在線氧燃燒結(jié)合氫化物發(fā)生原子熒光光譜法用于有機(jī)質(zhì)中硒的測(cè)定

關(guān)鍵詞 在線樣品分解；氫化物發(fā)生原子熒光光譜法；硒；有氧燃燒

隨著人們對(duì)硒的獨(dú)特生物生理功能認(rèn)識(shí)的不斷深入[1-3]，種類繁多的各種富硒保健品日益普及。然而，硒的過量攝入可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的生物毒性，因此需要對(duì)硒含量進(jìn)行嚴(yán)格控制[4-7]。中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（WS/T 578.3—2017）規(guī)定中國健康人群硒元素最高日攝入量為400 μg。因此，開發(fā)準(zhǔn)確、靈敏的分析方法測(cè)定各類食品或生物材料等有機(jī)質(zhì)樣品中的硒含量十分重要。

目前，硒含量分析方法可分為兩大類：非原子光譜分析技術(shù)和原子光譜分析技術(shù)。前者包括分光光度法[5，8]、氣相色譜法[9]和離子色譜法[10]等，而后者包括原子吸收光譜法[6，11-12]、氫化物發(fā)生原子熒光光譜法[13-17]以及電感耦合等離子體發(fā)射光譜/質(zhì)譜法[18-20]等。在這些原子光譜分析方法中，氫化物發(fā)生原子熒光光譜法因具有高分析靈敏度和高成本效益的優(yōu)勢(shì)而被廣泛關(guān)注[13，15]，但同時(shí)其對(duì)樣品前處理的要求也最為苛刻。對(duì)于有機(jī)質(zhì)樣品，需盡可能地消化徹底，以避免殘留有機(jī)質(zhì)在蒸氣發(fā)生過程產(chǎn)生泡沫；同時(shí)，在加熱去除消化試劑氮氧化物時(shí)，需要非常小心，避免Se 以鹵化物形式揮發(fā)。此外，預(yù)還原以使Se（Ⅵ）轉(zhuǎn)變?yōu)镾e（Ⅳ），這是氫化物發(fā)生反應(yīng)的必要條件，而有時(shí)還需要加入額外的掩蔽劑以消除過渡金屬離子的干擾。總之，傳統(tǒng)的濕法消解流程復(fù)雜、冗長，并且存在不可控風(fēng)險(xiǎn)。近年來，研究者在改進(jìn)樣品前處理方法方面進(jìn)行了諸多嘗試，例如以稀酸超聲輔助提取替代全消解[21]，通過加入甲醛而非趕酸的方式快速消除硝酸或亞硝酸的干擾[22]，以及采用氧瓶燃燒樣品快速分解[23]等。

根據(jù)本研究組前期的工作[23]，硒在富氧中燃燒后僅有一種揮發(fā)性的燃燒產(chǎn)物，即高水溶性的SeO₂，可直接進(jìn)行氫化物發(fā)生反應(yīng)，省去了耗時(shí)數(shù)十分鐘的中間還原步驟和額外引入還原劑。同時(shí)，以多孔石英纖維布為包覆式燃燒載體，可將共存的非揮發(fā)性干擾元素（如Fe、Ni、Cu、Zn、Ba 和Pb）高效捕獲并分離，從而建立了一種密閉氧瓶燃燒的高效且清潔的樣品前處理新方法。

在前期工作基礎(chǔ)上，本研究將有氧燃燒由固定容積的密閉系統(tǒng)改為氣路開放系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)固體有機(jī)樣品在氧氣流中高效燃燒分解，并進(jìn)一步與氫化物發(fā)生原子熒光光譜在線聯(lián)用，建立了直接有機(jī)固體進(jìn)樣分析的硒含量檢測(cè)新裝置和新方法，顯著提升了樣品分析的通量和自動(dòng)化程度。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與裝置

