋白質(zhì)中除LrSPL10蛋白亞細(xì)胞定位于質(zhì)膜，其余19個(gè)蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位在細(xì)胞核，并且20條蛋白質(zhì)氨基酸序列都不含有信號(hào)肽。從表2可見，黑果枸杞SPL蛋白相對(duì)分子量為15 296.08～130 310.8；等電點(diǎn)為5.64～9.65，除LrSPL9、LrSPL10、LrSPL11、LrSPL12、LrSPL15蛋白之外，其余15個(gè)LrSPL蛋白的等電點(diǎn)都大于7.0，說明黑果枸杞SPL家族蛋白質(zhì)大多數(shù)富含堿性氨基酸；不穩(wěn)定系數(shù)為43.97～78.27，均為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)；脂溶指數(shù)為46.35～87.53；親水指數(shù)為-1.199～-0.164，全部是親水性蛋白質(zhì)；總原子數(shù)為2 106～18 214；氨基酸個(gè)數(shù)為133～1 176 aa。

Expasy-ProtScale在線軟件分析黑果枸杞SPL家族蛋白質(zhì)的親水性和疏水性，結(jié)果如圖2所示，LrSPL1最高值為2.456，在113位；最低值為-3.322，在152位。LrSPL2最高值為1.767，在192位；最低值為-3.989，在232位。LrSPL3最高值為1.233，在362位；最低值為-3.600，在226位。LrSPL4最高值為2.244，在150位；最低值為-3.356，在244位。LrSPL5最高值為1.789，在23位；最低值為-3.744，在96位。LrSPL6最高值為1.467，在243位；最低值為-3.600，在205位。LrSPL7最高值為1.667，在103位；最低值為-3.422，在142位。LrSPL8最高值為1.678，在186位；最低值為-3.356，在227位。LrSPL9最高值為3.311，在961位；最低值為-3.578，在210位。LrSPL10最高值為3.344，在1149位；最低值為-3.544，在215位。LrSPL11最高值為2.522，在344位；最低值為-4.067，在193位。LrSPL12最高值為3.344，在991位；最低值為-3.544，在215位。LrSPL13最高值為3.311，在951位；最低值為-3.611，在223位。LrSPL14最高值為2.544，在87位；最低值為-3.544，在127位。LrSPL15最高值為2.522，在374位；最低值為-4.067，在193位。LrSPL16最高值為1.667，在38位；最低值為-3.422，在77位。LrSPL17最高值為1.967，在32位；最低值為-3.544，在71位。LrSPL18最高值為1.778，在92位；最低值為-3.633，在278位。LrSPL19最高值為2.122，在242位；最低值為-3.633，在281。LrSPL20最高值為1.678，在268位；最低值為-3.633，在176位。由此可見，20條LrSPL蛋白氨基酸序列均存在明確的親水區(qū)域和疏水區(qū)域，并且親水區(qū)域多于疏水區(qū)域，表明LrSPL家族蛋白質(zhì)均為親水性蛋白質(zhì)。

2.3 黑果枸杞SPL家族蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域

LrSPL蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和分析結(jié)果（表3、圖3）表明，20個(gè)蛋白質(zhì)均含有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲和延伸鏈。在LrSPL家族蛋白質(zhì)中α-螺旋分布占比11.00%～48.91%，β-轉(zhuǎn)角分布占比0.75%～8.43%，無規(guī)則卷曲分布占比37.23%～70.72%，延伸鏈分布占比7.30%～18.21%，其中無規(guī)則卷曲＞α-螺旋＞延伸鏈＞β-轉(zhuǎn)角的LrSPL蛋白最多，有17個(gè)，所占比例為85.00%；2個(gè)LrSPL蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為無規(guī)則卷曲＞延伸鏈＞α-螺旋＞β-轉(zhuǎn)角，比例是10.00%；1個(gè)LrSPL蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為α-螺旋＞無規(guī)則卷曲＞延伸鏈＞β-轉(zhuǎn)角，比例是5.00%。LrSPL蛋白空間結(jié)構(gòu)的不同決定了蛋白質(zhì)功能的差異，為后續(xù)黑果枸杞SPL家族的蛋白質(zhì)研究提供參考。

