一個(gè)水稻全生育期卷葉突變體的表型分析和基因定位

摘要： 水稻卷葉突變體是研究葉片發(fā)育機(jī)制和培育理想株型品種的重要資源。本研究以1個(gè)可穩(wěn)定遺傳的卷葉突變體（暫命名為rl-z）為試驗(yàn)對(duì)象，對(duì)其開展表型鑒定和基因定位。表型鑒定結(jié)果顯示，突變體rl-z的葉片在整個(gè)生育期均呈筒狀內(nèi)卷，與其野生型植株相比，突變體的株高、穗長(zhǎng)、分蘗數(shù)、千粒重均顯著下降。遺傳分析結(jié)果表明，rl-z的突變表型受1對(duì)隱性核基因控制。利用突變體rl-z與秈稻品種揚(yáng)稻6號(hào)雜交構(gòu)建的F₂群體進(jìn)行基因定位，將卷葉基因定位于第9染色體的InDel標(biāo)記JY11至JY14之間，兩標(biāo)記之間物理距離為38.5 kb，此區(qū)間內(nèi)僅有1個(gè)預(yù)測(cè)基因（RL9，LOC_Os09g23200），該基因編碼GARP轉(zhuǎn)錄因子。對(duì)RL9進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明該基因在第1個(gè)外顯子103 086～103 121處缺失36個(gè)堿基，同時(shí)在103 524處存在1個(gè)單堿基突變?；蚨ㄎ唤Y(jié)果說明突變體rl-z的卷葉特性可能是由于RL9基因突變導(dǎo)致GARP轉(zhuǎn)錄因子功能異常引起的。

關(guān)鍵詞： 水稻；卷葉突變；遺傳分析；基因定位；RL9基因

中圖分類號(hào)： S511 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1000-4440（2024）11-1985-07

Phenotypic analysis and gene localization of a rolled-leaf mutant in rice during the whole growth period

YU Bo， LIN Tianzi， JING Dedao， SUN Liting， ZENG Shengyuan， LI Chuang， QIAN Huafei， DU Cancan， HU Qingfeng， ZHOU Yiwen， YANG Jun， WU Zhangping， GONG Hongbing

（Zhenjiang Institute of Agricultural Sciences of the Ning-Zhen Hilly District， Jurong 212400， China）

Abstract： Rice rolled-leaf mutants are important resources for studying the mechanisms of leaf development and breeding desirable plant varieties. In this study， a rolled-leaf mutant （named rl-z） with stable inheritance was used as material to conduct phenotypic analysis and gene mapping. Phenotypic identification results showed that the leaves of rl-z mutants were inner rolled， forming a tube-like structure throughout the whole growth period. Compared with wild type rice， the plant height， panicle length， number of tillers， and thousand-grain weight of mutant were significantly decreased. Genetic analysis displayed that the mutant phenotype of rl-z was controlled by a pair of recessive genic genes. Gene mapping was performed by using the F₂ population produced by crossing rl-z mutant with an indica rice variety Yangdao 6. The rolled-leaf gene was mapped between the InDel markers JY11 and JY14 on chromosome 9， and the physical distance between the two markers was 38.5 kb. There was only one predicted gene （RL9， LOC_Os09g23200） within the region， and this gene encoded a GARP transcription factor. Sequencing results showed that the first exon of RL9 was found to exist a 36 bp deletion （nucleotide position 103 086-103 121） and a single-base mutation （nucleotide position 103 524）. Results of gene mapping suggested that the rolled leaf characteristic of rl-z mutant was likely to be caused by the abnormal function of GARP transcription factor owing to the mutation of RL9.

