單顆粒電感耦合等離子體質(zhì)譜技術(shù)用于生物基質(zhì)中納米銀檢測的研究進(jìn)展

關(guān)鍵詞 單顆粒電感耦合等離子體質(zhì)譜法；納米銀；生物基質(zhì)；前處理技術(shù)；評述

近幾十年來，隨著納米技術(shù)的發(fā)展，各類納米材料的生產(chǎn)和應(yīng)用快速增長，其中，納米銀（Silver" nanoparticles，AgNPs）是生產(chǎn)規(guī)模和使用量最大的金屬納米材料[1]。AgNPs由于擁有巨大的比表面積以及納米顆粒獨(dú)特的隧穿效應(yīng)，表現(xiàn)出良好的抑菌、光學(xué)和催化性能，近年來已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥產(chǎn)品、個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品、紡織品、家用清潔產(chǎn)品、涂料、食品和食品包裝材料中[1-3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，美國環(huán)保局所記錄注冊的用于殺菌的含銀產(chǎn)品中，有53%的產(chǎn)品含AgNPs[4-5]。在這些產(chǎn)品的使用過程中，生態(tài)系統(tǒng)及人體可長期暴露于AgNPs 中，因此其暴露水平以及生物安全性受到廣泛關(guān)注[6-8]。例如，針對AgNPs對生態(tài)系統(tǒng)及人體健康影響的關(guān)注度進(jìn)行相關(guān)文獻(xiàn)檢索，在Web of Science 中分別檢索了2010 年以來關(guān)于AgNP 暴露（AgNP exposure，關(guān)鍵詞“nanosilver exposure OR AgNP exposure OR silver nanoparticle exposure”）、AgNP 安全性（AgNP safety，關(guān)鍵詞“nanosilver safety OR AgNP safety OR silver nanoparticle safety”）以及AgNP 生物分布（AgNP biodistribution，關(guān)鍵詞“nanosilver biodistribution OR AgNP biodistribution OR silvernanoparticle biodistribution”）的相關(guān)研究，并經(jīng)人工逐一確認(rèn)過濾。通過對上述文獻(xiàn)檢索結(jié)果進(jìn)行匯總發(fā)現(xiàn)，在新冠疫情開始（2020 年）前，相關(guān)研究基本呈逐年增加的趨勢，隨后出現(xiàn)下降的趨勢（圖1）。這說明，一方面，AgNPs是目前研究數(shù)量及應(yīng)用數(shù)量最多的納米材料之一；另一方面，有關(guān)AgNPs 暴露的生物安全性研究仍不充分，與其應(yīng)用相關(guān)的管理規(guī)定仍有待完善[9]。AgNPs生物安全性研究領(lǐng)域的瓶頸之一是動(dòng)物/植物暴露研究、生態(tài)學(xué)研究和毒理學(xué)研究之間缺乏有效的鏈接，不同研究結(jié)果缺乏可比性[2]。

AgNPs 的生物歸趨是其應(yīng)用安全性評估的重要基礎(chǔ)，現(xiàn)有研究主要受限于缺乏生物基質(zhì)中AgNPs的形態(tài)鑒定和量化的標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)手段[10]。在基于真實(shí)場景的研究中，由于難以直接計(jì)算得到確切的外暴露劑量，因而需要對組織中的AgNPs 進(jìn)行測定。銀在生物體內(nèi)主要存在的形態(tài)為溶解態(tài)（包含銀離子及其結(jié)合物）和顆粒態(tài)，在測定時(shí)明確區(qū)分不同形態(tài)至關(guān)重要，主要有以下3 個(gè)方面的原因。（1）溶解態(tài)和顆粒態(tài)銀的生物效應(yīng)差異巨大。目前的研究普遍認(rèn)為，銀離子（Ag⁺）生物活性最強(qiáng)，硫化銀（Ag₂S）最弱[11-13]。AgNPs 發(fā)揮殺菌作用和產(chǎn)生細(xì)胞毒性主要是由于其釋放了Ag⁺[14]。（2）AgNPs 在生物基質(zhì)中容易發(fā)生形態(tài)轉(zhuǎn)化。在實(shí)驗(yàn)條件下， AgNPs 容易發(fā)生氧化，即顆粒溶解[15]。溶解態(tài)的銀也可能經(jīng)過蛋白質(zhì)絡(luò)合等過程重新形成顆粒（AgCl、Ag₂S 和AgO），多項(xiàng)研究在AgNO₃ 暴露的動(dòng)物組織中也檢測到了AgNPs顆粒[16-18]。（3）研究表明，不同形態(tài)的銀在生物體內(nèi)會(huì)表現(xiàn)出不同的分布特征[17-19]。因此，除了銀濃度， AgNPs 暴露后對生物組織中銀的形態(tài)分析也是十分必要的，這有助于深入理解AgNPs 的體內(nèi)過程及其生物作用機(jī)制。在以往的體外實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，銀的不同形態(tài)對其毒性效應(yīng)具有較大的影響。然而，在動(dòng)物暴露研究中，僅對體內(nèi)總銀含量進(jìn)行檢測進(jìn)而評估其內(nèi)暴露水平，缺乏形態(tài)表征，難以與前者對照論證，這是AgNPs 暴露健康風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)困難的最主要原因之一[20-22]。

