金屬元素探針標(biāo)記策略的研究進(jìn)展

關(guān)鍵詞 金屬元素探針；標(biāo)記策略；電感耦合等離子體質(zhì)譜；生物分子；評(píng)述

2001年，清華大學(xué)張新榮課題組[1]在對(duì)促甲狀腺激素的研究工作中率先提出了金屬元素探針標(biāo)記策略。自此之后，基于金屬元素標(biāo)記的分析方法研究受到了廣泛關(guān)注，已經(jīng)開發(fā)出了DNA 和蛋白質(zhì)等生物分子以及爆炸物和納米塑料等環(huán)境污染物的定量分析方法[2-6]。生物體復(fù)雜精密，由核酸和蛋白質(zhì)等多種生物分子共同構(gòu)成，其中，核酸是生命的遺傳密碼，蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的執(zhí)行者[7]。這些生物分子在機(jī)體內(nèi)的相互作用對(duì)于生物體的生長、發(fā)育和衰老等生命過程具有重要的調(diào)節(jié)作用[8]。在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，生物分子的種類和數(shù)量會(huì)發(fā)生變化，因此，對(duì)人體內(nèi)的生物分子進(jìn)行精確分析對(duì)于疾病的預(yù)防和早期診斷具有重要意義[9-12]。

金屬元素標(biāo)記與電感耦合等離子體質(zhì)譜（Inductively coupled plasma-mass spectrometry， ICP-MS）技術(shù)聯(lián)用的方法具有靈敏度高、可進(jìn)行多重分析以及基質(zhì)效應(yīng)低等獨(dú)特優(yōu)勢，拓寬了生物分子定量分析的研究思路。近二十年來，研究者開發(fā)了很多基于金屬元素標(biāo)記構(gòu)建的生物分子高效檢測方法，實(shí)現(xiàn)了靈敏分析和多組分同時(shí)檢測，并有效克服了生物體復(fù)雜基質(zhì)環(huán)境對(duì)生物分子的干擾，在生物分析領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。本文從金屬元素探針標(biāo)記策略出發(fā)，系統(tǒng)地總結(jié)了近十年來常用的標(biāo)記策略及其發(fā)展，并討論了其優(yōu)缺點(diǎn)，介紹了金屬元素探針在生物分子高靈敏度分析和多重檢測中的應(yīng)用研究進(jìn)展，最后對(duì)其發(fā)展趨勢進(jìn)行了展望。

1 金屬元素標(biāo)記的優(yōu)勢及檢測原理

1.1 金屬元素標(biāo)記的優(yōu)勢

基于金屬元素標(biāo)記策略的研究中，檢測金屬元素的儀器通常為ICP-MS[2]。利用ICP-MS 對(duì)金屬元素進(jìn)行分析具有許多優(yōu)勢：（1）由于來自標(biāo)記中的金屬原子可被直接檢測，因此不需要其在電學(xué)和光學(xué)等方面具有特殊性質(zhì)；（2）多數(shù)的元素和同位素都能夠通過ICP-MS 進(jìn)行分析，并且可實(shí)現(xiàn)低至pg/mL 量級(jí)的檢測[13]；（3）金屬元素標(biāo)記策略中可供選擇的金屬元素較多，得益于ICP-MS 優(yōu)異的譜線分辨率，能有效實(shí)現(xiàn)多組分同時(shí)檢測，并且不存在如熒光檢測中多波長激發(fā)譜帶重疊的問題[14]。

1.2 生物分子的檢測原理

將金屬離子或納米顆粒標(biāo)記在生物分子上形成信號(hào)探針，再通過DNA 鏈間互補(bǔ)配對(duì)或抗原-抗體相互作用等生物識(shí)別方式與目標(biāo)物結(jié)合，進(jìn)而引起ICP-MS 中金屬信號(hào)發(fā)生改變[15-16]。以簡單的三明治結(jié)構(gòu)檢測核酸或蛋白質(zhì)為例闡述金屬元素標(biāo)記策略的檢測原理，如圖1 所示[17]。首先，將金屬納米顆粒與核酸或抗體結(jié)合，形成信號(hào)探針，相應(yīng)的生物分子通過鏈霉親和素和生物素相互作用預(yù)先結(jié)合在磁珠表面。然后，在目標(biāo)分子存在下，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則或抗原抗體識(shí)別，金屬納米顆粒會(huì)被連接到磁珠表面，磁分離后被硝解，最后進(jìn)行ICP-MS 檢測，從而實(shí)現(xiàn)定量分析。

