豇豆GATL基因家族密碼子偏好性分析

摘要： 為明確豇豆類似半乳糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶（GATL）基因密碼子使用偏好及其影響因素，本研究對32條豇豆GATL基因家族成員進(jìn)行分析。結(jié)果表明，大部分GATL基因家族成員密碼子偏好以A/T結(jié)尾。豇豆GATL基因家族的有效密碼子數(shù)（ENc）為39.29～55.77，平均值為51.06，同義密碼子第3位G+C的含量（GC3）為34.10%～74.60%，表明豇豆GATL基因家族密碼子使用偏好性較弱。相對同義密碼子使用度（RSCU）聚類結(jié)果與編碼序列（CDS）聚類結(jié)果基本一致。通過偏倚分析（PR2-plot分析）、ENc-plot分析以及中性繪圖分析可以看出，豇豆GATL基因家族密碼子使用偏好主要受自然選擇的影響。本研究結(jié)果可為豇豆GATL的基因表達(dá)和功能驗證提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 豇豆；GATL基因家族；相關(guān)性分析；密碼子偏好性

中圖分類號： S643.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A 文章編號： 1000-4440（2024）11-2131-09

Codon usage bias analysis of cowpea GATL gene family

ZENG Chuntao， LIANG Junjie， QIU Xuewen， ZHANG Shuyue， CHENG Liuyang， WU Caijun

（College of Agriculture， Jiangxi Agricultural University， Nanchang 330000， China）

Abstract： To clarify the codon usage bias of galacturonic acid transferase-like （GATL） genes in cowpea and influencing factors， the 32 members of the cowpea GATL gene family were analyzed in this study. The results showed that most of the codons preferred by the GATL gene family ended with A/T. The effective number of codons （ENc） of the cowpea GATL gene family ranged from 39.29 to 55.77， with an average of 51.06， and the contents of G+C at the third position of synony-mous Sodons （GC3） ranged from 34.10% to 74.60%， indicating that the codon usage bias of the cowpea GATL gene family was weak. The relative synonymous codon usage （RSCU） clustering results were basically consistent with the coding sequence （CDS） clustering results. Results of parity rule 2 （PR2）-plot analysis， ENc-plot analysis， and neutral plotting analysis showed that the codon usage bias of cowpea GATL gene family was mainly affected by natural selection. The results of this study provide a theoretical basis for the gene expression and functional verification of GATL in cowpeas.

Key words： cowpea；GATL gene family；correlation analysis；codon preference

密碼子是mRNA上的3個相鄰核苷酸序列，用于傳遞生物體內(nèi)遺傳信息，指示蛋白質(zhì)合成^[1]。密碼子具有簡并性^[2]，即大多數(shù)氨基酸可以由多個密碼子編碼，而編碼同一個氨基酸的不同密碼子稱為同義密碼子^[3]。各同義密碼子在編碼蛋白質(zhì)時使用頻率的不均衡，稱為密碼子的使用偏好（Codon usage bias，CUB）^[4]。已有研究結(jié)果表明，密碼子的使用偏好是生物為適應(yīng)環(huán)境在長期進(jìn)化過程中形成的^[5]。生物對密碼子的使用偏好受到多種因素影響，包括自然選擇、堿基突變^[6]。密碼子使用偏好與基因表達(dá)緊密關(guān)聯(lián)，因此，研究密碼子使用偏好對探索物種遺傳和變異具有重要意義。在植物體內(nèi)，類似半乳糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶（GATL）基因家族參與細(xì)胞壁中的果膠及木聚糖等的生物合成^[7]。在巨桉中，GATL基因表達(dá)受低溫脅迫誘導(dǎo)，與巨桉的逆境響應(yīng)相關(guān)^[8]。在水稻中，GATL基因表達(dá)受到低溫、干旱和ABA誘導(dǎo)，響應(yīng)非生物逆境脅迫^[9]。仇學(xué)文等^[10]對豇豆OSCA基因的密碼子使用偏好進(jìn)行了研究，而豇豆GATL基因的密碼子使用偏好還未見報道。

豇豆[Vigna unguiculata （L.） Walp]屬豆科（Fabaceae）豇豆屬（Vigna Savi），為一年生纏繞或近直立草本植物，喜溫、耐熱、不耐低溫。豇豆在中國栽培面積廣闊，栽培方式主要為露地栽培和設(shè)施栽培^[11]。極端天氣下，露地栽培的豇豆易落花落莢，根系生長發(fā)育不良，最終造成豇豆減產(chǎn)。本研究擬對豇豆GATL基因家族密碼子的偏好性進(jìn)行分析，為培育抗逆性強的豇豆品種提供理論依據(jù)，從而解決在極端天氣下露地栽培的豇豆產(chǎn)量降低的問題。