為了進(jìn)一步了解AgNPs 的生物安全性，首先要對生物組織（尤其是動(dòng)物組織）中不同形態(tài)的銀進(jìn)行準(zhǔn)確表征和定量分析，需要合適的前處理方法和靈敏的檢測手段。首先，生物組織基質(zhì)復(fù)雜，需要在不影響銀形態(tài)的前提下實(shí)現(xiàn)高效提取[23]。其次，相比水體等環(huán)境介質(zhì)，生物組織中的AgNPs 的含量極低（低至ng/g 級別），這要求分析技術(shù)達(dá)到痕量水平[17]。另外，生物基質(zhì)中存在的大量有機(jī)組分和無機(jī)組分會(huì)對前處理和檢測過程產(chǎn)生嚴(yán)重干擾，因此需要檢測方法具有足夠高的選擇性和抗干擾能力[24]。在現(xiàn)有的分析技術(shù)中，單顆粒電感耦合等離子體質(zhì)譜法（sp-ICP-MS）具有靈敏度高、分析速度快、無需與分離技術(shù)聯(lián)用以及所需樣本量少等獨(dú)特的優(yōu)勢，近十幾年被廣泛應(yīng)用于環(huán)境、食品和生命科學(xué)等領(lǐng)域，已成為檢測多種介質(zhì)中工程納米材料的重要工具[25-27]。對于水體等簡單基質(zhì)，已有標(biāo)準(zhǔn)檢測流程可供參考（《納米技術(shù)-水相中無機(jī)納米顆粒的尺寸分布和濃度測量-單顆粒電感耦合等離子體質(zhì)譜法》（GB/T 42732—2023）[28]），但目前尚無標(biāo)準(zhǔn)方法用于生物樣本這類復(fù)雜基質(zhì)中的納米顆粒的檢測。

sp-ICP-MS 分析方法在生物組織中的AgNPs 分析檢測方面具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，現(xiàn)有的綜述主要從sp-ICP-MS 檢測方法的優(yōu)化、在環(huán)境和食品等領(lǐng)域中的應(yīng)用以及其對生物組織中金屬納米顆粒的提取等方面進(jìn)行總結(jié)和評述[1，29-30]，而基于sp-ICP-MS 的AgNPs 檢測方法的相關(guān)綜述相對缺乏?；诖?，本文簡要介紹了sp-ICP-MS 的原理和應(yīng)用，通過總結(jié)目前研究中使用的方法，提出優(yōu)化思路，以供后續(xù)研究者參考并選擇更適當(dāng)?shù)姆椒ǎ瑢?shí)現(xiàn)生物組織中AgNPs 的準(zhǔn)確定量分析，進(jìn)而在AgNPs 的生物賦存和遷移轉(zhuǎn)化等研究中得到更可靠的數(shù)據(jù)。

1 生物基質(zhì)中AgNPs 的提取方法

研究中常見的生物基質(zhì)包括動(dòng)物的組織或體液、細(xì)胞和植物組織等。sp-ICP-MS 檢測時(shí)需要樣本最終為液相，因此對于固態(tài)的生物組織，首先需要對樣品進(jìn)行前處理，使組織中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和多糖等基質(zhì)成分溶解，從而將其中的銀釋放到液體基質(zhì)中，即將AgNPs從生物基質(zhì)中提取出來。動(dòng)物血液、血漿和組織液等生物樣本雖為液態(tài)，但由于其中包含細(xì)胞等有機(jī)組分，因此在檢測或分離之前也需要進(jìn)一步的前處理[31-32]。

為保證生物基質(zhì)中AgNPs 分析結(jié)果的可靠性，需要選擇合適的取樣方法和消解方法，使樣品具有代表性和普適性，并保證消解過程不干擾銀的形態(tài)。取樣均一是檢測結(jié)果能夠代表被測樣本整體的前提。由于AgNPs 具有高反應(yīng)活性，提取生物組織中的銀顆粒時(shí)，還需要在樣品消解的過程中保證銀的顆粒形態(tài)不會(huì)發(fā)生改變。由于AgNPs 可溶于強(qiáng)酸，因此為了保持納米顆粒的形態(tài)完整，目前復(fù)雜基質(zhì)中AgNPs的提取最常用的方法主要有堿提取和酶提取兩類。此外，由于生物基質(zhì)種類多樣，為了保證結(jié)果之間的可比性，前處理方法最好能適用于各種基質(zhì)。

