改進(jìn)QuEChERS/超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法快速檢測茶葉中百草枯和敵草快殘留

關(guān)鍵詞 QuEChERS；超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法；茶葉；百草枯；敵草快

百草枯和敵草快是廣譜性、接觸性的除草劑，由于成本較低被廣泛用于茶園中以清除雜草[1]。百草枯對(duì)人畜毒性極強(qiáng)，早期中毒可引起急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合征等嚴(yán)重病癥，多數(shù)誤食者死于呼吸衰竭[2-3]。鑒于百草枯的高毒性，我國于2016 年7 月起禁止銷售和使用該藥物，隨后，百草枯的有效替代品敵草快的市場銷量呈現(xiàn)增長趨勢[4]。敵草快是一種中等毒性的除草劑，其毒性低于百草枯，但其致毒機(jī)理與百草枯相似，并且兩者分子結(jié)構(gòu)均穩(wěn)定，難以降解，易殘留在茶葉等農(nóng)作物上，可通過食物鏈進(jìn)入人畜體內(nèi)，對(duì)人畜的健康與生命安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅[5]。因此，建立一種茶葉中百草枯和敵草快殘留量的簡單、快速和高效的檢測方法十分重要。

目前，百草枯和敵草快的檢測涉及環(huán)境基質(zhì)（如水體[6]）、生物基質(zhì)（如尿液和人血漿[7-8]等）以及食品基質(zhì)（如小麥[9]、蘋果[10]和茶葉[11]等），檢測方法包括伏安分析法[12]、分光光度法[13]、免疫熒光法[6]、氣相色譜法（GC）和氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）[14-15]、高效液相色譜法（HPLC）或高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）等[16-18]，其中， HPLC-MS/MS 因具有較好的選擇性和靈敏度，廣泛應(yīng)用于茶葉中百草枯和敵草快的分析測定。通常，復(fù)雜基質(zhì)樣品的檢測需采用適當(dāng)?shù)那疤幚砑夹g(shù)進(jìn)行富集和凈化。固相萃取是一種常用的前處理技術(shù)，可有效地去除雜質(zhì)，提高檢測的靈敏度和準(zhǔn)確度，但常規(guī)固相萃取過程繁瑣且成本較高，不適于茶葉中百草枯和敵草快的快速測定。QuEChERS 作為常用的農(nóng)殘檢測前處理手段，因具有操作簡單、快速、安全和成本低等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛采用[19-20]。

本研究基于改進(jìn)的QuEChERS 法結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜技術(shù)，建立了一種可快速、準(zhǔn)確測定茶葉中百草枯和敵草快殘留量的檢測方法，以期為植物源性的食品中除草劑殘留量的檢測提供技術(shù)補(bǔ)充。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LC-TQ 5200 超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（廣州禾信儀器股份有限公司）；AUW220 型萬分之一分析天平（德國Sartorius 公司）；TG19 型高速離心機(jī)（上海盧湘儀公司）；XH-B 型渦旋混合器（江蘇天翎公司）；Millipore 超純水處理系統(tǒng)（德國Merck 公司）；AK-030SD 超聲波清洗器（深圳鈺潔公司）。

二氯百草枯和敵草快二溴鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000 μg/mL，天津阿爾塔有限公司）；甲酸銨（色譜純，上海安譜公司）；甲醇和乙腈（質(zhì)譜純，上海安譜公司）；甲酸（色譜純，美國Aladdin 試劑公司）；C18 和N-丙基乙二胺（PSA）（40～60 μm，深圳逗點(diǎn)生物技術(shù)有限公司）。碧螺春、烏龍茶、黑茶和紅茶均購于當(dāng)?shù)爻?；茶葉陽性樣品來自國家茶葉質(zhì)量檢測監(jiān)督中心（福建）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 百草枯和敵草快混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別移取適量的1000 μg/mL 二氯百草枯和敵草快二溴鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，配制成10 μg/mL 百草枯和敵草快的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于?18 ℃下保存。

移取百草枯和敵草快混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用0.1%甲酸作為溶劑分別配制5、10、100 和1000 μg/L 的百草枯和敵草快混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4 ℃下保存。

1.2.2 樣品前處理

稱取磨碎后的茶粉樣品0.5 g 于15 mL 塑料離心管中（茶葉樣品磨碎方式參考GB/T 8303—2013[21]），加入5 mL 乙腈-0.1%甲酸（3∶7， V/V）溶液，渦旋振蕩1 min 充分混勻，超聲提取15 min，以10000 r/min 離心5 min，準(zhǔn)確移取3 mL 上清液至15 mL 塑料離心管中。向上清液中加入凈化劑（400 mg C18 和400 mgPSA），渦旋振蕩混勻1 min， 10000 r/min 離心5 min，取上清液，過0.22 μm 濾膜過濾，待測。