2 金屬元素探針標(biāo)記策略

生物體內(nèi)存在的S 和P 等元素能夠被直接應(yīng)用于生物分子的定量分析，但是，元素的低離子化效率和光譜干擾使得該分析方法的檢出限較高[18]。引入金屬元素標(biāo)記策略，能夠有效提高方法的靈敏度。目前，金屬元素標(biāo)記策略主要分為金屬離子標(biāo)記策略、金屬納米顆粒標(biāo)記策略和DNA 模板化金屬納米顆粒的無標(biāo)記策略。

2.1 金屬離子標(biāo)記策略

金屬離子標(biāo)記策略是將1，4，7，10 四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7-三乙酸-10-馬來酰亞胺乙基乙酰胺（MMADOTA）大環(huán)化合物與金屬離子螯合，形成的復(fù)合物通過加成反應(yīng)與帶有巰基修飾的DNA 連接，完成金屬離子標(biāo)記，標(biāo)記過程如圖2 所示[19]。王秋泉研究組[20-22]致力于對(duì)肽段進(jìn)行金屬元素標(biāo)記；譚蔚泓研究組[23]以二乙烯三胺五乙酸（DTPA）為基元合成了一種新型聚合物，用于螯合多種金屬離子，合成了一系列核酸適配體-金屬標(biāo)簽探針。目前，金屬離子標(biāo)記策略最常用的是鑭系金屬元素，由于其在生物體內(nèi)的含量很低，將其作為元素標(biāo)簽?zāi)軌颢@得優(yōu)異的分析性能。

鑭系金屬元素共有15 種，其中， Tb、Ho 和Tm 為單同位素元素（¹⁵⁹Tb、¹⁶⁵Ho 和¹⁶⁹Tm），通常被作為檢測生物分子的元素標(biāo)簽，完成多組分分析。但是，金屬離子標(biāo)記策略的缺點(diǎn)也很明顯，即1 個(gè)目標(biāo)物僅對(duì)應(yīng)1 個(gè)金屬離子，可能出現(xiàn)靈敏度較低的問題。針對(duì)上述問題，有研究者采用將多個(gè)金屬離子通過高分子材料結(jié)合在一個(gè)生物分子上的標(biāo)記策略，以此提高檢測靈敏度[24]；還有研究者利用四面體DNA、多組分核酸酶等提高檢測靈敏度[25-27]。

2.2 金屬納米顆粒標(biāo)記策略

隨著納米科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，考慮到金屬離子標(biāo)記策略存在的不足，研究者開發(fā)了金屬納米顆粒標(biāo)記策略以提高分析方法的靈敏度[28]。與金屬離子相比，金屬納米顆粒內(nèi)含有大量可被檢測到的金屬原子，例如， 1 顆直徑為10 nm 的金納米顆粒（AuNPs）中約含有30000 個(gè)金原子[29]。常用的金屬納米顆粒有金、銀、鉑納米顆粒和鑭系金屬元素納米顆粒，由于不需要金屬納米顆粒具有特殊性質(zhì)，金屬納米簇也被作為元素標(biāo)記應(yīng)用在實(shí)際研究工作中[30-32]。

AuNPs 是在實(shí)際應(yīng)用中使用最多的納米顆粒， AuNPs 的DNA 標(biāo)記方法主要為鹽老化法，操作復(fù)雜且耗時(shí)長[33]。近年來，已開發(fā)出冷凍法、微波法和蒸發(fā)干燥法等一系列簡單且快速的標(biāo)記方法將DNA或蛋白質(zhì)標(biāo)記在AuNPs 表面[34-37]。其中，冷凍法已被廣泛應(yīng)用于金屬元素標(biāo)記策略，標(biāo)記原理如圖3 所示。該方法簡單方便，標(biāo)記過程可在短時(shí)間內(nèi)完成， DNA 負(fù)載量更高，適用于多尺寸的AuNPs。

使用AuNPs 較易獲得高靈敏度，并且制備簡單，尺寸在2～100 nm 范圍內(nèi)的AuNPs 可以滿足不同的需求。但是，與鑭系金屬離子相比，金屬納米顆粒不夠穩(wěn)定，并且非特異性干擾較大，在多重檢測應(yīng)用中受限。雖然AuNPs 標(biāo)記生物分子的方法得到了較好的優(yōu)化，但是對(duì)于銀和鉑等其它納米顆粒簡單快速的標(biāo)記方法目前仍存在較大挑戰(zhàn)。