自行搭建的在線樣品分解與檢測(cè)裝置見圖1。AFS-8500 氫化物發(fā)生原子熒光光譜儀（HG-AFS，北京吉天儀器有限公司），配備硒空心陰極燈（北京真空電子研究所），儀器工作參數(shù)見表1。容積約400 mL的五出口石英瓶同時(shí)作為樣品燃燒分解、蒸氣發(fā)生反應(yīng)和氣液分離的反應(yīng)容器。

1.2 試劑和樣品

1000 μg/mL 硒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（國家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心）；國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)雞肉（GBW10018）和扇貝（GBW10024）（中國地球物理與地球化學(xué)勘查研究所）；NaOH（分析純，北京化工廠）；HCl（電子純，韓國Sungkok-Dong Ansan-Kyungkido 公司）；NaBH₄（分析純，廣州西隴化工有限公司）；高純石英纖維布（QFC，武漢鑫有泰光電有限公司）。丹參藥材、硒酵母片和富硒保健品片劑樣品購自當(dāng)?shù)爻校粚?shí)驗(yàn)用水為英國ELGA 純水系統(tǒng)制備的超純水（電阻率gt;18.2 MΩ·cm）。

1.3 樣品測(cè)定程序

準(zhǔn)確稱取0.2 g（精確至0.0001 g）樣品至QFC（40 mm×40 mm）上，折疊包覆后，以鉑絲固定在與五出口石英瓶瓶塞相連的石英鉤上，并在QFC 外部滴加少量甘油（約10 mg）作為引燃劑。圖1 中所有電磁閥、蠕動(dòng)泵及HG-AFS 均通過集成電路進(jìn)行關(guān)聯(lián)通訊，全程只需要觸發(fā)“啟動(dòng)”和“檢測(cè)”兩個(gè)按鈕。首先，按壓“啟動(dòng)”按鈕，依次開啟O₂ 閥（v₁）和排氣閥（v₃），同時(shí)蠕動(dòng)泵1在30 s 內(nèi)將20 mL 10%（V/V）的HCl 泵入石英瓶中；然后，點(diǎn)燃樣品并迅速插入燃燒瓶中，直至燃燒完成（約10～20 s）；最后，按壓“檢測(cè)”按鈕，依次關(guān)閉O2 閥（v₁），并打開Ar 閥（v₂），吹掃30 s 后自動(dòng)觸發(fā)蠕動(dòng)泵2 運(yùn)行，將還原劑NaBH4 引入燃燒瓶中并關(guān)閉閥門3（v₃）及打開閥門4（v₄），此時(shí)反應(yīng)產(chǎn)生的氫化物被氬氣持續(xù)吹入HG-AFS 原子化器進(jìn)行Se 測(cè)定（耗時(shí)38 s，檢測(cè)過程中可振蕩燃燒瓶，確保燃燒產(chǎn)物沖洗完全及氫化物發(fā)生反應(yīng)充分）。檢測(cè)結(jié)束后，蠕動(dòng)泵2 自動(dòng)停止運(yùn)行，并觸發(fā)蠕動(dòng)泵3 啟動(dòng)，將反應(yīng)后的混合溶液排出（持續(xù)約10 s），并待廢液排盡后蠕動(dòng)泵3 停止運(yùn)行，同時(shí)觸發(fā)蠕動(dòng)泵1 啟動(dòng)，開始分析下一個(gè)樣品。全樣品分析流程的總耗時(shí)約為3 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 開放系統(tǒng)中Se的有氧燃燒行為

