基于色譜分離的不同價態(tài)銻同位素分析的前處理方法

關(guān)鍵詞 銻；銻同位素；價態(tài)分離；測試；多接收電感耦合等離子體質(zhì)譜；高效液相色譜

銻（Sb）是一種有毒的金屬元素，位于元素周期表第五周期VA 族[1]。銻可增強(qiáng)合金的強(qiáng)度、硬度和耐腐蝕性，廣泛應(yīng)用于各類消費(fèi)品和工業(yè)產(chǎn)品中，如阻燃劑、電池、化學(xué)品、陶瓷和玻璃等[2-3]。銻工業(yè)活動和含銻產(chǎn)品的大量使用導(dǎo)致環(huán)境中銻含量顯著上升。銻并非人體必需元素，可通過與蛋白質(zhì)的巰基（–SH）結(jié)合抑制酶活性，破壞細(xì)胞離子平衡，干擾蛋白質(zhì)和糖的代謝，從而損害心臟、肺、肝臟、腎臟和神經(jīng)系統(tǒng)[4]，經(jīng)口服、皮膚接觸或吸入等方式的銻暴露會對人類和動物健康產(chǎn)生嚴(yán)重的不良影響[5]。歐洲理事會和美國環(huán)保局在上世紀(jì)已將銻及其化合物列為優(yōu)先管控的污染物[6-7]；世界衛(wèi)生組織建議，銻在土壤中的最大允許濃度為36 mg/kg，在飲用水中的安全水平為20 μg/L[8]。

在自然環(huán)境中，銻主要以三價（Sb（Ⅲ））和五價（Sb（Ⅴ））兩種價態(tài)存在[9]，不同價態(tài)的銻具有不同的地球化學(xué)特性。首先，兩者的毒性存在顯著差異， Sb（Ⅲ）的生理毒性遠(yuǎn)大于Sb（Ⅴ）[10]，因此， Sb（Ⅲ）暴露會對人體造成更大危害；其次，兩者在環(huán)境中的賦存狀態(tài)和遷移能力不同， Sb（Ⅲ）極易被氧化為Sb（Ⅴ），并且Sb（Ⅴ）可在河流中遠(yuǎn)距離遷移[11]；最后，銻的價態(tài)還可反映環(huán)境的氧化還原條件， Sb（Ⅲ）更多存在于還原環(huán)境中，如淹水稻田和地下水等[12]，并且歷史環(huán)境的氧化還原條件會影響銻的富集與虧損[13]。因此，有必要對環(huán)境中不同價態(tài)的銻進(jìn)行詳細(xì)研究，以深入了解其環(huán)境地球化學(xué)行為。銻同位素研究作為一種新興的方法，有助于對銻地球化學(xué)過程的理解，在吸附、蒸發(fā)、氧化、還原及生物利用過程中具有廣闊的應(yīng)用前景[14-17]。其中，氧化還原過程會產(chǎn)生顯著的銻同位素分餾[16-17]，導(dǎo)致銻同位素分餾范圍分別為–2.0～3.0 ε[17]和–4.6～–12.4 ε[18]。因此，開展環(huán)境樣品不同價態(tài)銻同位素的研究，有助于更深入了解銻在環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化過程。

水體可作為銻發(fā)生氧化還原反應(yīng)的基礎(chǔ)環(huán)境，很多關(guān)于銻的氧化還原實(shí)驗(yàn)均基于水溶液體系展開[16-18]。目前，關(guān)于不同價態(tài)銻同位素的分析測試僅局限于實(shí)驗(yàn)室模擬。Ferrari 等[17]通過巰基功能化硅粉，選擇性分離模擬溶液中的Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ），并測量了銻同位素組成，該分離過程存在繁瑣耗時和樹脂柱壽命較短導(dǎo)致的高成本等問題。由于天然水體基質(zhì)復(fù)雜等原因，目前尚沒有針對天然水體的不同價態(tài)銻同位素分析測試的方法，這極大地限制了對環(huán)境中銻氧化還原過程的理解。對于天然水體中不同價態(tài)銻含量測定的方法主要為高效液相色譜與氫化物發(fā)生原子熒光光譜法聯(lián)用法（HPLC-HG-AFS）。Quiroz 等[19]利用該方法測定了職業(yè)暴露人群尿液樣品中的Sb（Ⅴ）和Sb（Ⅲ）含量。Chen 等[20]利用該方法實(shí)時測量了天然水體中不同價態(tài)銻的含量。目前，中國科學(xué)院地球化學(xué)研究所在天然水體總銻同位素分析方面處于領(lǐng)先地位，建立了一套涵蓋水樣保存、消解及分離純化等環(huán)節(jié)的完整分析流程[21-22]，成功實(shí)現(xiàn)了超低銻濃度水體的同位素測定。這些工作為該領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展提供了堅實(shí)的技術(shù)支撐。