黑果枸杞20個(gè)LrSPL蛋白氨基酸序列中均含有1個(gè)SBP結(jié)構(gòu)域；其中LrSPL9、LrSPL10、LrSPL12和LrSPL13還分別含有1個(gè)Ank_2 superfamily結(jié)構(gòu)域（圖4B）。MEME在線軟件對(duì)LrSPL家族蛋白質(zhì)的分析結(jié)果顯示，LrSPL蛋白共包含5個(gè)保守基序，分別為motif 1、 motif 2、 motif 3、 motif4和 motif 5，其中含5個(gè)motif的LrSPL蛋白有4個(gè)，含4個(gè)motif的LrSPL蛋白有2個(gè)，含3個(gè)motif的LrSPL蛋白有13個(gè)，含2個(gè)motif的LrSPL蛋白有1個(gè)，除LrSPL17，其余蛋白質(zhì)均含motif 1、motif 3和motif 4（圖4C）。由此推測(cè)，motif 1、motif 3和motif 4相比其他基序的保守性較高，與LrSPL家族蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的保守性基本一致。

2.4 黑果枸杞SPL家族蛋白質(zhì)的系統(tǒng)進(jìn)化

為了更全面地了解黑果枸杞SPL家族蛋白質(zhì)的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，將其20個(gè)SPL蛋白，番茄的29個(gè)SPL蛋白，煙草的13個(gè)SPL蛋白和擬南芥的16個(gè)SPL蛋白，共 78個(gè)SPL蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5）。根據(jù)4種植物的SPL家族蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化樹可知，黑果枸杞SPL家族成員可分為8個(gè)亞家族，黑果枸杞中存在3個(gè)同源基因?qū)?。在SPL家族蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化樹的78個(gè)成員中，第Ⅰ亞家族LrSPL4與煙草Nt59156的親緣關(guān)系最近，LrSPL8與番茄Sl010321004的親緣關(guān)系最近；第Ⅱ亞家族LrSPL7與番茄Sl004249164的親緣關(guān)系最近，LrSPL16與煙草Nt59145的親緣關(guān)系最近；第Ⅲ亞家族LrSPL3、LrSPL6與番茄Sl004252249、Sl025884439的親緣關(guān)系近，LrSPL18和LrSPL20與擬南芥At1G69170的親緣關(guān)系最近，LrSPL19與番茄Sl004239031的親緣關(guān)系最近，LrSPL5與煙草Nt59148的親緣關(guān)系近；第Ⅳ亞家族LrSPL10、LrSPL12、LrSPL13與番茄Sl004239889的親緣關(guān)系近，LrSPL9與煙草Nt59149的親緣關(guān)系近；第V亞家族，LrSPL2與番茄Sl004229775的親緣關(guān)系最近；第Ⅵ亞家族LrSPL1與煙草Nt59154、Nt59153的親緣關(guān)系近，LrSPL17與番茄Sl004243367的親緣關(guān)系最近；第Ⅶ亞家族LrSPL14與煙草Nt59157的親緣關(guān)系最近； 第Ⅷ亞家族LrSPL11、LrSPL15與番茄Sl019070792、Sl019070794、Sl010323003的親緣關(guān)系近。根據(jù)以上結(jié)果，黑果枸杞SPL家族蛋白質(zhì)與番茄SPL家族蛋白質(zhì)親緣關(guān)系最近，其次是煙草。因此推測(cè)LrSPL家族蛋白質(zhì)具有多樣性，而親緣關(guān)系較近的蛋白質(zhì)可能還具有相似或相近的生物學(xué)功能。