1.2.3 色譜條件

采用親水型HILIC 色譜柱（100 mm×2.1 mm， 1.8 μm，上海安譜科技公司）；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣體積為10 μL；流速為0.3 mL/min；流動(dòng)相A 為0.1%甲酸（含5 mmol/L 甲酸銨）， B 為乙腈；等度洗脫程序：0～4 min， 50% A/50% B。

1.2.4 質(zhì)譜條件

電噴霧電離源（ESI+）；多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）；干燥氣加熱溫度為500 ℃；噴霧電壓為5500 V；霧化氣為70 psi（1 psi=6.89 kp）；干燥氣流速為8 L/min；反吹氣流速為3 L/min；碰撞氣流速為0.4 mL/min；氣簾盤高壓為800 V；真空接口電壓為70 V；檢測器電壓為2300 V；碰撞池入口電壓為30 V；碰撞池出口電壓為1 V。

2 結(jié)果與討論

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 流動(dòng)相的選擇

流動(dòng)相對(duì)色譜分析至關(guān)重要，流動(dòng)相組成會(huì)影響分析方法的回收率、色譜峰形、離子化效率和靈敏度，選擇合適的流動(dòng)相可提高回收率、改善峰形和消除樣品基質(zhì)干擾等[24]。本研究考察了甲醇和乙腈兩種有機(jī)相與不同pH 值的水相流動(dòng)相對(duì)百草枯和敵草快的響應(yīng)和峰形的影響，比較了不同流動(dòng)相體系對(duì)待測物響應(yīng)和峰形的影響。如圖1 所示，在水相中加入甲酸，能夠促進(jìn)目標(biāo)物電離，提高待測物響應(yīng)；與甲醇相比，乙腈作為有機(jī)相時(shí)，兩種目標(biāo)物峰形更尖銳，拖尾和鼓包現(xiàn)象均有所改善。以0.1%甲酸（含5 mmol/L 甲酸銨）-乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，可有效改善峰形、提高離子化效率、提升靈敏度。因此，本研究選擇0.1%甲酸（含5 mmol/L 甲酸銨）-乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行分析。

2.2.2 色譜柱的選擇

百草枯和敵草快屬于季銨鹽化合物，為極性物質(zhì)，易溶于水。高極性物質(zhì)對(duì)反相色譜柱（C₁₈ 和T₃）固定相的親和力較低，保留效果不理想，并且峰形不佳[1]。親水型HILIC 色譜柱采用強(qiáng)極性物質(zhì)作為固定相，能夠有效改善極性物質(zhì)的保留效果和峰形，故本研究選擇親水型HILIC 色譜柱進(jìn)行分析。

2.3 提取方法的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的優(yōu)化

考察了不同提取劑對(duì)茶葉加標(biāo)樣品中百草枯和敵草快提取效果的影響，選取0.1%甲酸、純乙腈、乙腈-0.1%甲酸（3∶7、1∶1、7∶3， V/V）5 種提取劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以回收率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。如圖2 所示，百草枯和敵草快的水溶性極強(qiáng)，采用單一的有機(jī)溶劑提取溶時(shí)，目標(biāo)物的回收率低于50%；百草枯和敵草快均為堿性物質(zhì)，酸性溶液能提高其溶解性，采用0.1%甲酸提取時(shí)，兩者回收率均有所提升；在0.1%甲酸中加入適量極性溶劑乙腈，可更好地溶解基質(zhì)中的脂肪酸和氨基酸等物質(zhì)，兩種目標(biāo)物的回收率均進(jìn)一步提高。研究結(jié)果表明，采用乙腈-0.1%甲酸（3∶7， V/V）提取時(shí)，百草枯和敵草快的回收率分別可達(dá)到85.21%和78.14%。因此，本方法選擇乙腈-0.1%甲酸（3∶7， V/V）作為提取劑。

2.3.2 凈化方式的選擇

食品檢測前處理常用的凈化方式有固相萃取法和QuEChERS 法。固相萃取法過程繁瑣且成本較高，而QuEChERS 法操作簡單、高效快速、安全可靠且成本較低，在食品檢測領(lǐng)域備受關(guān)注[25]。百草枯和敵草快的pKa 都大于10，在水溶液中呈堿性，因此，本研究探究了SCX（強(qiáng)陽離子交換柱）、WCX（弱陽離子交換柱）和HLB（親水性反相吸附柱）3 種陽離子交換柱對(duì)茶葉加標(biāo)樣品中待測物的提取效果。如圖3所示，采用SCX 和HLB 凈化時(shí)，茶葉中的茶多酚、咖啡因和色素等成分無法有效去除，提取液渾濁，目標(biāo)物的回收率均低于60%；采用WCX 凈化時(shí)，茶葉提取液出現(xiàn)絮狀沉淀物，可能是采用NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 值時(shí)，在離子效應(yīng)、電解質(zhì)作用和共沉效應(yīng)等共同作用下，茶多酚、氨基酸和糖類等聚合形成絡(luò)合物而沉淀，影響了過柱效果，導(dǎo)致回收率低于20%。采用QuEChERS 法進(jìn)行凈化時(shí)，常用的凈化材料有無水MgSO₄、C₁₈ 和PSA，其中，無水MgSO₄ 可除去水分，但兩種目標(biāo)物為水溶性物質(zhì)，無水MgSO₄ 將導(dǎo)致目標(biāo)物損失。本研究選用C₁₈ 和PSA 作為凈化劑，乙腈-0.1%甲酸3∶7（V/V）作為提取溶劑，得到的提取液澄清，回收率大于80%且處理速度快，所用耗材成本低。