本研究擬將樣品燃燒分解在開放式的流動(dòng)氧氣氣氛中進(jìn)行，既可實(shí)現(xiàn)大質(zhì)量樣品的充分燃燒，又能有效避免高溫導(dǎo)致的壓力隱患。在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，由于SeO₂的高沸點(diǎn)及有氧燃燒過程中高熱濕氣溶膠的形成，低溫燃燒瓶壁對(duì)燃燒產(chǎn)物具有快速高效的冷凝捕獲效果。為充分評(píng)估SeO₂的捕獲效率，將扇貝（GBW10024）在模擬實(shí)驗(yàn)條件下燃燒分解，并對(duì)燃燒瓶壁進(jìn)行清洗后測(cè)定清洗液中的硒含量。結(jié)果表明，即使無吸收液存在， Se 回收率的重現(xiàn)性良好（gt;70%），連續(xù)動(dòng)態(tài)氧燃燒過程中Se 能夠被定量回收。

2.2 固體校正標(biāo)準(zhǔn)研制

由于缺乏針對(duì)性的富硒標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)作為工作曲線校準(zhǔn)物質(zhì)，因此嘗試進(jìn)行自主研制。首先將購自當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)的丹參和富硒酵母片分別粉碎并過200目篩（篩孔直徑75 μm）， 然后按不同比例進(jìn)行二次粉碎混合，制得不同含量梯度的固體工作曲線校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品，再分別基于離線濕法消解和密閉氧瓶燃燒樣品的處理方法結(jié)合HG-AFS 進(jìn)行硒含量定值（見表2），并全程以扇貝（GBW10024）作為質(zhì)量控制樣品。

2.3 分析參數(shù)的優(yōu)化

2.3.1 燃燒瓶容積的優(yōu)化

燃燒瓶的體積越大，充氧量越多，同質(zhì)量樣品的燃燒效果越好；并且瓶壁內(nèi)表面積越大，燃燒產(chǎn)物的冷凝吸附效率也會(huì)增大。但是，燃燒瓶同時(shí)作為后端HG-AFS 的氣液分離器，容積增大將使得氣路死體積增大，容易導(dǎo)致峰展寬。綜合考慮，確定燃燒瓶的最佳容積為400 mL。

2.3.2 HG-AFS 工作參數(shù)的優(yōu)化

通過測(cè)定含10 ng/mL Se（Ⅳ）的10% HCl 溶液優(yōu)化HG-AFS 的工作參數(shù)。如圖2 所示， Se 信號(hào)強(qiáng)度隨讀取時(shí)間延長而增加，直至HG-AFS 允許的最大讀取時(shí)間（20 s）。Se 信號(hào)強(qiáng)度隨延遲時(shí)間的延長而增大，直至延遲時(shí)間達(dá)到7 s 時(shí)保持恒定。另外，根據(jù)文獻(xiàn)[23]的方法，選擇含0.5%（m/V）NaOH 的2%（m/V）NaBH₄ 作為最佳還原劑濃度，選擇20 mL 10%（V/V）HCl 作為最佳吸收液。

2.3.3 氧助燃?xì)饬髁康膬?yōu)化

由于燃燒分解過程在動(dòng)態(tài)的氧氣流中進(jìn)行，當(dāng)氧氣流量過低時(shí)，樣品燃燒完全所需的時(shí)間延長；當(dāng)氧氣流量過高時(shí)，燃燒產(chǎn)物來不及被冷凝吸附就被氣流吹走。因此，有必要考察氧氣流量（基于壓力控制）對(duì)硒熒光強(qiáng)度（FI）的影響。如圖3A 所示，隨著氧氣壓力增加， FI 隨之增大，直至壓力在0.1～0.15 MPa之間達(dá)到穩(wěn)定，此時(shí)硒回收率超過90%；如繼續(xù)增加壓力， FI 開始逐步下降，提示燃燒產(chǎn)物存在氣流夾帶損失。因此，最終選擇0.1 MPa 下對(duì)應(yīng)的流量作為最佳氧氣流量。

