纖維素降解菌的分離篩選及其秸稈降解能力研究

摘要：通過篩選高效的秸稈纖維素降解菌，為進(jìn)一步資源化利用農(nóng)作物秸稈提供優(yōu)質(zhì)的微生物資源。采集奶牛糞樣品，通過纖維素平板剛果紅染色法初篩及發(fā)酵液纖維素酶和木聚糖酶活性測定法復(fù)篩菌種，探究選出菌株對秸稈的降解能力。結(jié)果表明，篩選獲得9株產(chǎn)纖維素酶的菌株，其中菌株TX1的透明圈與菌落直徑比值最大，為1.729。菌株TX7的纖維素酶活力和木聚糖酶活力最強，CMC-Na酶（CX）活力為0.224 7 U/mL，濾紙酶（FPA）活力為0.296 0 U/mL，木聚糖酶活力為8.84 U/mL。菌株TX3對小麥秸稈半纖維素和纖維素的降解能力最強，每1.000 g小麥秸稈的纖維素、半纖維素質(zhì)量分別為0.185、0.190 g；菌株TX7對小麥秸稈木質(zhì)素的降解能力最強，每1.000 g小麥秸稈的木質(zhì)素質(zhì)量只有0.037 g。由此可見，菌株TX3、TX7具有進(jìn)一步研發(fā)成高效降解秸稈微生物菌劑的潛力，為秸稈纖維素的轉(zhuǎn)化利用提供了優(yōu)質(zhì)的菌種資源。

關(guān)鍵詞：纖維素降解菌；秸稈；篩選；降解能力；奶牛糞

中圖分類號：X172 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2097-2172（2024）11-1055-05

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2024.11.014

Isolation and Screening of Cellulose Degrading Bacteria and

Their Straw Degradation Capacity

TANG Ying， ZHAO Xu， LI Juan， WANG Zining

（Institute of Soil， fertilizer and Water-saving Agriculture， Gansu Academy of Agricultural Sciences，

Lanzhou Gansu 730070，China）

Abstract： In order to screen for efficient cellulose degrading bacteria for straw， so as to provide hwzp8WnDuzkY6Iz/8yKs9vQ==igh-quality microbial resources for the further resource utilization of crop straw， dairy cow dung samples were collected， and the strains were initially screened by cellulose plate Congo red staining and rescreened by cellulase and xylanase activity measurement in fermentation broth to explore the degradation capacity of the selected strains on straw. Results showed that 9 strains of cellulase-producing bacteria were obtained， among which strain TX1 exhibited the largest hyaline circle to colony diameter ratio of 1.729. Strain TX7 had the strongest cellulase and xylanase activity， with a CMC-Na enzyme（CX） activity of 0.224 7 U/mL， a filter paper enzyme（FPA） activity of 0.296 0 U/mL， and a xylanase activity of 8.84 U/mL. Strain TX3 showed the strongest degradation capacity for hemicellulose and cellulose in wheat straw， with cellulose and hemicellulose masses of 0.185 g and 0.190 g， respectively， per 1.000 g of wheat straw. Strain TX7 exhibited the strongest degradation capacity for lignin in wheat straw， with a lignin mass of only 0.037 g per 1.000 g of wheat straw. Thus， strains TX3 and TX7 have the potential for further development into efficient strawdegrading microbial agents， providing high-quality microbial resources for the conversion and utilization of straw cellulose.

Key words： Cellulose degrading bacteria; Straw; Screening; Degradation capacity; Dairy cow dung