1.1 取樣方法

對于難以區(qū)分不同部位的小型動(dòng)物或植物（如斑馬魚），為了保證樣本量足夠，可將整個(gè)機(jī)體作為一個(gè)樣本進(jìn)行分析，其測定結(jié)果代表全身整體的銀含量。哺乳動(dòng)物、魚類和植物等生物由于其體型較大，可以實(shí)現(xiàn)各器官和組織的分離，因此取樣時(shí)可收集0.5～2 g 組織進(jìn)行消化，提取其中的AgNPs。為了保證樣本濃度可以代表整個(gè)組織，提取之前，液態(tài)樣本（全血、血漿、組織液和尿液等）需混勻，在樣本量足夠多的情況下也可先將固態(tài)組織進(jìn)行勻漿。

樣本一般保存在–80 ℃環(huán)境下，取樣前解凍，并且取樣后盡快放回冰箱，避免凍融過程引起組織中AgNPs 發(fā)生形態(tài)轉(zhuǎn)化。盡管目前還沒有確切的研究證據(jù)證實(shí)這一過程，但一些研究發(fā)現(xiàn)，長期冷凍儲(chǔ)存后，雞肉中的AgNPs 的回收率很低，這可能是溶解或化學(xué)轉(zhuǎn)化過程所致[33]。

1.2 消解方法

1.2.1 堿提取方法

綜合現(xiàn)有的研究，堿提取方法具有提取效率高、過程相對簡單以及引入外源污染的可能性較低等優(yōu)點(diǎn)，是目前生物組織中AgNPs 的提取應(yīng)用最廣泛的前處理方法（圖2[24]和表1）。

堿提取生物組織中AgNPs 的常規(guī)流程如下：（1）向組織樣本中按照消解液體積：組織質(zhì)量=20∶1（V/w）的比例加入堿溶液；（2）常溫下超聲，搖床振蕩消解24～48 h；（3）將樣本過濾，稀釋至合適倍數(shù)。堿提取中常用的堿試劑主要有四甲基氫氧化銨（TMAH）、NaOH 和KOH，其中TMAH 應(yīng)用最廣泛。2014 年，Gray 等[34]首次將TMAH 前處理方法用于牛肉組織AgNPs 的sp-ICP-MS 檢測。為盡量避免引入雜質(zhì)，TMAH 的純度應(yīng)不低于99.9%，并稀釋至20%使用[35-36]。在檢測前，堿提取液用超純水稀釋至堿濃度1%以下。值得注意的是，有研究發(fā)現(xiàn)稀釋會(huì)降低提取液中AgNPs 的穩(wěn)定性[37]，因此過濾后應(yīng)暫存于4 ℃，測樣前再進(jìn)行稀釋。

Vidmar 等[38]的研究表明，利用TMAH消解時(shí)， Ag+有可能轉(zhuǎn)化為顆粒態(tài)銀。該研究采用27 nm 的聚乙二醇修飾AgNPs（PEG-AgNPs）和34 nm 的羧酸鈉修飾AgNPs（COONa-AgNPs）兩種不同粒徑及表面修飾的AgNPs，利用TMAH 對這兩種AgNPs 暴露的人體胎盤組織進(jìn)行前處理后，采用sp-ICP-MS 對其濃度和粒徑分布進(jìn)行了分析，并對比了基質(zhì)效應(yīng)的影響。結(jié)果表明， TMAH 和酶溶液兩種消解液中不同溶質(zhì)對傳輸效率和信號強(qiáng)度無明顯影響，不同前處理后胎盤組織中檢出的銀顆粒粒徑分布基本一致，但堿處理組回收率更高（118%～133%）。通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， TMAH 本身不與Ag⁺反應(yīng)生成顆粒，但在堿處理組織的過程中，組織中存在的氯化物、磺胺類和帶—OH 的蛋白質(zhì)可能與游離態(tài)Ag⁺結(jié)合形成銀顆粒，但在酶消解液中不會(huì)有顯著的顆粒形成[39-40]。另外， AgNPs 容易團(tuán)聚，這可能導(dǎo)致sp-ICP-MS 測得的銀顆粒粒徑偏大。