1 材料與方法

1.1 GATL基因家族成員鑒定

將擬南芥的10個GATL基因家族成員與豇豆的基因組進(jìn)行BLAST比對，獲得候選序列，將候選序列上傳至pfam網(wǎng)站（http：//pfam.xfam.org/），驗證候選序列，刪除不合格的，得到如表1所示的32個豇豆GATL基因家族成員，利用TBtools獲取豇豆GATL基因家族成員的編碼序列（CDS），用于進(jìn)一步分析。

1.2 密碼子堿基相關(guān)參數(shù)的獲取

使用Codon W1.4、MEGA 11軟件以及CUSP網(wǎng)站（http：//emboss.toulouse.inra.fr/cgi-bin/emboss/cusp）分析豇豆GATL基因家族成員，獲得密碼子堿基的組成以及同義密碼子相對使用度（RSCU）等相關(guān)參數(shù)。

1.3 相關(guān)性分析

把豇豆GATL基因家族成員的T3（同義密碼子第3位堿基T的含量）、C3（同義密碼子第3位堿基C的含量）、A3（同義密碼子第3位堿基A的含量）、G3（同義密碼子第3位堿基G的含量）、GC3（同義密碼子第3位G+C的含量）、GC（基因組中G+C含量）、CAI（密碼子適應(yīng)指數(shù)）、CBI（密碼子偏性指數(shù)）、Fop（最優(yōu)密碼子使用頻率）和ENc（有效密碼子數(shù)）等相關(guān)參數(shù)輸入SPSS26中，進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，最后使用Origin2021進(jìn)行圖像處理。

1.4 RSCU聚類熱圖及CDS序列聚類樹狀圖的繪制

使用TBtools分析豇豆GATL基因家族密碼子的RSCU，并繪制RSCU聚類熱圖。使用MEGA11繪制豇豆GATL基因的CDS序列聚類樹狀圖。

1.5 PR2-plot分析、ENc-plot和中性圖分析

以G3/（G3+C3）為橫坐標(biāo)，A3/（A3+T3）為縱坐標(biāo)，繪制PR2-plot圖。在PR2-plot圖上作出參考線x=0.5和y=0.5，用于分析豇豆GATL基因密碼子的偏好性。

使用Origin2021軟件，以ENc值為縱坐標(biāo)，GC3為橫坐標(biāo)，繪制ENc-plot圖。理論ENc值利用公式Enc=2+GC3+29/[GC3²+（1-GC3）²] 計算，再以理論Enc值為縱坐標(biāo)，GC3為橫坐標(biāo)，在ENc-plot圖上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

以GC12（密碼子第1位和第2位的G+C含量的平均值）為縱坐標(biāo)，GC3為橫坐標(biāo)，繪制中性圖，以y=x直線作為參考，用于分析影響豇豆GATL基因密碼子使用偏好的因素。利用Origin2021對中性圖進(jìn)行線性擬合，得到相關(guān)系數(shù)等參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 豇豆GATL基因家族密碼子堿基組成分析

采用軟件Codon W1.4和MEGA 11分析豇豆GATL基因家族密碼子偏好性相關(guān)參數(shù)，豇豆GATL基因家族成員T3為14.73%～48.02%，平均值為35.80%；C3為20.52%～67.41%，平均值為31.92%；A3為11.28%～40.26%，平均值為28.09%；G3為18.72%～44.40%，平均值為30.65%。豇豆GATL基因家族大部分成員的同義密碼子堿基偏好以T或C結(jié)尾，但VuGATL3、VuGATL5、VuGATL8、VuGATL22、VuGATL23同義密碼子偏好以G或C結(jié)尾。VuGATL4、VuGATL5、VuGATL6、VuGATL28、VuGATL31同義密碼子第3位對A的偏好略大于對T的偏好，而其他GATL基因家族成員同義密碼子第3位對T的偏好略大于對A的偏好。豇豆GATL基因家族成員的GC為40.60%～58.80%，GC平均值為46.41%（表2）。

2.2 豇豆GATL基因家族密碼子參數(shù)分析

用Codon W1.4軟件分析豇豆GATL基因家族密碼子相關(guān)參數(shù)。如表3所示，豇豆GATL基因家族的有效密碼子數(shù)（ENc）為39.29～55.77，平均值為51.06；最優(yōu)密碼子使用頻率（Fop）為0.32～0.54，平均值為0.41；密碼子適應(yīng)性指數(shù)（CAI）為0.17～0.25，平均值為0.21；密碼子偏好性指數(shù)（CBI）為-0.153～0.220，平均值為0.001；同義密碼子數(shù)（L_sym）為331～670，平均值為487；編碼氨基酸數(shù)（L_aa）為344～694，平均值為509；編碼蛋白質(zhì)疏水性（Gravy）為-0.60～0.05，平均值為-0.24；編碼蛋白質(zhì)芳香性（Aromo）為0.08～0.13，平均值為0.11。