Key words： Oryza sativa;rolled leaf mutant;genetic analysis;gene mapping;RL9 gene

葉片是水稻進(jìn)行蒸騰作用、光合作用及呼吸作用的重要器官，直接影響同化產(chǎn)物的形成和運(yùn)輸，決定著水稻的最終產(chǎn)量^[1]。因此，水稻葉片性狀始終是育種家、遺傳學(xué)家關(guān)注的焦點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)葉片并非越大越好，只有大小適度才能保證水稻單株乃至整個(gè)群體的光能利用效率^[2]。卷葉是葉片向近軸面或遠(yuǎn)軸面卷曲的一種特殊表型。水稻葉片適度卷曲能夠減少葉片間的相互遮蔽，提高透光性，進(jìn)而改善群體中下層的受光條件，提高水稻的產(chǎn)量及品質(zhì)^[3]。

水稻種質(zhì)資源豐富，卷葉的性狀也復(fù)雜多樣。根據(jù)葉片卷曲的方向可分為內(nèi)卷、外卷和扭曲3種類型；根據(jù)卷曲的程度可分為高度卷曲（筒狀）、中度卷曲和輕微卷曲3種類型；根據(jù)卷曲的位置可分為整株卷曲和部分卷曲2種不同類型；根據(jù)卷曲發(fā)生的時(shí)期可分為全生育期卷曲、苗期卷曲、生育中期卷曲、動(dòng)態(tài)卷曲等多種不同類型^[4]。研究發(fā)現(xiàn)，造成水稻葉片卷曲的原因主要包括5個(gè)方面：（1）泡狀細(xì)胞大小及數(shù)量的改變，參與調(diào)控的基因多達(dá)幾十個(gè)，如sll2^[5]、OsRRK1^[6]、Roc5^[7]、NAL7^[8]、OsZHD1^[9]等。（2）近軸面或遠(yuǎn)軸面發(fā)育異常，目前已被挖掘的基因有adl1^[10]、SLL1^[11]、OsAGO7^[12]。（3）厚壁組織發(fā)育異常，參與調(diào)控的基因有RL14^[13]、NRL2^[14]。（4）角質(zhì)層結(jié)構(gòu)的變化，相關(guān)調(diào)控基因有CFL1^[15]和OsMYB103L^[16]等。（5）多種細(xì)胞或組織同時(shí)發(fā)生改變，這主要是由一些調(diào)控因子（如miRNA）和激素相關(guān)基因決定^[17]。

卷葉性狀已在水稻育種中得到一定的應(yīng)用，培育出了部分葉型較為理想的品種，如國(guó)際水稻研究所的IR8，韓國(guó)育成的密陽22和密陽23，江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所培育的兩優(yōu)培九和培兩優(yōu)E32等，這些品種都具有豐產(chǎn)特性，在生產(chǎn)上得到了大面積的推廣種植^[18]。目前，水稻葉片卷曲的相關(guān)研究也取得了一定的進(jìn)展，但由于卷葉突變往往伴有不利性狀，在傳統(tǒng)育種應(yīng)用中面臨著一定的挑戰(zhàn)。隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，挖掘更多卷葉種質(zhì)資源并深入研究其遺傳基礎(chǔ)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。前期，本研究團(tuán)隊(duì)在水稻群體中發(fā)現(xiàn)了1份葉片高度卷曲的自然突變體rl-z。通過對(duì)該突變體進(jìn)行表型鑒定、遺傳分析、基因定位等，為進(jìn)一步闡明水稻卷葉的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

粳型卷葉突變體來自于水稻自選品系L318的自然變異，該突變體表現(xiàn)為葉片深綠，向內(nèi)卷曲成筒狀。經(jīng)多年連續(xù)自交種植，卷葉性狀穩(wěn)定，不受環(huán)境影響，暫定名為rl-z （rolled leaf-z）。供試材料包括粳型卷葉突變體rl-z、野生型L318及秈稻品種揚(yáng)稻6號(hào)。

1.2 表型鑒定

2019年在江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所試驗(yàn)基地種植所有材料，采用單本栽插方式，株行距為18 cm×25 cm，田間栽培管理采用常規(guī)方式。在水稻苗期和拔節(jié)期隨機(jī)選取長(zhǎng)勢(shì)相近的突變體rl-z和野生型各10株，測(cè)定每株的劍葉葉片卷曲度（leaf rolling index，LRI）。計(jì)算公式為L(zhǎng)RI=[（L_w-L_n）/L_w]×100%，其中L_w為葉片完全展開時(shí)最寬處的寬度（cm），L_n為葉片最寬處在自然卷曲后的寬度（cm）^[19]。在水稻成熟期測(cè)定株高、有效分蘗數(shù)、穗長(zhǎng)、千粒重、結(jié)實(shí)率等主要農(nóng)藝性狀。