1.2.2 酶提取方法

已有多種生物酶被應(yīng)用于動(dòng)物或植物組織中納米顆粒的提取，尤其在植物組織中應(yīng)用更廣泛（表1）。生物組織中AgNPs 的酶提取法一般主要包含如下步驟：（1）通過勻漿或凍干研磨等物理方法破碎組織；（2）在組織中添加酶溶液后，在適宜條件下進(jìn)行孵育提取24～36 h，可利用超聲等輔助提??；（3）對樣本的提取液進(jìn)行過濾，并在檢測前稀釋至合適倍數(shù)。消解和提取過程中具體使用的酶種類及濃度比例在不同研究中隨樣本種類不同而有所差異[23，38，41-42]。常用的酶有離析酶（Macerozyme R-10）、蛋白酶、脂肪酶和胰酶等，酶的選擇主要根據(jù)組織類型確定，具體使用條件（溫度、pH 值和底物等）以酶活性最大化的原則進(jìn)行選擇。由于現(xiàn)有應(yīng)用案例有限，通常需要在研究中根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行優(yōu)化。酶溶液的緩沖液通常為1% Triton X-100 與0.5% 十二烷基硫酸鈉（SDS），其有助于分散組織勻漿中的納米顆粒，保持納米顆粒在消解和稀釋后的溶液中的均勻性和穩(wěn)定性。

Macerozyme R-10 主要含果膠酶、纖維素酶和半纖維素酶，常用于水解植物，其適宜pH 值范圍為3.5～7.0。考慮到AgNPs 在酸性環(huán)境下容易溶解，樣本中pH 值一般不應(yīng)低于5.5。Macerozyme R-10 可在超聲輔助下水解紅色（棕櫚屬）和綠色（莼菜屬）海藻，實(shí)現(xiàn)AgNPs 的提取，并用于sp-ICP-MS 分析[27]。另外，也有研究利用Macerozyme R-10 酶成功提取了不同植物樣本中的AuNPs，用于sp-ICP-MS 檢測[42]。

蛋白酶K 可用于肌肉和實(shí)質(zhì)器官等多種動(dòng)物組織的消解，濃度一般為0.4～10 mg/L， 其發(fā)揮最佳活性的pH 值范圍為7.5～12.0，溫度為35～37 ℃， 并且在Ca²⁺存在時(shí)能發(fā)揮更高的酶活性。有研究利用蛋白酶K 對雞肉組織進(jìn)行酶解后，采用sp-ICP-MS 測定了其中的AgNPs，方法的準(zhǔn)確度（粒度98%～99%，濃度91%～101%）和重現(xiàn)性（粒度lt;2%，濃度lt;11%）均良好[37]。脂肪酶適用于脂肪組織消解，而胰酶適用于結(jié)締組織的消解，也可視實(shí)際情況配合同時(shí)使用多種酶進(jìn)行消解。

然而，酶提取法并不適用于所有的動(dòng)物組織樣本，在部分研究中難以實(shí)現(xiàn)不同組織分析結(jié)果的對照。如對于皮膚組織和性腺等結(jié)締組織或脂質(zhì)含量較高的組織，采用多種蛋白酶消解的效果均不佳，目前還未見可行的酶消解方法的報(bào)道[24]。

1.2.3 其它提取方法

其它動(dòng)物樣本的前處理方法還包括直接稀釋方法，如利用直接稀釋法處理尿液樣本[20]。另外，還有個(gè)別研究通過裂解法釋放植物樣本中的銀納米顆粒，或使用甲醇對植物組織進(jìn)行消解[47]。

1.3 不同提取方法的比較

在上述各種前處理方法中，堿提取和酶提取法最常用，這兩種方法基本可以覆蓋絕大多數(shù)生物基質(zhì)中AgNPs 的提取。通常，需要根據(jù)研究目的謹(jǐn)慎地選擇恰當(dāng)?shù)那疤幚矸椒?。評價(jià)前處理方法有多個(gè)維度，如提取效率、顆?；厥章?、檢出限以及對顆粒形態(tài)的干擾等。在以往研究中，前處理方法的主要選擇依據(jù)是提取效率和回收率，前處理流程的優(yōu)化也主要集中在這兩個(gè)方面[23，38]。