2.3 DNA 模板化金屬納米顆粒的無標(biāo)記策略

除了上述金屬離子標(biāo)記策略和金屬納米顆粒標(biāo)記策略兩種方式外， DNA 模板化金屬納米顆粒的無標(biāo)記策略也備受關(guān)注。當(dāng)還原劑存在時(shí)，以單鏈DNA 為模板，溶液中的金屬離子可被還原形成納米顆粒，例如金、銀和銅納米顆粒[3，38-39]，如圖4 所示。大部分納米顆粒模板化合成都需要較長的時(shí)間，但是模板化合成銅納米顆粒只需要5 min， 該方法已被應(yīng)用于生物分子的定量分析[40]。

DNA 模板化金屬納米顆粒表現(xiàn)出的物理和化學(xué)性質(zhì)在很大程度上受DNA 模板設(shè)計(jì)的影響，例如，調(diào)節(jié)DNA 模板序列可以使納米顆粒發(fā)出明亮的熒光[41]，并且具有可調(diào)的發(fā)射顏色和增強(qiáng)的穩(wěn)定性[42-43]，以及DNA 調(diào)控的金屬納米催化活性[44]。DNA 模板化金屬納米顆粒標(biāo)記方法制備簡單、效率高并且生物毒性低，但是在多組分分析領(lǐng)域中的效果并不理想。

3 金屬元素標(biāo)記策略的應(yīng)用研究進(jìn)展

3.1 金屬元素標(biāo)記策略在提高檢測靈敏度方面的研究進(jìn)展

金屬離子標(biāo)記策略通常會(huì)面臨靈敏度較低的問題，將標(biāo)簽換成金屬納米顆粒能夠在一定程度上解決該問題。許多研究者通過優(yōu)化標(biāo)記策略和核酸酶輔助等方式提高方法的分析性能[45-52]。通過AuNPs 標(biāo)記策略，催化銀沉積信號(hào)放大的方式可以對(duì)抗原進(jìn)行高靈敏度檢測，檢出限為0.03 ng/mL[45]。由于鑭系金屬元素在自然界的含量極低，鑭系納米顆粒被認(rèn)為是提高靈敏度最有前途的標(biāo)簽，用于評(píng)估嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2 型（SARS-CoV-2）RNA 的3 種基因片段的檢出限分別為1.2、1.3 和1.3 pmol/L[46]。將AuNPs 作為標(biāo)記，在具有高反式裂解活性的CRISPR/Cas12a 酶輔助下，實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA 的高靈敏檢測，檢出限低至1.05 amol/L[47]。修飾在AuNPs 表面的DNA 負(fù)載量過高會(huì)影響酶的剪切活性，因此應(yīng)對(duì)AuNPs 進(jìn)行選擇性功能化。Wang 等[48]使用比例優(yōu)化的AuNPs 標(biāo)記策略，以單靶點(diǎn)DNA 制備實(shí)物功能化AuNPs 作為信號(hào)探針，應(yīng)用于ICP-MS 分析。實(shí)驗(yàn)原理如圖5 所示，目標(biāo)miRNA 與單靶功能化的AuNPs 雜交形成雙鏈體，進(jìn)而被雙鏈特異性核酸酶（DSN）切割，釋放AuNPs。選擇性功能化使得DSN 的每次切割都能釋放AuNPs，極大地提高了分析方法的靈敏度，檢出限低至0.47 fmol/L。

采用時(shí)間分辨模式下的Sp-ICP-MS 對(duì)充分稀釋的金屬納米顆粒懸浮液中的單個(gè)納米顆粒進(jìn)行檢測，其中，信號(hào)頻率與納米顆粒的濃度直接相關(guān)，瞬時(shí)信號(hào)強(qiáng)度與納米顆粒大小直接相關(guān)。Sp-ICP-MS 可區(qū)分單個(gè)納米顆粒在大小和濃度方面的信號(hào)差異，防止該差異在平均信號(hào)中被掩蓋，這是降低背景信號(hào)的有效方式。Xu 等[52]利用不同尺寸的AuNPs 在Sp-ICP-MS 中產(chǎn)生的信號(hào)差異，基于滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)對(duì)DNA進(jìn)行高靈敏檢測，檢出限低至5.1 fmol/L。