2.3 豇豆GATL基因家族密碼子參數(shù)相關(guān)性分析

由圖1可知，T3與C3呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與GC3、C3、GC、CAI、CBI、Fop呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；A3與C3、G3、GC3、GC、CAI、CBI、Fop呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。ENc與T3、A3呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；C3與GC、GC3、CAI、CBI、Fop呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與ENc則呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；G3與GC、GC3呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與CAI、CBI、Fop、Enc無顯著相關(guān)性；GC3與GC、CAI、CBI、Fop呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與ENc呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；GC與CAI、CBI、Fop呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與ENc呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；CAI與CBI、Fop呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與ENc呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；CBI與Fop呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與ENc呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。Fop與ENc呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。

2.4 豇豆GATL基因家族密碼子相對使用度分析

如表4所示，排除3個終止密碼子UAA、UGA、UAG，僅編碼色氨酸（Trp）的密碼子UGG和僅編碼甲硫氨酸（Met）的密碼子UAG，對剩余的密碼子進(jìn)行分析。RSCU＞1.00的密碼子共有29個，占總密碼子的49.15%。在上述RSCU＞1.00的密碼子中，以A結(jié)尾的密碼子有8個，以U結(jié)尾的密碼子有10個，以C和G結(jié)尾的密碼子分別有7個和4個。與此相反，RSCU＜1.00的密碼子有27個，其中以C結(jié)尾和G結(jié)尾的密碼子分別有7個和9個，而以U結(jié)尾和A結(jié)尾的密碼子分別有5個和6個。這表明在豇豆GATL基因家族中，使用度偏高的同義密碼子偏好使用U/A結(jié)尾，而使用度偏低的同義密碼子偏好使用G/C結(jié)尾。

2.5 豇豆GATL基因家族密碼子RSCU熱圖聚類分析

如圖2所示， VuGATL1、VuGATL9、VuGATL10、VuGATL11、VuGATL12、VuGATL13、VuGATL15、VuGATL17、VuGATL20、VuGATL21、VuGATL29聚為一類，VuGATL2、VuGATL3、VuGATL4、VuGATL5、VuGATL6、VuGATL8、VuGATL22、VuGATL23、VuGATL24、VuGATL28聚為一類，VuGATL7、VuGATL14、VuGATL18、VuGATL19、VuGATL25、VuGATL32聚為一類，VuGATL16、VuGATL26、VuGATL27、VuGATL30、VuGATL31聚為一類；GATL基因成員的CDS進(jìn)化樹如圖3所示，VuGATL7、VuGATL14、VuGATL18、VuGATL32聚為一類， VuGATL2、VuGATL3、VuGATL4、VuGATL5、VuGATL6、VuGATL8聚為一類。CDS序列聚類結(jié)果與RSCU熱圖聚類結(jié)果較為相似，因此，依據(jù)RSCU值聚類的結(jié)果有一定的參考價值。

2.6 豇豆GATL基因家族PR2-plot分析、ENc-plot分析以及中性繪圖分析

PR2-plot分析結(jié)果如圖4所示，各基因所在位置與2條中心線的距離差異較大，4個區(qū)域的散點不均勻分布，且多數(shù)集中在右下角區(qū)域，由此可知，密碼子第3位堿基對T的使用頻率明顯大于A，對G的使用頻率大于C。說明豇豆GATL基因家族密碼子使用偏好性同時受到自然選擇和基因突變的作用，且自然選擇的作用更大。

對豇豆GATL基因家族進(jìn)行ENc-plot分析。如圖5所示，豇豆GATL基因家族中有3個基因與標(biāo)準(zhǔn)曲線的距離較近，表明這3個基因更容易受到堿基突變的影響，而其他基因也均分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線下方，表明這些基因的密碼子受到堿基突變的影響較小，受到自然選擇的影響較大。

如圖6所示，豇豆GATL基因密碼子GC12為39.3%～50.3%，GC3為36.8%～75.6%。GC12的范圍較窄，致使基因分布在回歸線左右，大部分基因處于對角線下方。GC12與GC3的回歸系數(shù)為0.189 74，斜率較小，表明密碼子使用偏好受自然選擇的影響較大，受基因突變的影響較小。以上結(jié)果都表明影響豇豆GATL基因密碼子使用偏好的主要因素是自然選擇。