有少數(shù)研究基于同一生物組織直接比較了不同sp-ICP-MS 前處理方法的提取效果?？傮w上，大多數(shù)研究認(rèn)為堿提取方法優(yōu)于酶提取方法，尤其對于動(dòng)物組織，主要是因?yàn)閴A消解方法消解速度更快、提取效率更高以及回收率更好。Ishizaka 等[23]比較了NaOH、TMAH、蛋白酶K、濃HNO₃、濃HCl 和PBS這6種試劑對小鼠多種組織中AgNPs 的提取效率，發(fā)現(xiàn)NaOH 對肝臟中的AgNPs 提取效率最好，酸性基質(zhì)會(huì)溶解AgNPs顆粒，而PBS 無法消化組織[23]。Vidmar 等[38]分別利用堿消解和酶消解兩種方式提取了AgNPs 暴露的人體胎盤組織中的AgNPs，并用sp-ICP-MS 對其濃度和粒徑分布進(jìn)行了分析，對比基質(zhì)效應(yīng)的影響。該研究使用了兩種不同粒徑及表面修飾的AgNPs，包括27 nm 的聚乙二醇修飾AgNPs（PEGAgNPs）和34 nm 的羧酸鈉修飾AgNPs（COONa-AgNPs）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， TMAH 和酶溶液兩種不同基質(zhì)對傳輸效率和信號強(qiáng)度無明顯影響，經(jīng)不同前處理方法處理后，胎盤組織中檢出的銀顆粒粒徑分布基本一致，但堿處理組的回收率更高（118%～133%）。Chalifoux 等[44]的研究表明，分別用優(yōu)化過的胰酶+脂肪酶和TMAH 對含40 nm AgNPs 的牛肉組織進(jìn)行前處理并利用sp-ICP-MS 方法進(jìn)行檢測，在最佳條件下，堿提取法回收率（gt; 90%）高于酶提取法（lt; 60%），但穩(wěn)定性差。Laughton 等[48]在關(guān)于植物組織中納米顆粒提取的研究中發(fā)現(xiàn)，提取3 種不同植物（生菜、玉米和羽衣甘藍(lán)）葉片中的AuNPs、CuONPs 和ZnONPs 時(shí)，相比酶提取法，利用甲醇萃取法不會(huì)造成納米顆粒粒徑分布發(fā)生明顯改變，尤其是反應(yīng)活性相對強(qiáng)的ZnONPs。此結(jié)果表明，研究不穩(wěn)定的金屬納米材料在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程時(shí)，應(yīng)關(guān)注納米顆粒在提取過程中發(fā)生轉(zhuǎn)化的問題。AgNPs 同樣具有較高的反應(yīng)活性，因此應(yīng)關(guān)注前處理過程中復(fù)雜生物基質(zhì)中AgNPs 賦存狀態(tài)的轉(zhuǎn)化。

后續(xù)研究中，研究者應(yīng)注意避免在前處理過程中銀離子生成銀顆粒造成假陽性結(jié)果這一可能性。建議利用sp-ICP-MS 方法進(jìn)行組織中AgNPs 的檢測之前，先根據(jù)樣本中的銀濃度進(jìn)行加標(biāo)驗(yàn)證，并基于實(shí)驗(yàn)結(jié)果謹(jǐn)慎選擇前處理方法。另外，現(xiàn)有文獻(xiàn)主要集中于內(nèi)臟或肌肉組織的應(yīng)用，而對皮膚、骨骼和生殖器官的關(guān)注很少，相關(guān)方法有待開發(fā)。

2. 生物組織中AgNPs 的sp-ICP-MS 檢測方法

2.1 方法原理

sp-ICP-MS 方法是基于ICP-MS 發(fā)展而來的。ICP-MS 系統(tǒng)主要由進(jìn)樣系統(tǒng)、離子源和質(zhì)量分析器組成，樣品在等離子體中離子化，不同質(zhì)荷比（m/z）的離子在質(zhì)量分析器中分離，并轉(zhuǎn)化為電信號，將該信號表示為CPS，濃度越高，信號越強(qiáng)，進(jìn)一步通過與標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)比較，實(shí)現(xiàn)對元素的定性和定量分析。以銀元素為例，在單顆粒檢測模式下，液相樣品中的溶解態(tài)銀離子及AgNPs 進(jìn)入ICP 離子源霧化后，在高溫下，溶劑蒸發(fā)，溶質(zhì)發(fā)生電離。在樣品稀釋倍數(shù)足夠的情況下，氣溶膠中均勻分布的離子會(huì)在質(zhì)量檢測器中產(chǎn)生穩(wěn)定的離子信號，在時(shí)間分辨（TRA）模式下的時(shí)間-信號圖中形成連續(xù)穩(wěn)定的離子基線。納米顆粒隨機(jī)分散于氣溶膠液滴中，單個(gè)顆粒電離時(shí)會(huì)分別形成離子團(tuán)簇，因此產(chǎn)生有別于離子信號的不連續(xù)高強(qiáng)度脈沖信號，據(jù)此可區(qū)分樣本中不同形態(tài)的銀（圖3）。脈沖信號強(qiáng)度與納米顆粒粒徑正相關(guān)，脈沖數(shù)量與顆粒數(shù)量相關(guān)，因此可以根據(jù)采集到的原始數(shù)據(jù)對溶液中納米顆粒的數(shù)量濃度和粒徑分布進(jìn)行分析。最終，通過與標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)比對， sp-ICP-MS 檢測可獲得：（1）樣品中是否含特定元素溶解態(tài)/顆粒態(tài)的定性信息；（2）離子濃度以及顆粒的數(shù)濃度和質(zhì)量濃度的定量信息；（3）顆粒的尺寸信息。這一理論基礎(chǔ)由Degueldre 等在本世紀(jì)初首次提出，并在近二十年內(nèi)得到了迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用[15，46，49-50]。