3.2 金屬元素標(biāo)記策略在多組分同時(shí)分析中的研究進(jìn)展

同時(shí)對(duì)多種生物分子進(jìn)行分析能夠降低檢測成本，簡化檢測步驟，是生命科學(xué)等領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)問題， ICP-MS 的多重分析能力為解決上述問題提供了新的選擇。序列的高度相似性和生物系統(tǒng)的復(fù)雜性使得鑒別多個(gè)同源序列面臨挑戰(zhàn)?；阼|系元素標(biāo)記并結(jié)合邏輯門， Kang 等[53]成功開發(fā)了高特異性準(zhǔn)確鑒別let-7 家族中8 種miRNA 的分析平臺(tái)，并可擴(kuò)展到更多類型的同源序列分析。Li 等[54]通過金屬納米顆粒標(biāo)記策略，對(duì)疾病標(biāo)志物甲胎蛋白和亞型甲胎蛋白L3 進(jìn)行同時(shí)分析，為肝癌的早期診斷提供了技術(shù)支持。目前，針對(duì)同種疾病，同時(shí)檢測兩種或多種標(biāo)志物已成為單標(biāo)記物分析的替代方法。Li 等[17]探索了針對(duì)肝癌疾病標(biāo)志物miRNA 223和AFP 同時(shí)分析的方法，將核酸和蛋白質(zhì)混合后進(jìn)行ICP-MS 多重測定，擴(kuò)展了多重檢測的生物分子種類。此外， Wen 等[55]基于鑭系金屬納米顆粒標(biāo)記，通過納米衛(wèi)星和催化發(fā)夾組裝實(shí)現(xiàn)了對(duì)10 種miRNA 的同時(shí)分析，該方法具有超高靈敏度，檢出限低至0.01 fmol/L；通過機(jī)器算法分析，該方法對(duì)多種miRNA 信號(hào)實(shí)現(xiàn)了準(zhǔn)確診斷和分類，適用于臨床無創(chuàng)癌癥篩查。

SARS-CoV-2在全世界范圍內(nèi)流行對(duì)公共衛(wèi)生安全產(chǎn)生了嚴(yán)重影響，由此衍生的多種SARS-CoV-2變異株也導(dǎo)致發(fā)生了多批次流行性感染。為了解決SARS-CoV-2 變體診斷對(duì)靈敏度和多重性的需求， Li 等[56]構(gòu)建了三價(jià)的DNA四面體納米結(jié)構(gòu)用于金屬元素標(biāo)記，可同時(shí)鑒別3種變異的Omicron變體（圖6）。DNA四面體中1 個(gè)頂點(diǎn)用于連接磁珠，其它3 個(gè)頂點(diǎn)用于標(biāo)記鑭系金屬離子并輸出信號(hào)，這種獨(dú)特的多頂角結(jié)構(gòu)使其成為理想的多組分生物分析平臺(tái)。此外，四面體結(jié)構(gòu)為后續(xù)反應(yīng)提供了可控的納米級(jí)空間距離，有效減少了非特異性吸附，分析性能優(yōu)于單鏈DNA 探針。

4 總結(jié)與展望

金屬元素標(biāo)記策略的研究發(fā)展迅速，基于金屬元素標(biāo)記的生物分析方法具有以下優(yōu)勢：（1）靈敏度高，可顯著提升檢測性能，融合元素標(biāo)記策略和Sp-ICP-MS 兩者的優(yōu)勢可在無需任何信號(hào)放大的情況下，實(shí)現(xiàn)高靈敏的生物分析；（2）可進(jìn)行多組分分析，數(shù)量高達(dá)上百種的同位素使得高通量多組分靈敏分析在生物檢測領(lǐng)域發(fā)揮了不可替代的作用；（3）具有良好的生物相容性與穩(wěn)定性，通過采用生物相容性良好且不含其它特殊性質(zhì)的金屬同位素對(duì)不同生物分子進(jìn)行穩(wěn)定標(biāo)記，確保了對(duì)細(xì)胞和生物分子的低毒性和低干擾；（4）擁有靈活性與可定制性，元素標(biāo)記策略可根據(jù)不同的實(shí)際需求進(jìn)行定制，選擇適合的金屬同位素和標(biāo)記方式?；谝陨蟽?yōu)勢，金屬元素標(biāo)記策略在多種生物傳感器的構(gòu)建方面具有廣闊的應(yīng)用前景。例如， ICP-TOF-MS 以及飛行時(shí)間流式細(xì)胞儀（CyTOF 或流式細(xì)胞儀）可以精確地定量分析細(xì)胞表面不同的金屬同位素。因此，金屬元素標(biāo)記策略在不同生物分子分析方法中的應(yīng)用將為開發(fā)更實(shí)用、準(zhǔn)確和高效的分析技術(shù)提供更廣泛的思路。