慢性鼻竇炎小鼠建模研究進(jìn)展

【摘要】 慢性鼻部炎癥如鼻炎、鼻竇炎是一類常見(jiàn)慢性疾病，長(zhǎng)期影響人們的生活質(zhì)量，其發(fā)病原因和致病機(jī)制仍尚不明確，動(dòng)物模型的構(gòu)建是探尋致病機(jī)制有效途徑，其中小鼠慢性鼻部炎癥模型的建立在近幾年得到快速發(fā)展。本綜述旨在總結(jié)國(guó)內(nèi)外小鼠慢性鼻竇炎、過(guò)敏性鼻炎建模情況，特別是嗜酸性粒細(xì)胞性慢性鼻竇炎小鼠模型的進(jìn)展，這對(duì)于開(kāi)發(fā)防治慢性鼻部炎癥的新藥或進(jìn)一步闡明其發(fā)病機(jī)制均有重要作用。

【關(guān)鍵詞】 小鼠模型；嗜酸性粒細(xì)胞；鼻息肉；慢性鼻竇炎；過(guò)敏性鼻炎

Research progress in the establishment of mouse models of chronic rhinosinusitis

CHEN Yuan， SHEN Yang， WANG Ji， LU Tao， ZHENG Bowen， YANG Yucheng

（Department of Otolaryngology， the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University， Chongqing 400016， China）

Corresponding author： YANG Yucheng， E-mail： yychxh@163.com

【Abstract】 Chronic nasal inflammation， such as rhinitis and sinusitis， is a common chronic disease that affects people’s quality of life for a long period of time. Its pathogenesis and mechanism are still unclear. The establishment of animal models is an effective approach to explore the pathogenesis， among which the establishment of mouse models of chronic nasal inflammation has been rapidly developed in recent years. The aim of this review is to summarize the research status of chronic rhinosinusitis and allergic rhinitis modeling in mice at home and abroad， especially the progress in eosinophilic chronic rhinosinusitis mouse models， which plays an important role in the development of new drugs to prevent and control chronic nasal inflammation or further elucidation of its pathogenesis.

【Key words】 Mouse model； Eosinophil； Nasal polyps； Chronic rhinosinusitis； Allergic rhinitis

慢性鼻竇炎是常見(jiàn)的慢性疾病之一，流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明，我國(guó)人群慢性鼻竇炎總體患病率為8%，略低于歐洲（10.9%）和美國(guó)（12%～14%）［1-3］。慢性鼻竇炎在臨床上被定義為鼻或鼻竇和黏膜的局部炎癥，主要癥狀為鼻塞、流涕、嗅覺(jué)喪失和面部疼痛，持續(xù)至少12周。其發(fā)病機(jī)制主要包括先天性鼻上皮屏障功能障礙、黏膜纖毛清除功能受損、免疫系統(tǒng)紊亂和病原體入侵等。動(dòng)物模型的構(gòu)建是模擬疾病的有效途徑，因此眾多學(xué)者致力于尋找一種能替代該疾病的動(dòng)物模型，在基于飼養(yǎng)條件、飼養(yǎng)周期、飼養(yǎng)空間、藥品試劑以及疾病分子和基因水平上的研究需要，小鼠疾病模型的構(gòu)建是最優(yōu)選擇。從解剖方面看，小鼠的鼻竇結(jié)構(gòu)與人類鼻竇結(jié)構(gòu)有差異，但從鼻黏膜上皮細(xì)胞來(lái)看，小鼠的鼻黏膜上皮與人類是相同的，因此可以通過(guò)小鼠來(lái)展現(xiàn)人類慢性鼻竇炎患病過(guò)程中鼻上皮黏膜的損傷與修復(fù)的變化［3］。

在目前已有文章使用的慢性鼻竇炎動(dòng)物模型中，主要是用小鼠、大鼠、兔和羊進(jìn)行建模，建模方法包括滴鼻、腹腔注射、霧化吸入、手術(shù)填塞等，建模時(shí)間各有長(zhǎng)短，其中小鼠是使用次數(shù)最多、方法最簡(jiǎn)便、最經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的一種模型。慢性鼻竇炎伴鼻息肉（chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP）按照細(xì)胞學(xué)分型主要分為中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、漿細(xì)胞浸潤(rùn)為主的類型以及混合型。在之前綜述中主要是對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)模型的方法概括，但對(duì)于其他炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)以及過(guò)敏性鼻炎的模型構(gòu)建方法的總結(jié)相對(duì)缺乏，因此在本文中，我們歸納整理了目前幾種用小鼠來(lái)構(gòu)建慢性鼻竇炎模型的方法、周期、結(jié)果和意義，著重探討小鼠慢性鼻竇炎模型構(gòu)建的方法和使用試劑的多樣性，同時(shí)對(duì)目前近十年已有文獻(xiàn)報(bào)道小鼠鼻竇炎伴或不伴息肉模型建模方法進(jìn)行簡(jiǎn)要概述，旨在為目前慢性鼻竇炎小鼠模型提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源

檢索數(shù)據(jù)庫(kù)：外文數(shù)據(jù)庫(kù)包括PubMed、Web of Science、Embase、The Cochrane Library；中文數(shù)據(jù)庫(kù)包括中國(guó)生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)服務(wù)系統(tǒng)、中國(guó)知網(wǎng)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù)（CNKI）、萬(wàn)方數(shù)字化期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù)、中國(guó)科技期刊數(shù)據(jù)庫(kù)（維普）數(shù)據(jù)庫(kù)。