1.3 遺傳分析

用卷葉突變體rl-z和野生型L318進(jìn)行正反交，2019年冬季在海南省陵水縣加代獲得F₂，第2年正季在江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所試驗(yàn)基地種植，分蘗期統(tǒng)計(jì)F₂群體中葉片正常（野生型）與葉片卷曲（突變型）的植株數(shù)量，計(jì)算分離比，并進(jìn)行χ²測(cè)驗(yàn)。

1.4 基因定位

以秈稻品種揚(yáng)稻6號(hào)為父本與卷葉突變體rl-z進(jìn)行雜交，構(gòu)建F₂定位群體。采用CTAB法進(jìn)行水稻基因組DNA的提取^[20]，等量混合突變型和野生型單株的總DNA，分別構(gòu)建突變體池和野生型池。選取本實(shí)驗(yàn)室保存的均勻分布于水稻12條染色體上的SSR標(biāo)記和InDel（Insertion-deletion）標(biāo)記，對(duì)突變體rl-z、秈稻品種揚(yáng)稻6號(hào)的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選多態(tài)性標(biāo)記。獲得的多態(tài)性標(biāo)記用于擴(kuò)增野生型池、突變體池的DNA模板，并進(jìn)行連鎖分析。獲得的潛在連鎖標(biāo)記用于初定位，以F₂群體中30株突變型單株的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在連鎖區(qū)段內(nèi)查找并進(jìn)一步設(shè)計(jì)有多態(tài)性的引物7對(duì)（表1），擴(kuò)大定位群體，以F₂群體中所有突變型單株的DNA為模板，PCR擴(kuò)增后進(jìn)行基因型分析，確定卷葉基因在染色體上的位置。PCR擴(kuò)增采用2×T5 Super PCR Mix試劑（購自北京擎科生物科技股份有限公司），擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94℃變性35 s，55～60 ℃（依不同引物而定）退火35 s，72 ℃復(fù)性35 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 候選基因的預(yù)測(cè)與分析

將卷葉突變基因定位于38.5 kb區(qū)間后，通過Ensemble plants（http：//plants.ensembl. org/index.html）和NCBI（https：//www.ncbi.nlm. nih.gov）數(shù)據(jù)庫查詢區(qū)間內(nèi)所有基因。以LOC_Os09g23200基因序列為參考，利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)基因擴(kuò)增引物。使用TaKaRa LA Taq^? with GC Buffer試劑盒（TaKaRa公司產(chǎn)品）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性35 s， 60 ℃退火35 s，72 ℃復(fù)性1 min，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)序列比對(duì)后，確定突變位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體rl-z的表型特征及農(nóng)藝性狀

與野生型L318相比，突變體rl-z表現(xiàn)為全生育期整株葉片都卷曲，葉片沿主脈縱向內(nèi)卷，在拔節(jié)期葉片呈現(xiàn)圓筒狀，后期新生葉片無法完全從前1張葉片中抽出，其葉片還表現(xiàn)出顏色更深（圖1A、圖1B）、主脈更粗（圖1C、圖1D）的特性。成熟期突變體rl-z稻穗無法散開，成熟時(shí)穗型同稻穗未抽出時(shí)的表型類似（圖1E）。

從表1可知，突變體rl-z在苗期表現(xiàn)出明顯的卷葉特征，卷曲度達(dá)到34.81%；隨著植株生長(zhǎng)發(fā)育，葉片卷曲度逐漸增加，在拔節(jié)期達(dá)到基本穩(wěn)定，卷曲度高達(dá)62.56%。野生型L318在整個(gè)生育期葉片始終呈現(xiàn)平展?fàn)睿砬戎蹬c突變體rl-z的差異達(dá)極顯著水平。突變體rl-z植株的主要農(nóng)藝性狀如株高、穗長(zhǎng)、分蘗數(shù)、千粒重與野生型L318均存在顯著差異。突變體rl-z平均株高為70.11 cm，野生型L318植株平均株高為105.23 cm；突變體rl-z穗長(zhǎng)為10.80 cm，較野生型短8.20 cm；突變體rl-z平均分蘗數(shù)為8.05個(gè)，顯著低于野生型的11.37個(gè)；卷葉突變導(dǎo)致結(jié)實(shí)率降低，種子干癟瘦小，千粒重下降至13.11 g，遠(yuǎn)低于野生型的25.09 g。