2.5 黑果枸杞SPL基因家族成員在鹽脅迫下的表達(dá)模式

為初步探索黑果枸杞SPL基因的功能，通過不同濃度NaCl、不同脅迫時(shí)間處理，研究20個(gè)LrSPL基因在黑果枸杞根與葉中的表達(dá)（圖6）。結(jié)果表明，在鹽脅迫下，不同LrSPL基因在不同器官中的表達(dá)量存在差異，并且SPL基因在黑果枸杞根中比在葉中更活躍。其中LrSPL20在根部和葉片的表達(dá)量較低，而LrSPL9在根部和葉片的表達(dá)量都較高，LrSPL1、LrSPL2、LrSPL10、LrSPL12、LrSPL14和LrSPL17在根部下調(diào)，葉片上調(diào)；LrSPL3、LrSPL4、LrSPL5、LrSPL6、LrSPL8、LrSPL9、LrSPL11、LrSPL15和LrSPL19在根部上調(diào)，葉片下調(diào)。LrSPL1、LrSPL2和LrSPL5在NaCl濃度為50 mmol/L，脅迫時(shí)間為1 h和12 h時(shí)（L50_1、L50_12），在葉片的表達(dá)量與對(duì)照（L0）相比均呈上升趨勢(shì)；NaCl濃度為250 mmol/L，脅迫時(shí)間為1 h和12 h時(shí)（L250_1、L250_12），在葉片的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)；LrSPL9、LrSPL19和LrSPL20在NaCl濃度為50 mmol/L，脅迫時(shí)間為1 h和12 h時(shí)（R50_1、R50_12），在根部的表達(dá)量與對(duì)照（R0）相比均呈上升趨勢(shì)；NaCl濃度為250 mmol/L，脅迫時(shí)間為1 h和12 h時(shí)（R250_1、R250_12），在根部的表達(dá)量與對(duì)照相比也呈上升趨勢(shì)。由此推測(cè)LrSPL1、LrSPL2、LrSPL5、LrSPL9、LrSPL19、LrSPL20在響應(yīng)鹽脅迫的過程中發(fā)揮調(diào)控作用。

3 討論

SPL轉(zhuǎn)錄因子是植物中特有的重要轉(zhuǎn)錄因子^[32]，但是在植物基因家族的鑒定與生物信息學(xué)分析中SPL家族的研究相對(duì)較少。目前已在擬南芥、水稻、玉米、番茄、圓齒野鴉椿、紅花、芥藍(lán)、馬尾松、山羊草、小麥^[25]、桂花（Osmanthus fragrans）^[33]、甜橙（Citrus sinensis）^[34]和甘薯（Dioscorea esculenta）^[35]等不同植物中鑒定出SPL基因家族成員，但在不同植物中SPL基因家族的成員數(shù)量存在差異。本研究通過生物信息學(xué)方法鑒定得到20個(gè)黑果枸杞SPL基因家族成員，而擬南芥有16個(gè)SPL基因，水稻有19個(gè)SPL基因^[36]，小麥有56個(gè)SPL基因，番茄有29個(gè)SPL基因，圓齒野鴉椿有29個(gè)SPL基因，紅花有21個(gè)SPL基因，芥藍(lán)有31個(gè)SPL基因，馬尾松有11個(gè)SPL基因，山羊草有18個(gè)SPL基因，桂花有29個(gè)SPL基因，甜橙有15個(gè)SPL基因，甘薯有30個(gè)SPL基因。SPL基因家族成員在已完成測(cè)序的植物與黑果枸杞的鑒定結(jié)果中數(shù)量未出現(xiàn)較大差別。

L50_1表示NaCl濃度為50 mmol/L、脅迫時(shí)間為1 h時(shí)LrSPL基因在葉片的表達(dá)；L250_1表示NaCl濃度為250 mmol/L、脅迫時(shí)間為1 h時(shí)LrSPL基因在葉片的表達(dá)；L0表示NaCl濃度為0 mmol/L、脅迫時(shí)間為0 h時(shí)LrSPL基因在葉片的表達(dá)；L50_12表示NaCl濃度為50 mmol/L、脅迫時(shí)間為12 h時(shí)LrSPL基因在葉片的表達(dá)；L250_12表示NaCl濃度為250 mmol/L、脅迫時(shí)間為12 h時(shí)LrSPL基因在葉片的表達(dá)。R50_1表示NaCl濃度為50 mmol/L、脅迫時(shí)間為1 h時(shí)LrSPL基因在根部的表達(dá)；R250_1表示NaCl濃度為250 mmol/L、脅迫時(shí)間為1 h時(shí)LrSPL基因在根部的表達(dá)；R0表示NaCl濃度為0 mmol/L、脅迫時(shí)間為0 h時(shí)LrSPL基因在根部的表達(dá)；R50_12表示NaCl濃度為50 mmol/L、脅迫時(shí)間為12 h時(shí)LrSPL基因在根部的表達(dá)；R250_12表示NaCl濃度為250 mmol/L、脅迫時(shí)間為12 h時(shí)LrSPL基因在根部的表達(dá)。