在天然水體中不同價態(tài)銻的分離過程中，此前的研究使用高濃度的酒石酸銨和甲醇作為流動相[23]，但有機(jī)試劑易揮發(fā)且有劇毒。Hansenet 等[24]建議使用檸檬酸作為流動相，但有機(jī)酸與其它金屬離子（如鐵和銅等）形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，可能導(dǎo)致嚴(yán)重的基體效應(yīng)。Lin 等[25]使用20 mmol/L EDTA-2 mmol/L KHP混合溶液作為流動相分離溶液中的Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ），但高濃度EDTA 溶液也容易導(dǎo)致嚴(yán)重的基體效應(yīng)。本研究基于高效液相色譜（HPLC）系統(tǒng)，使用更低濃度的EDTA 溶液作為流動相，并優(yōu)化了HPLC 的分離條件，采用向天然雨水中加入不同價態(tài)銻溶液的方法驗(yàn)證了分離方法的可靠性，并對礦區(qū)地下水中的Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）進(jìn)行分離富集。最后，采用多接收電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（MC-ICP-MS）分別測量其同位素組成，以檢驗(yàn)分離過程中是否存在同位素分餾。本研究建立了一種可靠、快速和低成本的天然水體樣品中Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）的分離和同位素測定方法，為深入探究表生環(huán)境中銻的地球化學(xué)行為提供了依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

多接收電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（Nu Plus Ⅱ MC-ICP-MS，英國Nu Instruments 公司）；LC-10AT 高效液相色譜（美國Waters 公司）；AFS-8520 原子熒光光譜儀（北京海光儀器公司）；Milli-Q 純水機(jī)（美國Millipore 公司）。Hamilton PRP-X100 陰離子交換色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）。

HCl（GR）、KOH（GR）和NaBH4（AR）（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；EDTA鉀鹽（GR， Macklin 公司）；鄰苯二甲酸氫鉀（KHP， ACS）、KI（AR）和抗壞血酸（AR）（Aladddin公司）。

銻標(biāo)準(zhǔn)溶液（NIST SRM 3102a）和鎘標(biāo)準(zhǔn)溶液（NIST SRM 3108）（美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院）；酒石酸銻鉀（ACS，美國Sigma-Aldrich 公司）溶于超純水中制備Sb（Ⅲ）標(biāo)準(zhǔn)溶液；六羥基銻酸鉀銻鉀（ACS， 美國Sigma-Aldrich 公司）溶于超純水中制備Sb（Ⅴ）標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2 分析方法

1.2.2 HPLC-HG-AFS 分析不同價態(tài)銻含量

采用HPLC-HG-AFS 法分析不同價態(tài)銻含量， Hamilton PRP-X100（250 mm×4.6 mm， 5 μm）陰離子交換色譜柱用于分離Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ），流動相為5 mmol/L EDTA 和2 mmol/L KHP 的混合溶液（pH=4.5）[26]。

在特定的時間分別接出色譜分離后的Sb（Ⅲ）和Sb（V）溶液，向其中加入0.5%（m/V）KI 和抗壞血酸的混合溶液，靜置4 h 以上，然后采用HG-AFS 分別測定Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）的濃度。

1.2.3 銻同位素分析方法

使用Nu Plus Ⅱ MC-ICP-MS（英國Nu Instruments 公司）耦合氫化物發(fā)生系統(tǒng)測定銻同位素組成。銻同位素組成表示為：

其中，ε¹²³Sb是樣品相對于標(biāo)準(zhǔn)樣品的¹²³Sb/¹²¹Sb同位素比值的偏差，¹²³Sb和¹²¹Sb分別是Sb的兩種天然穩(wěn)定同位素。