纖維素、半纖維素、木質(zhì)素是農(nóng)作物秸稈的主要成分，占農(nóng)作物總干重的90%以上［1 ］。2022年我國農(nóng)作物秸稈總量達(dá)到8.56×108 t，其中7.22×108 t被資源化利用，秸稈的資源化利用率達(dá)到87.6%［2 ］。目前我國主要將秸稈用于生產(chǎn)肥料、飼料及燃料，分別占秸稈利用量的54%、23%和14%，其中將秸稈肥料化利用是主要的秸稈資源化利用模式［3 - 4 ］。然而秸稈還田腐解的過程中，秸稈會與農(nóng)作物競爭吸收土壤中的水分、氮素等營養(yǎng)元素，影響農(nóng)作物的生長，造成減產(chǎn)［5 ］。但秸稈快速降解還田可以有效增加土壤有機質(zhì)，改善土壤理化性狀，提高土壤肥力，促進(jìn)作物生長，增加作物產(chǎn)量［6 - 7 ］。利用微生物提高秸稈降解速度是目前常用的一種降解秸稈方法，對秸稈還田技術(shù)的快速應(yīng)用具有重要意義。趙方圓等［8 ］從牛羊糞堆肥中分離篩選出1株具有纖維素降解能力的菌種 Aspergillus sp. YN1，該菌在30 ℃條件下?lián)u瓶發(fā)酵72 h后的濾紙酶活性高達(dá)1 500 U/mL。周澤等［9 ］從羊糞中分離篩選7株具有纖維素降解能力的菌種，將其接種到小麥秸稈中30 d，可將19.36%的秸稈降解。王文凡等［10 ］從牛糞堆肥中分離篩選出1株具有纖維素降解能力的細(xì)菌，其對秸稈有較強的降解能力，接種秸稈并發(fā)酵7 d，可降解19.35%的秸稈。我們利用纖維素剛果紅平板從新鮮奶牛糞中分離純化篩選具有纖維素降解能力的菌種，通過比較菌種發(fā)酵液的纖維素酶活力和木聚糖酶活力以及菌種對小麥秸稈纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的降解能力，篩選確定降解秸稈的適宜微生物菌種，以期為進(jìn)一步資源化利用農(nóng)作物秸稈提供優(yōu)質(zhì)的微生物資源。

1 材料與方法

1.1 供試培養(yǎng)基

供試牛肉膏培養(yǎng)基：牛肉膏 3.0 g、蛋白胨 10.0 g、NaCl 5.0 g、瓊脂 15.0 g，水 1 000 mL，pH 7.2～7.4。

纖維素培養(yǎng)基：蔗糖20.0 g、K2HPO4 1.0 g、FeSO4 0.1 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、NaMoO4 0.005 g、CaCO3 2.0 g、瓊脂15.0 g、羧甲基纖維素2.0 g， 1 000 mL蒸餾水，pH 7.5±0.2。

小麥秸稈無機鹽培養(yǎng)基：K2HPO4·3H2O 13.3 g、KH2PO4 4.0 g、 MgSO4·7H2O 0.2 g、（NH4）2SO4 0.5 g、瓊脂15.0 g，蔗糖 20.0 g，小麥秸稈粉（過120目篩） 4.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

1.2 樣品的采集

金昌市金川區(qū)某奶牛養(yǎng)殖場采集奶牛糞鮮樣5份，依次編為1#、2#、3#、4#、5#。

1.3 纖維素菌的分離純化

1.3.1 分離 采用梯度稀釋涂平板法，即稱取奶牛糞鮮樣品10 g，放入滅菌三角瓶中，加無菌水90 mL，180 r/min搖床振蕩1 h后吸上層稀釋液，再用無菌水做10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度稀釋，分別吸取100 uL 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的奶牛糞上層稀釋液涂布于牛肉膏培養(yǎng)基和纖維素培養(yǎng)基平板，30 ℃培養(yǎng)48 h［11 ］。

1.3.2 純化 待平板上長出菌落后將不同平板培養(yǎng)基上的單個菌落挑取到纖維素培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)48 h，待菌落長好后，連續(xù)將單個菌落在纖維素平板培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)3次，直到無雜菌為止［11 ］。

1.4 纖維素菌的初步篩選

挑取單菌落于纖維素酶篩選平板上，30 ℃培養(yǎng)48 h后用0.1%剛果紅溶液染色1 h，去掉染液，然后用1 mol/L NaCl溶液浸泡，隨后觀察是否有透明圈產(chǎn)生。并根據(jù)有無透明圈及透明圈與菌株菌落比例的大小來篩選菌株［12 ］。

1.4.1 纖維素酶活力單位 酶活力單位（U）的定義為在一定條件下每分鐘產(chǎn)生1 μg 還原糖（以葡萄糖計）為1個活力單位，以每毫升發(fā)酵液所含酶活力單位表示即U/mL。

1.4.2 纖維素酶CMC-Na酶（CX）活力單位的測定 將發(fā)酵液在4 ℃、8 000 r/min條件下離心15 min，取上清液，然后取4支洗凈烘干的20.0 mL具塞刻度試管，編號（1、2、3、4）后各加入1.0 mL 5％CMC-Na，并向1號試管中加入 1.5 mL DNS溶液以鈍化酶活性，作為空白對照，比色時調(diào)零用。將4支試管同時在40 ℃水浴中預(yù)熱5～10 min，再各加入1.0 mL粗酶液，40 ℃水浴中保溫30 min后取出，立即向2、3、4 號試管中各加入1.5 mL DNS溶液以終止酶反應(yīng)，充分搖勻后沸水浴5 min，取出冷卻后用蒸餾水定容至20.0 mL，充分混勻。以 1 號試管溶液為空白對照調(diào)零點，在540 nm波長下分別測定 2、3、4 號試管液的OD值（吸光度）并記錄結(jié)果［13 ］。