2.3.4 氬吹掃氣流量的優(yōu)化

樣品燃燒完全后，通入氬氣對(duì)燃燒瓶進(jìn)行吹掃是必要步驟，否則燃燒瓶內(nèi)殘存的氧氣將與后續(xù)氫化物發(fā)生反應(yīng)過程產(chǎn)生的氫氣混合而存在爆炸風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以0.05 MPa 氬氣連續(xù)吹掃30 s 可充分保證氧氣無殘留。此外，在HG-AFS 檢測(cè)過程中，氬氣作為載氣將生成的硒化氫及時(shí)引入AFS 原子化器。本研究考察了氬氣壓力從0.05 MPa（壓力表的最小刻度值）增至0.30 MPa 過程中硒熒光強(qiáng)度的變化。如圖3B所示，隨著氬氣壓力增加，硒的熒光強(qiáng)度持續(xù)下降，原因在于氬氣流量增大產(chǎn)生了稀釋效應(yīng)。因此，最終確定0.05 MPa 對(duì)應(yīng)的氬氣流量作為HG-AFS 檢測(cè)時(shí)的最佳載氣流量。

2.3.5 樣品處理量的優(yōu)化

選擇不同質(zhì)量的自制固體校準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖4 所示，當(dāng)樣品處理量小于20 mg時(shí)，樣品質(zhì)量與硒的熒光強(qiáng)度之間存在良好的線性關(guān)系（R2=0.997），并且硒的回收率超過90%；當(dāng)樣品質(zhì)量超過200 mg 時(shí)， Se的回收率反而隨著樣品質(zhì)量增加而降低，其原因可能是樣品質(zhì)量越大，所需的燃燒時(shí)間越長，熱輻射導(dǎo)致瓶壁冷凝捕獲效率下降。因此，最終確定200 mg 為被允許的最大樣品處理量。

2.3.6 樣品燃燒位置的優(yōu)化

進(jìn)一步考察了樣品固定位置與吸收液面之間的垂直距離（H1）對(duì)硒回收率的影響。如圖5 所示，改變距離H1 對(duì)硒的回收率無明顯影響（回收率均超過90%），這說明燃燒產(chǎn)物的冷凝吸附效率受樣品燃燒位置影響不顯著，樣品燃燒位置在距吸收液面2～6 cm 內(nèi)均可。

2.4 分析性能評(píng)價(jià)

本方法的全樣品分析流程可在3 min 內(nèi)完成，樣品分析通量為20 sample/h，分析效率明顯高于常規(guī)離線濕法消解。根據(jù)國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IUPAC）的標(biāo)準(zhǔn)，本方法的檢出限（LOD， 3SD）為0.012 mg/kg。采用本方法測(cè)定Se 含量在0.05～14 mg/kg 范圍內(nèi)的系列固體校準(zhǔn)物質(zhì)，線性相關(guān)系數(shù)（R²）大于0.995。對(duì)Se 含量為13.7 mg/kg 的實(shí)際樣品平行測(cè)定6 次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD， n=6）為1.7%，表明本方法具有較好的分析精密度。此外，針對(duì)國家標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)扇貝（GBW10024）和雞肉（GBW10018）中總Se含量的分析，測(cè)定值與標(biāo)稱值高度一致（表3），表明本方法準(zhǔn)確可靠。

2.5 實(shí)際樣品分析

采用研制的固體進(jìn)樣測(cè)硒裝置分析了從本地市場(chǎng)上購買的3種富硒保健品，并將分析結(jié)果與離線濕法消解樣品處理的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見表4，兩種方法的分析結(jié)果吻合良好，進(jìn)一步驗(yàn)證了本方法的準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論

將有氧燃燒由密閉系統(tǒng)改為氣路開放系統(tǒng)，并與HG-AFS 在線聯(lián)用，建立了直接有機(jī)固體進(jìn)樣分析的硒含量檢測(cè)新裝置和新方法。相比常規(guī)離線濕法消解，本方法具有綠色、高靈敏度及高通量等優(yōu)點(diǎn)，后續(xù)將通過改進(jìn)樣品引燃方式提升整體分析裝置的自動(dòng)化和智能化程度。