使用美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院的銻標(biāo)準(zhǔn)溶液（NIST SRM 3102a）作為銻同位素測試的基準(zhǔn)參考標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用標(biāo)準(zhǔn)-樣品交叉法并結(jié)合元素鎘作為內(nèi)標(biāo)校正儀器的質(zhì)量歧視效應(yīng)，銻同位素的分析精度為0.4ε（2SD）[22]。

1.3 質(zhì)量控制

所有實(shí)驗(yàn)用試劑均由超純水（電阻率為18.2 MΩ·cm）配制。HCl 和HNO3 經(jīng)過兩次蒸餾純化后使用。所有實(shí)驗(yàn)容器和移液吸頭在使用前經(jīng)過HNO3 和去離子水清洗。實(shí)驗(yàn)中使用的所有空白樣品中總銻濃度均低于檢出限（0.05 ng/mL）。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。根據(jù)空白樣品信號值標(biāo)準(zhǔn)偏差的3 倍除以校準(zhǔn)曲線的斜率計算檢出限，空白樣品信號值的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10 倍除以校準(zhǔn)曲線的斜率計算定量限[20]。所使用的HG-AFS 測量銻含量的方法的定量限為0.05 ng/mL，檢出限為0.015 ng/mL，儀器靈敏度為每1 ng/mL 銻溶液的響應(yīng)信號為1334 mV。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC參數(shù)的優(yōu)化

EDTA 鉀鹽作為一種強(qiáng)大的螯合劑，可與銻元素形成絡(luò)合物，但由于不同價態(tài)銻離子的電價和半徑的不同，因而與EDTA 的親合力也不同，使得Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）通過色譜柱的時間不同，據(jù)此可將Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）分離，而添加KHP 有助于改善色譜圖的峰形[27]。常規(guī)的在線預(yù)還原裝置難以及時將Sb（Ⅴ）還原為Sb（Ⅲ）。Chen 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，1.5%（m/V）硫脲還原Sb（Ⅴ）溶液時，需要超過15 min 才有90%的Sb（Ⅴ）轉(zhuǎn)化為Sb（Ⅲ），而達(dá)到95%的Sb（Ⅴ）轉(zhuǎn)化需要20 min。因此，本研究在特定的時間分別接出色譜分離后的Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）溶液，并向其中加入0.5%（m/V）KI 和抗壞血酸的混合溶液，至少靜置4 h，待還原充分后再采用HG-AFS 分別測定Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）的濃度。

在陰離子交換色譜中，樣品中的銻離子與流動相中的離子在樹脂表面發(fā)生交換反應(yīng)，該交換反應(yīng)可能為放熱或吸熱過程。因此，溫度變化會影響溶質(zhì)的保留因子。根據(jù)簡化的范特霍夫方程可描述為：

其中， A 和B 為常數(shù)，代表特定系統(tǒng)的色譜行為；T 為絕對溫度；K 為保留因子[28]。因此，柱溫變化會導(dǎo)致保留因子變化，進(jìn)而影響色譜的分離度、保留時間及峰形等[29]。此外，流動相的流速也會影響Sb（Ⅲ）和Sb（V）在陰離子色譜柱內(nèi)的保留時間，對分離效率至關(guān)重要。因此，本研究采用單變量優(yōu)化的方法，從Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）的出峰時間、峰形和峰面積3 個方面評估色譜柱溫度和流動相流速對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，以確定HPLC 分離水體樣品中Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）的最佳實(shí)驗(yàn)條件。在改變色譜柱溫度和流動相的流速時，達(dá)到設(shè)定條件后，均還需平衡30 min，然后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

色譜柱溫度對HPLC 分離Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）的影響如圖1A 所示。隨著溫度升高， Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）的保留時間均縮短，柱溫對Sb（Ⅴ）保留時間的影響較小，而對Sb（Ⅲ）保留時間的影響較大，這可能是因?yàn)镾b（Ⅲ）與流動相中EDTA 離子的相互作用比Sb（Ⅴ）強(qiáng)。在20 ℃時， Sb（Ⅲ）的保留時間最長（8.75 min）；在70 ℃時， Sb（Ⅲ）的保留時間最短（6.57 min）。這是因?yàn)镾b（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）與流動相中EDTA 的離子交換反應(yīng)微弱吸熱，溫度升高加快了反應(yīng)速率，進(jìn)而縮短了保留時間。在不同的溫度條件下，色譜柱均能較好地分離溶液中的Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）。綜合考慮不同溫度下Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）的分離情況以及峰形和峰面積，確定最佳的色譜柱溫度為40 ℃。