1.4.3 纖維素酶濾紙酶（FPA）活力單位的測定

1 mL酶液于50 ℃ 、pH 4.8條件下，每分鐘水解 1 cm×6 cm的濾紙（FPA）產(chǎn)生1 μg還原糖（以葡萄糖計）的酶量定義為1個FPA酶活力單位［14 ］。

取4支15.0 mL刻度的試管，各加0. 2 mL酶液，再加pH 4.8醋酸緩沖液1.8 mL。其中3支作為測定管，各加1條規(guī)格為1 cm×6 cm濾紙條，充分浸泡置（50±0.5）℃恒溫水浴 30 min；另1支作為空白管同時置（50±0.5）℃恒溫水浴 30 min，然后各試管均分別加入 DNS顯色2.0 mL，同時在空白管加1條規(guī)格為1 cm×6 cm濾紙條。各試管均放沸水浴鍋反應(yīng)5 min，冷卻后定容至15.0 mL，以空白管調(diào)零點，在540 nm吸收峰下用分光光度計測OD值（吸光度）。

1.4.4 木聚糖酶活力測定 用 0.2 mol/L、 pH 4.8 的醋酸緩沖液配制1%的木聚糖溶液，加入 1.0 mL適當(dāng)稀釋的酶液，于50 ℃反應(yīng) 30 min后，加入2.0 mL DNS試劑終止反應(yīng)，沸水浴中煮沸 5 min，冷水冷卻后稀釋至15.0 mL，于540 nm 比色。

酶活力的計算應(yīng)扣除發(fā)酵液和底物所含的糖，以木糖作標(biāo)準(zhǔn)溶液，以每分鐘生成1 μg 木糖作為1個酶活單位［15 ］。

1.5 菌株對秸稈纖維素木質(zhì)素的降解

準(zhǔn)確稱量風(fēng)干小麥秸稈樣品1.000 g置于燒杯中，然后將初篩選出的菌種接種到加液體的無機鹽培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min搖瓶培養(yǎng)120 h，過濾取出后加入燒杯，參照王麗華等［16 ］的方法檢測秸稈纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的含量。

1.6 統(tǒng)計分析方法

利用SPSS 25.0軟件進(jìn)行實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，利用Microsoft Excel 2010作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素分解菌的分離純化

通過纖維素平板分離、純化共得到15株纖維素分解菌，菌落編號及形態(tài)描述如表1所示，分離純化出的15株菌的菌落形狀均為圓形，其中TX4的菌落最大，直徑為4.0 mm；TX2的菌落最小，直徑只有1.2 mm。菌落顏色有紅褐色、白色、灰綠色、黑褐色、灰色、乳白色、黃色等7種。菌落均不透明并有光澤。邊緣形狀有波狀、缺刻、整齊等3種。

2.2 纖維素降解菌株的初篩

將分離純化獲得的15株菌接種到剛果紅平板上后，9株菌有透明圈，分別為TX1、TX2、TX3、TX4、TX5、TX6、TX7、TX13、TX14，其中TX1、TX3、TX7、TX14菌株剛果紅透明圈見圖1。透明圈與菌落直徑比值的大小如圖2所示。菌株TX1的透明圈與菌落直徑比值最大，為1.729；菌株TX14的比值最小，為0.300。透明圈與菌落直徑比值的由大到小依次為TX1、TX3、TX13、TX2、TX6、TX7、TX4、TX5、TX14。因此可以判定，菌株TX1、TX3、TX13的纖維素降解能力最強，菌株TX14的纖維素降解能力最弱。

2.3 菌株纖維素酶活力比較

從圖3可以看出，不同菌株纖維素酶以菌株TX7的纖維素酶活力最強，其CMC-Na酶（CX）活力、濾紙酶（FPA）活力均最強，分別為0.224 7、0.296 0 U/mL；菌株TX14的CMC-Na酶（CX）活力最弱，為0.0160 U/mL；菌株TX13的濾紙酶（FPA）活力最弱，為0.044 0 U/mL。CMC-Na酶（CX）活力由大到小依次為TX7、TX1、TX3、TX6、TX2、TX13、TX5、TX4、TX14；濾紙酶（FPA）活力由大到小依次為TX7、TX1、TX3、TX2、TX14、TX4、TX6、TX5、TX13；由此可知，菌株TX7、TX1、TX3的纖維素酶活力最強。