3 討論

在遺傳信息編碼過程中，某一個密碼子在編碼氨基酸過程中的使用頻率不同，這種現(xiàn)象稱為密碼子使用偏好（Codon usage bias，CUB）^[12]，密碼子使用偏好性在自然界中普遍存在，受自然選擇、基因突變和遺傳漂變共同影響^[13-15]。密碼子第1、2位堿基突變率較低，為非同義突變；而第3位堿基的突變?yōu)橥x突變，不會改變編碼的氨基酸，因此研究密碼子的第3位堿基有利于分析密碼子的使用偏好^[16]。研究密碼子的使用偏好有利于揭示生物進(jìn)化關(guān)系，提高基因的表達(dá)效率。本研究中豇豆GATL基因家族成員的ENc為39.29～55.77，平均值為51.06；CAI為0.17～0.25，平均值為0.21；CBI為-0.153～0.220，平均值為0.001；GC3為34.10～74.60，平均為48.90，結(jié)果表明豇豆GATL基因家族密碼子的使用偏好性較弱。

本研究中，豇豆GATL基因家族成員的密碼子的第3位堿基大多數(shù)以T或A結(jié)尾，并且大多數(shù)GATL基因家族成員密碼子第3位堿基堿基對T的偏好略大于對A的偏好，這與前人對茶樹^[17]、番茄^[18]等雙子葉植物基因密碼子偏好性的研究結(jié)果一致。雙子葉植物密碼子偏好以T/A結(jié)尾，而單子葉植物偏好以G/C結(jié)尾^[19]。RSCU＞1.00表明該密碼子使用度較高；RSCU=1.00表明密碼子隨機使用；而RSCU＜1.00表明該密碼子使用度較低。本研究中，有29個豇豆GATL基因密碼子RSCU＞1.00，27個豇豆GATL基因密碼子RSCU＜1.00，5個豇豆GATL基因密碼子RSCU=1.00。RSCU＞1.00的豇豆GATL基因中有18個密碼子以A或U結(jié)尾，表明豇豆GATL基因家族密碼子偏好以A/U（T）結(jié)尾。有研究結(jié)果表明，CDS聚類結(jié)果比RSCU聚類結(jié)果更接近基因的真實系統(tǒng)分類結(jié)果^[20-22]，本研究中CDS聚類結(jié)果與RSCU聚類結(jié)果相似，但CDS聚類結(jié)果更準(zhǔn)確，CDS聚類結(jié)果與RSCU聚類結(jié)果在更小的分類單元中存在差異，這與前人研究結(jié)果^[23-24]一致。RSCU聚類存在一定的局限性，可能因為在RSCU值篩選過程中，CDS序列中密碼子中低偏好信息被遺漏，因此RSCU聚類結(jié)果只能在一定的范圍內(nèi)作為分類依據(jù)^[23-24]。要將RSCU聚類結(jié)果與CDS聚類結(jié)果相結(jié)合，才能得到更為準(zhǔn)確的分類結(jié)果，反映物種真實的系統(tǒng)分類，幫助了解生物體的進(jìn)化歷史。

對豇豆GATL基因家族密碼子做相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)ENc與GC3呈極顯著負(fù)相關(guān)，表明堿基組成對VuGATL基因密碼子偏好性影響較小，GC3與CAI、CBI、Fop呈極顯著正相關(guān)，CAI、CBI和Fop兩兩之間均呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)，說明密碼子堿基組成對豇豆GATL基因的表達(dá)有較大的影響。進(jìn)一步對豇豆GATL基因家族進(jìn)行PR2-plot分析、ENc-plot分析以及中性繪圖分析。PR2-plot分析發(fā)現(xiàn)，A/T與G/C的使用頻率不同，且 A/T的使用頻率高于G/C；ENc-plot分析發(fā)現(xiàn)，豇豆GATL基因家族ENc均分布于標(biāo)準(zhǔn)曲線的下方，而且分布較集中；中性繪圖分析發(fā)現(xiàn)，GC12與GC3具有相關(guān)性，但不顯著。以上結(jié)果表明，基因突變對密碼子偏好性影響較小，密碼子偏好性更多受到自然選擇的作用。有研究結(jié)果表明辣椒PPO基因^[25]、植物FER基因^[26]、擬南芥HSP20基因^[27]密碼子使用偏好性受自然選擇影響，而蘭科植物ABI3基因^[28]、滇重樓WRKY基因^[29]、鹽角草HKT1基因^[30]等密碼子偏好性主要受到基因突變影響。

4 結(jié)論

本研究對豇豆GATL基因家族密碼子使用偏性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)大部分豇豆GATL基因家族密碼子偏好以A/T結(jié)尾。豇豆GATL基因家族的ENc為39.29～55.77，平均值為51.06，GC3為34.10%～74.60%，表明豇豆GATL基因家族密碼子使用偏好性較弱。豇豆GATL基因密碼子使用偏好受自然選擇影響較大，受基因突變影響較小。本研究結(jié)果為豇豆GATL基因家族的外源表達(dá)與功能預(yù)測提供了理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：成紓寒）