本研究中LrSPL蛋白家族中多數(shù)成員的等電點(diǎn)大于7.0，這與大部分植物SPL蛋白家族成員的等電點(diǎn)大于7.0的情況基本一致^[37-39]。通過黑果枸杞SPL蛋白保守基序分析結(jié)果可知，除了LrSPL17外，其余19個(gè)蛋白質(zhì)均含motif 1、motif 3和motif 4。這與圓齒野鴉椿、芥藍(lán)、馬尾松、山羊草、甜橙、擬南芥與番茄^[35]等SPL蛋白均是motif 1在SPL家族蛋白中占多數(shù)的情況類似。根據(jù)蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果可知，LrSPL家族蛋白質(zhì)可以分為8個(gè)亞族。LrSPL18和LrSPL20聚類于第Ⅲ亞家族的同一分支中，LrSPL10和LrSPL12聚類于第Ⅳ亞家族的同一分支中，LrSPL11和LrSPL15聚類于第Ⅷ亞家族的同一分支中。聚類在同一分支的蛋白質(zhì)其保守結(jié)構(gòu)域的組成、排列順序及位置基本相同，說明LrSPL的分類結(jié)果進(jìn)一步得到了保守基序的支持，也意味著LrSPL亞族成員間序列的高度保守性。所有亞族中的黑果枸杞SPL家族成員與番茄SPL家族成員相聚較近，表明黑果枸杞與番茄進(jìn)化距離比擬南芥、煙草更近。

本研究結(jié)果表明，SPL轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長(zhǎng)發(fā)育及脅迫應(yīng)答等過程中具備調(diào)控作用^[32]。本研究鑒定到20個(gè)黑果枸杞SPL家族蛋白質(zhì)均為親水性蛋白質(zhì)，在馬尾松、圓齒野鴉椿、鐵皮石斛等植物中，它們的SPL蛋白也均是親水性蛋白質(zhì)，而親水性蛋白質(zhì)對(duì)植物抵抗非生物脅迫有利^[40]。鹽脅迫下，黑果枸杞根與葉的LrSPL表達(dá)模式分析結(jié)果顯示，其在不同器官中的表達(dá)量存在明顯差異，這與其他植物SPL基因家族成員的鹽脅迫研究結(jié)果有相似之處^[35]。在不同濃度鹽脅迫下LrSPL1、LrSPL2和LrSPL5在葉片的表達(dá)量，LrSPL9、LrSPL19和LrSPL20在根部的表達(dá)量，與榮譽(yù)磊等^[35]對(duì)擬南芥SPL基因家族成員在鹽脅迫下的研究結(jié)果，楊樂等^[8]對(duì)鐵皮石斛SPL基因家族成員在鹽脅迫下的研究結(jié)果相似，推測(cè)它們可能在響應(yīng)鹽脅迫的過程中發(fā)揮著調(diào)控作用。LrSPL基因的鑒定與分析結(jié)果為進(jìn)一步研究黑果枸杞在鹽脅迫方面的基因表達(dá)提供理論依據(jù)，為進(jìn)一步研究此類基因是否具有鹽脅迫應(yīng)答能力以及轉(zhuǎn)基因品種的獲取提供參考。

4 結(jié)論

在黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組中共篩選出20個(gè)SPL基因，分為8個(gè)亞家族。蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)中其家族成員主要定位于細(xì)胞核，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中20個(gè)蛋白質(zhì)均含有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲和延伸鏈，蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示在擬南芥、煙草和番茄這3種植物中，黑果枸杞SPL家族蛋白質(zhì)與番茄SPL家族蛋白質(zhì)親緣關(guān)系最近，其次是煙草。表達(dá)模式分析結(jié)果表明，LrSPL20在根部和葉片中均為低表達(dá)，LrSPL9在根部和葉片中均為高表達(dá)。LrSPL9、LrSPL19和LrSPL20在NaCl不同濃度，不同脅迫時(shí)間下，與對(duì)照相比在根部的表達(dá)量均呈上升趨勢(shì)；LrSPL1、LrSPL2和LrSPL5在低濃度鹽脅迫，不同脅迫時(shí)間下，與對(duì)照相比葉片表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，而高濃度鹽脅迫下葉片表達(dá)量與對(duì)照相比呈下降趨勢(shì)。由此推測(cè)LrSPL基因的功能可能與鹽脅迫響應(yīng)相關(guān)。本研究結(jié)果為黑果枸杞SPL基因家族成員的功能鑒定及后續(xù)黑果枸杞耐鹽基因的進(jìn)一步篩選提供了參考。

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（責(zé)任編輯：黃克玲）