2.4 菌株木聚糖酶活力比較

菌株木聚糖酶活力大小如圖4所示，其中以菌株TX7的木聚糖酶活力最強，為8.84 U/mL；菌株TX13的木聚糖酶活力最弱，為1.56 U/mL。各菌株木聚糖酶活力由大到小依次為TX7、TX1、TX3、TX14、TX2、TX6、TX4、TX5、TX13。由此可知，菌株TX7、TX1、TX3的木聚糖降解能力最強，菌株TX4、TX5、TX13的木聚糖降解能力最弱。

2.5 菌株對小麥秸稈纖維素、 木質(zhì)素降解能力的比較

菌株對降解小麥秸稈主要成分纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的能力如圖5所示。小麥秸稈的半纖維素、纖維素、木質(zhì)素含量越高，表明菌株對小麥秸稈半纖維素、纖維素、木質(zhì)素的降解能力越弱，反之則越強。菌株TX7對小麥秸稈木質(zhì)素的降解能力最強，每1.000 g小麥秸稈的木質(zhì)素質(zhì)量最低，只有0.037 g。TX3對小麥秸稈半纖維素和纖維素的降解能力最強，每1.000 g小麥秸稈的纖維素和半纖維素質(zhì)量最低，分別為0.185、0.190 g。菌株降解纖維素能力由大到小依次為TX3、TX1、TX7、TX14、TX2、TX13、TX6、TX4、TX5；降解半纖維素能力由大到小依次為TX3、TX1、TX7、TX2、TX13、TX5、TX6、TX4、TX14；降解木質(zhì)素能力由大到小依次為TX7、TX1、TX3、TX4、TX13、TX14、TX6、TX2、TX5；由此可知，菌株TX3、TX1、TX7對秸稈纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的降解能力最強，確定為進(jìn)一步研究的菌株。

3 討論與結(jié)論

利用微生物降解纖維素具有成本低，適應(yīng)性廣等優(yōu)點，可有效降解農(nóng)作物秸稈中的纖維素，將其轉(zhuǎn)化為易分解的小分子有機物，篩選高效降解農(nóng)作物秸稈纖維素的微生物，提高秸稈的利用率是農(nóng)業(yè)降本增效的重要技術(shù)之一［17 ］。農(nóng)作物秸稈中，半纖維素和木質(zhì)素將纖維素包裹在內(nèi)部［18 ］，降解秸稈的過程中，先要將半纖維素和木質(zhì)素降解，纖維素降解酶才能與纖維素接觸并將其降 解［19 ］。微生物通過分泌纖維素酶（cellulase）、木聚糖酶（xylanase，Xyl）等多種酶聯(lián)合作用對秸稈纖維素和木質(zhì)素進(jìn)行降解［20 ］。具有纖維素降解功能的細(xì)菌相比于真菌具有繁殖快、抗逆性強、耐酸堿、酶活性高的優(yōu)點，細(xì)菌分泌的有機酸類物質(zhì)對降解木質(zhì)纖維素有重要作用，近年來已成為纖維素降解微生物研究領(lǐng)域的熱點［21 - 22 ］。本研究從采集的奶牛糞樣品中篩選獲得9株產(chǎn)纖維素酶的菌株，其中菌株TX1的透明圈與菌落直徑比值最大為1.729。菌株TX7的纖維素酶活力和木聚糖酶活力均最強，其CMC-Na酶（CX）活力為0.224 7 U/mL，濾紙酶（FPA）活力為0.296 0 U/mL，木聚糖酶活力為8.84 U/mL。菌株TX3對小麥秸稈半纖維素和纖維素的降解能力最強，每1.000 g小麥秸稈的纖維素和半纖維素質(zhì)量最低，分別為0.185、0.190 g；菌株TX7對小麥秸稈木質(zhì)素的降解能力最強，每1.000 g小麥秸稈的木質(zhì)素質(zhì)量最低，只有0.037 g。由此可見，菌株TX3、TX7具有進(jìn)一步研發(fā)成高效降解秸稈微生物菌劑的潛力，可為秸稈纖維素的轉(zhuǎn)化利用提供優(yōu)質(zhì)的菌種資源。

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