2.2 方法的優(yōu)勢與局限性

sp-ICP-MS 分析方法的優(yōu)勢體現(xiàn)在分離、鑒定和定量分析3 個(gè)方面。（1） sp-ICP-MS 延續(xù)了ICP-MS高選擇性、高靈敏度、低檢出限和檢測快速高效的特點(diǎn)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道， sp-ICP-MS 檢出限可低至10～1 ng/L[14，51]。低檢出限表明所需樣本量少，并且無需濃縮，既簡化了實(shí)驗(yàn)步驟又避免了引入外源污染。（2）如前面原理部分所述，對于生物基質(zhì)中AgNPs 的檢測， sp-ICP-MS 的獨(dú)特優(yōu)勢還體現(xiàn)在其可分辨離子和顆粒形態(tài)。（3）能夠同時(shí)對樣本中的AgNPs 和銀離子進(jìn)行半定量檢測，無需與流體動(dòng)力色譜（HydrodynamicChromatography， HDC）、場流分離（Field flow fractionation， FFF）、毛細(xì)管電泳（Capillary electrophoresis，CE）等其它分離設(shè)備聯(lián)用，具有操作簡單、分析快速和干擾因素少等特點(diǎn)。相比之下，目前鑒定納米顆粒的標(biāo)準(zhǔn)方法透射電子顯微鏡（Transmission electron microscope， TEM）只能實(shí)現(xiàn)定性分析，并且檢出限較高，難以實(shí)現(xiàn)實(shí)際樣本中痕量AgNPs 的檢測。同時(shí)，動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)（DLS）、納米顆粒追蹤技術(shù)（NTA）等其它表征檢測技術(shù)由于檢出限高和容易受基質(zhì)干擾等特點(diǎn)也不適用于生物基質(zhì)中AgNPs的分析。

然而， sp-ICP-MS方法的應(yīng)用也存在局限性。首先，粒徑較小的AgNPs信號難以與離子信號分辨，這是由于sp-ICP-MS方法的粒徑檢出限一般為20～30 nm， 通常高于DLS等方法的檢出限（10 nm以下）[23，52]。另外，在sp-ICP-MS 檢測中使用的單顆粒模式只能同時(shí)采集單個(gè)元素，無法分析納米顆粒中的元素組成信息。Peters 等[37]將AgNPs 添加至雞肉組織中，發(fā)現(xiàn)其溶解后會(huì)轉(zhuǎn)化成硫化銀，而單獨(dú)使用sp-ICP-MS 無法追溯這一形態(tài)轉(zhuǎn)化過程。盡管最近有報(bào)道顯示Thermo Scientific 等公司開發(fā)出了雙元素納米顆粒分析方法，但其依然難以實(shí)現(xiàn)對對單個(gè)顆粒的元素分辨[53]。因此，在AgNPs 的生物效應(yīng)相關(guān)研究中，為了提供更詳盡的數(shù)據(jù)， sp-ICP-MS 通常需要與其它方法聯(lián)合使用，如TEM、DLS 和光電子能譜（XPS）等技術(shù)。

2.3 方法驗(yàn)證

由于利用sp-ICP-MS 進(jìn)行復(fù)雜基質(zhì)中AgNPs 的檢測還未形成通用標(biāo)準(zhǔn)方法，因此為了保證分析數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可追溯性，通常各研究在報(bào)道結(jié)果之前應(yīng)首先給出方法的檢出限（LOD）、定量限（LOQ）、回收率以及顆粒尺寸分布一致性檢驗(yàn)等結(jié)果，并據(jù)此進(jìn)行下一步數(shù)據(jù)分析。上述研究通常是將標(biāo)準(zhǔn)納米顆粒添加至不同基質(zhì)中進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。有研究表明，前處理方法和樣本性質(zhì)的差異都可能影響檢測結(jié)果。Huang 等[45]利用sp-ICP-MS 檢測肝臟、尿液和血漿中CeO₂ 時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同生物樣品的基質(zhì)效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致樣本sp-ICP-MS 檢測結(jié)果不準(zhǔn)確，可考慮通過內(nèi)標(biāo)方法校正。驗(yàn)證sp-ICP-MS 結(jié)果可靠性的方法，需要保證檢出限（粒徑及濃度）、化學(xué)特性、粒徑分布和濃度偏差都在一定范圍內(nèi)。