流動相流速對HPLC 分離Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）的影響如圖1B 所示。隨著流速從1.0 mL/min 逐步增至2.0 mL/min， Sb（Ⅴ）的保留時間從4.05 min縮短至2.02 min， Sb（Ⅲ）的保留時間從6.93 min縮短至3.24 min。因此，流動相流速與銻的保留時間存在負(fù)相關(guān)性。在1.0～2.0 mL/min 的流速范圍內(nèi)，色譜柱的分離度均大于1.5，表明均可以有效分離Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）。然而，增大流速雖然可以顯著縮短Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）的分離時間，但會對峰形的對稱性產(chǎn)生不利影響，表現(xiàn)為Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）的峰距離過近和拖尾。綜合考慮，本研究最終設(shè)置流動相流速為1.5 mL/min。

設(shè)置色譜柱溫度為40 ℃，流動相流速為1.5 mL/min，得到Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）的分離色譜圖如圖1C 所示，此時為水體樣品中Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）的最佳分離條件，其中， Sb（Ⅴ）的保留時間為2.59 min， Sb（Ⅲ）的保留時間為4.20 min，可在7 min 內(nèi)實(shí)現(xiàn)Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）的分離。

2.2 HPLC 對Sb（Ⅴ）和Sb（Ⅲ）的分離結(jié)果

根據(jù)2.1 節(jié)中確定的實(shí)驗(yàn)條件，將Sb（Ⅲ）的單標(biāo)溶液、Sb（Ⅴ）的單標(biāo)溶液、Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)樣HPLC 儀，并在2.00～3.50 min 和3.67～6.00 min 期間，使用過氟烷基化物（PFA）材質(zhì)溶樣罐分別接收Sb（Ⅴ）和Sb（Ⅲ）溶液。銻的總量設(shè)置為2～50 ng，并在20 mmol/L EDTA 體系中穩(wěn)定后進(jìn)樣HPLC儀器，每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，回收率為3 次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。通過測定分離后接收液中Sb（Ⅴ）和Sb（Ⅲ）的含量和銻同位素組成，評估方法的可靠性。

2.2.1 Sb（Ⅴ）和Sb（Ⅲ）的分離效果

在進(jìn)樣Sb（Ⅲ）單標(biāo)液的實(shí)驗(yàn)中，不同濃度的Sb（Ⅲ）的回收率為96%±1%～103%±1%（n=3）（表1），表明Sb（Ⅲ）可在陰離子色譜柱中被完全洗脫，并且不會發(fā)生氧化反應(yīng)。在進(jìn)樣Sb（Ⅴ）單標(biāo)液的實(shí)驗(yàn)中，不同濃度的Sb（Ⅴ）的回收率為101%±1%～108%±1%（n=3）（表2），表明Sb（Ⅴ）同樣可在陰離子色譜柱中被完全洗脫，并且不會發(fā)生還原反應(yīng)。在進(jìn)樣Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）混合標(biāo)準(zhǔn)液的實(shí)驗(yàn)中，不同濃度Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）的回收率分別為101%±1%～110%±1%（n=3）和97%±2%～104%±1%（n=3）（表3），表明流動相可在陰離子色譜柱中將Sb（Ⅴ）和Sb（Ⅲ）完全分離并洗脫，并且在分離過程中Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）可穩(wěn)定存在，未發(fā)生氧化和還原反應(yīng)。

2.2.2 Sb（Ⅴ）和Sb（Ⅲ）的同位素組成

采用MC-ICP-MS 直接對Sb（Ⅲ）單標(biāo)液和Sb（Ⅴ）單標(biāo)液的銻同位素組成進(jìn)行檢測，二者的數(shù)值分別為（0.97±0.1）ε（n=3）和（2.05±0.24）ε（n=5）。對經(jīng)過HPLC 的單標(biāo)液測試結(jié)果顯示， Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）的銻同位素組成分別為1.16ε和1.96ε（圖2）。因?yàn)殇R同位素分析精度為0.4ε，故分離后的Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）單標(biāo)液與原標(biāo)液的銻同位素組成一致。Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）混合溶液經(jīng)過HPLC 分離，接收的Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）的溶液的同位素組成分別為（0.99±0.11）ε（n=2）和（2.04±0.13）ε（n=2）?；?.4ε的銻同位素分析精度，表明分離后的Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）與原標(biāo)液的銻同位素組成一致。以上結(jié)果表明，采用HPLC 可實(shí)現(xiàn)混合溶液中Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）的有效分離，并且在分離過程中不會發(fā)生同位素分餾。