2.2 突變體rl-z的遺傳分析

突變體rl-z與野生型L318的正反交試驗(yàn)結(jié)果表明，無論突變體rl-z作父本還是作母本，得到的F₁代植株葉片均表現(xiàn)為正常平展，其自交后代F₂群體則出現(xiàn)明顯分離，且葉片正常平展植株數(shù)和卷葉植株數(shù)比值符合3∶1（表2），表明其卷葉突變性狀是由單隱性核基因控制的。

2.3 基因定位及候選基因的序列分析

利用均勻覆蓋水稻12條染色體上的500對(duì)分子標(biāo)記分析卷葉突變體rl-z、秈稻品種揚(yáng)稻6號(hào)的多態(tài)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有63對(duì)分子標(biāo)記在兩親本間存在多態(tài)性。利用這63對(duì)分子標(biāo)記對(duì)F₂群體中的突變體池和野生型池進(jìn)行基因型分析，將目的基因初步定位于第9染色體上的分子標(biāo)記RM7038至RM460之間（圖2A），并通過30株卷葉單株對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

為進(jìn)一步縮小定位區(qū)間，在RM7038至RM460之間開發(fā)出了7對(duì)在親本間有多態(tài)性的引物，分別是JY01-F/JY01-R、JY03-F/JY03-R、JY04-F/JY04-R、JY09-F/JY09-R、JY11-F/JY11-R、JY14-F/JY14-R、JY15-F/JY15-R，利用這7對(duì)引物分析F₂群體中512株卷葉單株的基因型，其中JY11、JY14、JY15引物分別檢測(cè)到的交換數(shù)較少，分別為1株、1株、2株。通過以上分析結(jié)果，最終將卷葉基因定位于JY11引物標(biāo)記與JY14引物標(biāo)記之間，兩引物標(biāo)記之間的物理距離為38.5 kb（圖2B）。

在這38.5 kb的定位區(qū)間僅存在1個(gè)預(yù)測(cè)基因，為卷葉調(diào)控相關(guān)基因RL9（LOC_Os09g23200）。設(shè)計(jì)引物Curl-1-F/Curl-1-R～Curl-5-F/Curl-5-R（表3）對(duì)該基因的基因組進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明該基因的第1個(gè)外顯子上存在2處突變，第1處為103 086～103 121處的36 bp堿基缺失（TCGACGCCGGCGGCGGCGCGTCGGCGCCGCCGCCGC），第2處為103 524處發(fā)生的單堿基突變，即C突變?yōu)門（圖2C、圖2D），該基因是RL9的1個(gè)新的等位基因，RL9基因的等位突變可能是導(dǎo)致突變體rl-z卷葉形成的主要原因。

3 討論

卷葉是異型葉的一種，水稻葉片的卷曲度決定著種質(zhì)資源在生產(chǎn)上的應(yīng)用價(jià)值。卷曲度適中的植株在高密度種植條件下能夠提高群體干物質(zhì)的積累，有助于實(shí)現(xiàn)水稻的超高產(chǎn)，具有重要的應(yīng)用價(jià)值^[21]。但是，目前已報(bào)道的水稻卷葉突變體多數(shù)葉片卷曲過度，影響水稻分蘗數(shù)、株高、育性等農(nóng)藝性狀，限制了其在生產(chǎn)上的利用價(jià)值^[22]。本研究中發(fā)現(xiàn)的卷葉突變體rl-z為全生育期筒狀卷曲，這嚴(yán)重影響了植株對(duì)光能的利用，導(dǎo)致突變體株高、穗長(zhǎng)、分蘗數(shù)、千粒重、結(jié)實(shí)率均顯著低于野生型。同時(shí)由于葉片卷曲過度新葉無法完全從上一張葉片中抽出，導(dǎo)致株型松散，該性狀并沒有起到降低植株葉片披垂度、提高株型緊湊度的作用。但挖掘更多不同的卷葉種質(zhì)資源有助于我們更深入地了解葉片卷曲的特性，并最終充分利用該性狀。