然而，在目前利用sp-ICP-MS 方法檢測生物組織中AgNPs 的研究中，極少有報(bào)道這些參數(shù)，這限制了不同研究結(jié)果之間的比較。Weigel 等[15]于2017 年組織了一次利用sp-ICP-MS 檢測AgNPs 的實(shí)驗(yàn)室間比較研究，由來自歐盟、美國和加拿大的10個(gè)實(shí)驗(yàn)室測定添加了聚乙烯吡咯烷酮包被的AgNPs（PVP-AgNPs）的雞肉勻漿，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AgNP 質(zhì)量濃度和數(shù)量濃度的測定結(jié)果重復(fù)性均較低。這說明基于sp-ICP-MS 獲得復(fù)雜基質(zhì)樣品中AgNPs 的可靠數(shù)據(jù)，還需要進(jìn)一步改進(jìn)方法以消除偏差。同時(shí)，由于AgNPs 的活性較高，容易發(fā)生形態(tài)轉(zhuǎn)化，因此在sp-ICP-MS 檢測中，樣品保存和前處理的方法仍需進(jìn)一步優(yōu)化。

目前國際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）和經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）等機(jī)構(gòu)正在開展對sp-ICP-MS 技術(shù)的樣本制備以及分析方法的標(biāo)準(zhǔn)化工作，有望實(shí)現(xiàn)更嚴(yán)格的質(zhì)量控制監(jiān)管。在此之前，相關(guān)研究也應(yīng)該更加關(guān)注方法，并對驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)行合理報(bào)道。

2.4 數(shù)據(jù)處理流程

sp-ICP-MS 的數(shù)據(jù)處理技術(shù)路線詳見圖4。對原始數(shù)據(jù)根據(jù)顆粒閾值進(jìn)行篩選后，得到溶解態(tài)離子信號及顆粒信號，前者結(jié)合離子溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到離子濃度，后者經(jīng)傳輸效率與離子信號強(qiáng)度計(jì)算出納米顆粒的數(shù)量濃度、質(zhì)量濃度與粒徑分布。其中，傳輸效率為到達(dá)檢測器的樣品量占引入量的比例，通常是基于標(biāo)準(zhǔn)納米顆粒計(jì)算得到的。該過程假設(shè)所有納米顆粒為球形，所得粒徑即為等效球體直徑。如前文所述， sp-ICP-MS 無法分辨顆粒元素組成，因此若已知納米顆粒成分，可手動(dòng)設(shè)定其組成與密度，否則默認(rèn)按照單質(zhì)納米顆粒進(jìn)行計(jì)算。

數(shù)據(jù)處理可在專用或通用的數(shù)據(jù)處理平臺(tái)上進(jìn)行。由于研究場景及需求不同，實(shí)際樣本復(fù)雜多樣，目前可用于sp-ICP-MS 數(shù)據(jù)處理的平臺(tái)及方法非常多，有儀器供應(yīng)商提供的數(shù)據(jù)處理軟件，如安捷倫（Agilent， USA）的ICP-MS MassHunter、鉑金埃爾默（PerkinElmer，USA）的Syngistix^TM Nano ApplicationModule和譜育科技（中國）的單顆粒數(shù)據(jù)處理專用軟件等；也有研究人員基于Matlab 等自行開發(fā)靈活的數(shù)據(jù)處理程序，或根據(jù)經(jīng)驗(yàn)在常規(guī)的Excel 和Origin 等軟件上手動(dòng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理[53]。

2.5 顆粒檢出限

sp-ICP-MS 數(shù)據(jù)處理的算法開發(fā)和優(yōu)化主要集中于顆粒信號鑒別算法以及顆粒信號的積分算法。sp-ICP-MS 方法中離子信號和顆粒信號的區(qū)分對于后續(xù)的顆粒濃度與粒徑分布計(jì)算至關(guān)重要，是影響生物樣品中AgNPs 檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的主要因素。以顆粒的最小信號強(qiáng)度（CPS）為粒子檢測閾值，其對應(yīng)的顆粒粒徑稱為顆粒檢出限。

sp-ICP-MS 粒子檢測閾值的確定主要是根據(jù)信號強(qiáng)度，目前，不同領(lǐng)域和不同研究中沒有統(tǒng)一的表達(dá)公式。其中，應(yīng)用最廣泛的方法是迭代計(jì)算，以粒子檢測閾值= 樣品離子信號均值+ n（3～8）倍離子基線標(biāo)準(zhǔn)差（σ）區(qū)分粒顆粒與離子信號[6，54-55]。因此，采用顆粒信號判別方法時(shí)， n 越大，粒徑檢出限越高。多數(shù)研究者認(rèn)為，高于離子基線5σ是比較合理的顆粒信號[56-57]。然而，也有研究認(rèn)為， 5σ對顆粒的估計(jì)依然過于保守，可能造成顆粒假陽性，結(jié)果不可靠[15]。對于AgNPs，顆粒檢出限通常在20～35 nm 范圍內(nèi)，尺寸線性范圍為20～150 nm[23，37，46，58]。