2.3 在天然水體樣品中的應(yīng)用

采集了貴州省貴陽市市區(qū)雨水（n=4）和貴州省黔西南自治州某礦區(qū)地下水（n=3），代表天然水體進(jìn)行不同價態(tài)銻的分離和同位素分析測試。天然水體樣品采集后使用0.45 μm 的混合纖維濾膜過濾，在4 ℃條件下密封保存。天然樣品中Sb（V）和Sb（Ⅲ）的分離在樣本采集后2 d 內(nèi)完成，由于雨水樣品中總銻濃度小于0.5 μg/L，認(rèn)為雨水本身含有的銻對后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響可以忽略，為了驗(yàn)證HPLC 價態(tài)銻分離方法的可行性，本研究向一定體積的天然雨水樣品中分別加入50 ng Sb（Ⅴ）標(biāo)準(zhǔn)溶液和Sb（Ⅲ）標(biāo)準(zhǔn)溶液。雨水和地下水樣品經(jīng)HPLC 分離的結(jié)果見表4 和圖3。雨水中Sb（Ⅴ）和Sb（Ⅲ）總量的回收率分別為98%±1%和107%±1%（n=2）。分離雨水中添加Sb（Ⅴ）和Sb（Ⅲ）單標(biāo)的銻同位素組成分別為1.86ε和1.29ε，分離雨水中同時添加Sb（Ⅴ）和Sb（Ⅲ）混標(biāo)的銻同位素組成分別為（1.95±0.15）ε（n=2）和（1.13±0.17）ε（n=2），與原標(biāo)液的銻同位素組成無明顯差異。雨水經(jīng)HPLC 分離后Sb（Ⅴ）和Sb（Ⅲ）總量的回收率和銻同位素組成表明，本方法可有效分離天然雨水中不同價態(tài)銻，未產(chǎn)生同位素分餾，并且不會受到自然水體的基體效應(yīng)影響。礦區(qū)地下水受到嚴(yán)重的銻污染，滿足銻同位素含量測試要求，故無需添加銻標(biāo)準(zhǔn)溶液。礦區(qū)地下水經(jīng)過HPLC 分離后僅檢測出Sb（Ⅴ），其色譜圖見圖3，只存在1 個Sb（V）峰，保留時間為2.91 min。因此，礦區(qū)地下水中只存在Sb（Ⅴ），這與文獻(xiàn)[11]報道的表生環(huán)境中銻主要以Sb（Ⅴ）的形式存在的結(jié)果一致。礦區(qū)地下水中Sb（Ⅴ）的總量回收率為102%，并且Sb（Ⅴ）的銻同位素組成（（6.66±0.13）ε， n=2）與地下水總銻的銻同位素組成（6.69ε）一致，表明本方法可有效分析天然地下水中的不同價態(tài)銻同位素的組成，天然地下水中的基質(zhì)不會對其產(chǎn)生影響。

3 結(jié)論

本研究優(yōu)化了陰離子色譜的實(shí)驗(yàn)條件，實(shí)現(xiàn)了對單標(biāo)液和混合標(biāo)液中Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）的有效分離。測定結(jié)果顯示，分離接收的Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）的同位素組成與原標(biāo)液一致，表明在分離過程中未發(fā)生銻同位素分餾。將本方法應(yīng)用于天然雨水和地下水的分析，實(shí)現(xiàn)了天然樣品中不同價態(tài)銻的分離和銻同位素的測定。本研究建立了一套可靠、快速和低成本的天然水體樣品中Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）分離的前處理方法，為環(huán)境天然水體的不同價態(tài)銻同位素研究奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)，有助于更深入地理解環(huán)境中銻的價態(tài)轉(zhuǎn)化過程及有關(guān)地球化學(xué)行為。