前人研究發(fā)現(xiàn)，水稻卷葉性狀遺傳方式復(fù)雜多樣，目前已鑒定出多個(gè)隱性單基因如psl1^[23]、roc5^[7]、NAL7^[8]、sol1^[24]、sll2^[5]、rl9_（t）^[25]等；鑒定出的不完全隱性基因有rl_（t）^[26]、rl8^[27]；顯性基因有rel1^[28]、CFL1^[15]、z2^[29]、OsAGO7^[12]、ACL1^[30]、Roc8^[31]、rl12_（t）^[32]等。此外，一些卷葉突變存在著多對(duì)基因的互作^[7，33]。本研究通過對(duì)F₂群體進(jìn)行表型鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)平展葉植株和卷葉突變植株符合3∶1的分離比，說明獲得的卷葉突變體是由隱性單基因控制。

經(jīng)基因定位分析，將突變體rl-z的卷葉基因定位于第9染色體上分子標(biāo)記JY11至JY14之間，兩標(biāo)記的物理距離為38.5 kb。通過區(qū)間內(nèi)基因的預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該區(qū)間內(nèi)存在1個(gè)已報(bào)道的卷葉基因RL9 （ROLLED LEAF 9）。據(jù)報(bào)道，該基因主要通過調(diào)控葉肉細(xì)胞的程序性死亡來控制葉片形態(tài)，當(dāng)RL9基因發(fā)生突變，葉肉細(xì)胞的程序性死亡功能紊亂，葉片上細(xì)胞的數(shù)量、大小發(fā)生變化，進(jìn)而引起葉片高度卷曲^[11，34]。本研究中突變體rl-z葉片表現(xiàn)為筒狀卷曲，表型與目前報(bào)道的RL9突變表型相類似。

目前已報(bào)道的RL9基因突變主要集中在第1外顯子和第1、第3內(nèi)含子的剪切位點(diǎn)處，包括第1外顯子上C_{103 507}→A_{103 507}、G_{103 641}→A_{103 641}的點(diǎn)突變，（CCG）_{103 600-103 602}3個(gè)堿基的缺失，（GTCGG）_{103 508-102 512}和（TCGCC）_{103 274-103 278}5個(gè)堿基的缺失；第1內(nèi)含子A_{103 740}→G_{103 740}的點(diǎn)突變；第3內(nèi)含子G_{104 454}→A_{104 454}的點(diǎn)突變，這幾種突變導(dǎo)致了GARP蛋白空間結(jié)構(gòu)形態(tài)的改變，最終影響其功能^{[11，34-37]}。本研究對(duì)突變體rl-z的RL9基因進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)，在基因第1個(gè)外顯子的103 086～103 121處存在36 bp的缺失堿基，同時(shí)在103 524處存在C突變?yōu)門的單堿基突變，這2處突變與以往報(bào)道的RL9基因突變不同，是1種新的等位變異。卷葉突變體rl-z中RL9基因的變異可能導(dǎo)致GARP轉(zhuǎn)錄因子功能的異常，從而引起葉片變?yōu)榫砬奶匦浴?/p>

4 結(jié)論

本研究的卷葉突變體rl-z來源于自然突變，該突變體的葉片表現(xiàn)為全生育期整株筒狀內(nèi)卷以及葉脈變粗、顏色加深等性狀。此外，該卷葉突變體可引起株高變矮、穗長(zhǎng)變短、分蘗數(shù)減少、千粒重降低等性狀變化。遺傳分析結(jié)果表明卷葉突變體rl-z受1對(duì)隱性單基因控制，并將該基因定位于第9染色體上分子標(biāo)記JY11至JY14之間，二者之間物理距離為38.5 kb。通過基因預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該區(qū)間內(nèi)存在1個(gè)已報(bào)道的卷葉基因RL9。將RL9基因進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)在第1個(gè)外顯子103 086～103 121處的缺失及103 524處的點(diǎn)突變可能是導(dǎo)致突變體rl-z植株葉片卷曲的主要原因。突變體rl-z是1個(gè)新型的內(nèi)卷葉突變體，雖然不能直接應(yīng)用于水稻育種，但可為水稻卷葉研究提供1種新的基因資源。

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（責(zé)任編輯：黃克玲）