另外，也有研究人員通過其它外在的技術(shù)手段與sp-ICP-MS 聯(lián)用，優(yōu)化檢測中的離子和顆粒分離效果。例如，毛細(xì)管電泳（Capillary electrophoresis， CE）也可用于提高sp-ICP-MS 對粒子數(shù)量濃度的定量分析能力，已有研究發(fā)現(xiàn)其能夠有效分離混合物中的20、40 和60 nm 的AgNPs，其檢出限可達(dá)到亞μg/L[52]。Hadioui 等[59]基于AgNPs 和銀離子，開發(fā)了一種將離子交換柱（Ion exchange column， IEC）與sp-ICP-MS 在線耦合，通過去除待測物中的銀離子達(dá)到更低的AgNPs 粒徑檢出限的新方法。Jiang 等[60]將在線中空纖維超濾（Hollow fiber ultrafiltration， HFUF）與sp-ICP-MS 聯(lián)用，去除樣本中的溶解態(tài)金屬離子，而將納米顆粒保留。該方法可顯著降低離子基線，優(yōu)化離子和顆粒的分離效果，加強(qiáng)對樣本中金屬納米顆粒的尺寸表征。該研究已經(jīng)證明HFUF 可將納米金顆粒的粒徑的檢出限從28.3 nm 降至14.2 nm， 該技術(shù)有望應(yīng)用于生物組織中的AgNPs 檢測。

此外，需要注意的是，目前數(shù)據(jù)處理方法優(yōu)化的研究主要是以AuNPs 為實(shí)驗(yàn)材料，用于AgNPs 分析檢測時(shí)，應(yīng)考慮到二者性質(zhì)不同可能帶來的差異性[15，40]。

3 總結(jié)與展望

sp-ICP-MS 技術(shù)以其獨(dú)特的低檢出限、高靈敏度、小樣本量、快速高效以及可同時(shí)實(shí)現(xiàn)離子和顆粒檢測等優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于生物組織中AgNPs 的分析檢測?，F(xiàn)有的生物組織檢測前處理方法可能在一定程度上限制了sp-ICP-MS 的應(yīng)用，組織中銀顆粒的提取及分離方法仍需不斷發(fā)展和完善。

雖然sp-ICP-MS 在復(fù)雜基質(zhì)中AgNPs 的檢測上具有獨(dú)特的優(yōu)勢，并且已經(jīng)取得了較多的研究成果，但具體實(shí)施方案仍不成熟。為進(jìn)一步提高生物組織中AgNPs 的sp-ICP-MS 檢測的準(zhǔn)確性，可以從以下3 個(gè)方面進(jìn)行改進(jìn)。（1）在前處理過程中需要盡量避免干擾。合理設(shè)置空白對照組和陽性對照組，對于不同的組織分別進(jìn)行方法驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，并在結(jié)果中加以報(bào)告，這不僅是為了避免前處理過程中銀顆粒的形態(tài)變化、保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，也便于不同研究結(jié)果之間的比較。酶提取法相對更穩(wěn)定，不易產(chǎn)生干擾，對于多種基質(zhì)，尤其是動(dòng)物組織的應(yīng)用有待進(jìn)一步開發(fā)和優(yōu)化。（2）電鏡驗(yàn)證作為sp-ICP-MS 結(jié)果的補(bǔ)充是非常必要的。（3）對于顆粒較小的樣本，可考慮通過與其它器件聯(lián)用，在進(jìn)樣前降低離子背景信號以實(shí)現(xiàn)更好的分離和檢測效果。

生物組織中其它金屬納米顆粒的檢測也可考慮參照此方案進(jìn)行優(yōu)化。另外， sp-ICP-MS 方法本身存在一定的局限性，因此，為了提供更準(zhǔn)確全面的信息，應(yīng)視情況配合使用多種技術(shù)手段。盡管sp-ICP-MS已不是新興技術(shù)，但從方法優(yōu)化的角度，該方法在現(xiàn)有基礎(chǔ)上仍有很大的發(fā)展空間。隨著分析方法的不斷優(yōu)化， sp-ICP-MS 技術(shù)未來有望提供更準(zhǔn)確的信息，為推動(dòng)環(huán)境科學(xué)、納米科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域研究的發(fā)展提供有力工具。