2.3.3 C₁₈ 和PSA用量的優(yōu)化

C₁₈ 可去除一些非極性干擾物，如油脂和固醇等；PSA 能去除極性干擾物，如有機(jī)酸、糖類和色素等。本研究采用C₁₈ 和PSA 對(duì)茶葉進(jìn)行凈化，并考察了不同C₁₈ 和PSA 用量（150、200、250、300、350、400、450、500、550 和600 mg）對(duì)百草枯和敵草快回收率的影響。如圖4 所示，當(dāng)C₁₈ 和PSA 用量為400 mg 時(shí)，百草枯和敵草快的回收率均大于80%。因此，本研究中C₁₈ 和PSA 的用量為400 mg。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

采用空白碧螺春、白茶、紅茶和烏龍茶基質(zhì)考察本方法的基質(zhì)效應(yīng)（Matrix effect， ME），分別用4 種基質(zhì)空白溶液和乙腈-0.1%甲酸（3∶7， V/V）作為溶劑配制得到系列濃度溶液。ME 的計(jì)算公式如下：

其中， A 和B 分別為茶葉基質(zhì)溶液曲線和乙腈-0.1%甲酸溶劑曲線的斜率。

通常，當(dāng)ME 為85%～120%時(shí)，表明基質(zhì)效應(yīng)影響可忽略；當(dāng)MEgt;120%或MElt;85%時(shí)，表明存在基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)或基質(zhì)效應(yīng)抑制，需采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行校準(zhǔn)。敵草快和百草枯的基質(zhì)效應(yīng)數(shù)據(jù)見表2，4 種茶葉對(duì)百草枯的基質(zhì)效應(yīng)影響較弱，而對(duì)敵草快存在基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)和抑制的影響。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中均采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量分析。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 線性關(guān)系和方法檢出限

采用碧螺春、白茶、紅茶和烏龍茶4 種茶葉空白基質(zhì)溶液分別配制百草枯和敵草快的系列濃度工作溶液，以待測化合物的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、定量離子對(duì)的色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸擬合，得到線性方程和相關(guān)系數(shù)；分別以離子對(duì)的信噪比≥3 和≥10 時(shí)的樣品濃度作為檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。4 種茶葉中的百草枯和敵草快的定量分析評(píng)價(jià)指標(biāo)見表2，兩種待測物相關(guān)系數(shù)均大于0.99，線性關(guān)系良好。

與文獻(xiàn)報(bào)道的除草劑尤其是百草枯和敵草快的分析方法相比（表3），本方法具有較好的靈敏度、較寬的線性范圍以及良好的回收率，并且操作簡單、分析速度快，為百草枯和敵草快的檢測提供了一種方法補(bǔ)充。

2.5.2 加標(biāo)回收率和精密度

選取空白碧螺春、白茶、紅茶和烏龍茶樣品，對(duì)其進(jìn)行不同濃度水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。采用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線外標(biāo)法進(jìn)行定量分析，每個(gè)加標(biāo)濃度水平平行測試6 次，加標(biāo)回收率如表4 所示，百草枯和敵草快的平均回收率分別為84.4%～128.8%和87.6%～103.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.6%～13.5%和1.2%～12.3%，說明本方法的準(zhǔn)確度和特密度良好。

2.6 實(shí)際樣品分析

采用本方法對(duì)碧螺春、白茶、紅茶和烏龍茶4 種茶葉樣品以及國家茶葉質(zhì)量檢測監(jiān)督中心（福建）提供的茶葉陽性樣品中的百草枯和敵草快的殘留量進(jìn)行檢測，在4 種茶葉樣品均未檢出百草枯和敵草快，茶葉陽性樣品中檢出百草枯和敵草快的含量分別為9.0 μg/kg 和9.5 μg/kg，樣品檢測的MRM 色譜圖如圖5所示。

3 結(jié)論

建立了一種茶葉中百草枯和敵草快殘留量的快速檢測方法， 4 種茶葉基質(zhì)中百草枯和敵草的線性關(guān)系良好， R2gt;0.99，方法檢出限分別為0.06 和0.12 μg/kg，定量限分別為0.18 和0.36 μg/kg，平均加標(biāo)回收率為84.4%～128.8%， RSD 為0.6%～13.5%。本方法簡單、快速、準(zhǔn)確，適用于茶葉樣品中百草枯和敵草快的檢測，為植物源性食品中除草劑殘留量的快速檢測分析提供了方法補(bǔ)充。