檢索文獻(xiàn)時(shí)限：2013年1月至2023年12月。

檢索文獻(xiàn)類型：研究性論文。

檢索詞：采用主題詞方式進(jìn)行檢索，外文數(shù)據(jù)庫(kù)以PubMed為例，英文檢索詞為model of chronic sinusitis、nasal polyps、model of mouse；中文數(shù)據(jù)庫(kù)以CNKI為例，中文檢索詞為慢性鼻竇炎模型、息肉模型、小鼠建模。

檢索策略：以CNKI和PubMed為例，檢索公式分別如下：

#1慢性鼻竇炎模型

#2息肉模型

#3小鼠建模

#4 #1 AND #2

#5 #2 AND #3

#1 model of chronic sinusitis

#2 nasal polyps

#3 model of mouse

#4 #1 AND #2

#5 #2 AND #3

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①文章標(biāo)題或摘要與主題詞相關(guān)；②文章內(nèi)容涉及小鼠鼻息肉建模相關(guān)研究；③發(fā)表于權(quán)威雜志的文章；④研究?jī)?nèi)容完整充實(shí)，論點(diǎn)論據(jù)可靠可信。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①研究?jī)?nèi)容與本專業(yè)疾病無(wú)關(guān)；②綜述或meta分析類型文章，檢索流程見(jiàn)圖1。

2 結(jié) 果

2.1 鼻息肉

CRSwNP是一種多因素異質(zhì)性疾病，已知細(xì)菌超抗原等多種病原體可導(dǎo)致該病的發(fā)生，息肉樣病變常被定義為上皮增厚剝脫、基底膜增厚、腺體增生、間質(zhì)水腫、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)［4］?，F(xiàn)國(guó)際最常用表型分型即依據(jù)癥狀、內(nèi)鏡檢查以及鼻竇CT結(jié)果將CRS分為2種主要表型：①CRSwNP，通常具有嗜酸性粒細(xì)胞成分；②慢性鼻竇炎不伴鼻息肉（chronic rhinosinusitis nasal polyps，CRSsNP）。在日本難治性嗜酸性粒細(xì)胞性慢性鼻竇炎流行病學(xué)調(diào)查研究中，通過(guò)在400倍顯微鏡下對(duì)鼻息肉進(jìn)行組織學(xué)檢查，嗜酸性粒細(xì)胞性鼻息肉（eosinophilic chronic rhinosinusitis with nasal polyps，ECRSwNP）的診斷標(biāo)準(zhǔn)：3個(gè)視野中嗜酸性粒細(xì)胞的平均數(shù)≥70［5］。ECRSwNP主要表現(xiàn)為2型免疫反應(yīng)，伴隨免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）、白介素（interleukin，IL）-4、IL-5、IL-13、IL-25、IL-33、胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（thymicstromal lymphopoietin，TSLP）水平升高，以及嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)增多［6-7］。

鼻息肉即良性炎性包塊，起源于鼻竇和鼻黏膜的任何部分，可導(dǎo)致慢性鼻塞。這些息肉被認(rèn)為是慢性鼻竇炎的一個(gè)亞組，臨床診斷是根據(jù)鼻腔中的息肉顯影和超過(guò)3個(gè)月的鼻腔鼻竇癥狀［8］。鼻黏膜顯示組織學(xué)重塑，有上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和纖維蛋白沉積以及杯狀細(xì)胞增生［9-10］。CRSwNP的特征是繼發(fā)于輔助性T細(xì)胞（T helper cell，Th）2型的免疫反應(yīng)，包括嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和Th2型細(xì)胞炎癥因子的過(guò)度表達(dá)［11］。相比之下，在亞洲患者中，常出現(xiàn)的是與Th1型和Th17型反應(yīng)相關(guān)的中性粒細(xì)胞鼻息肉，主要和基質(zhì)金屬蛋白酶-7（matrix metalloproteinase 7，MMP-7）、MMP-9有關(guān)［12-13］。但有文獻(xiàn)顯示ECRSwNP臨床癥狀更為嚴(yán)重，按照指南治療3年內(nèi)復(fù)發(fā)率高，對(duì)患者生活質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)造成嚴(yán)重影響，且我國(guó)慢性鼻竇炎有朝Th2型炎癥轉(zhuǎn)換的趨勢(shì)［1］。

鼻息肉的形成是個(gè)體易感性和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果［14-15］，目前我國(guó)新版指南所推薦的針對(duì)CRSwNP的治療手段主要為以手術(shù)治療為主的綜合治療，總體療效尚可，但不乏療效不佳的患者，據(jù)報(bào)道，CRSwNP術(shù)后半年的總體復(fù)發(fā)率為35%，術(shù)后1年為38%［16-17］。從患者自身的角度，復(fù)發(fā)原因與患者的炎癥類型、變應(yīng)性體質(zhì)、細(xì)菌生物膜及環(huán)境因素等有關(guān)；從醫(yī)師角度，與藥物治療是否準(zhǔn)確、充分、手術(shù)方式的選擇是否合理，術(shù)中、術(shù)后處理是否恰當(dāng)有關(guān)，其根本原因在于CRSwNP致病因素混雜，患者存在較大的異質(zhì)性，而我們目前對(duì)其認(rèn)識(shí)有限，治療手段相對(duì)比較均一。

鼻黏膜是人體與外界環(huán)境直接接觸的器官，是宿主抵御病原體的重要組成部分，是人體的第一道防御屏障，鼻黏膜表面定植的細(xì)菌群落對(duì)宿主健康有深遠(yuǎn)影響，鼻腔正常菌群在抵抗病原菌侵襲、維護(hù)人體與微生物之間的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，鼻腔菌群的失衡與多種疾病的發(fā)生關(guān)系密切，但其中關(guān)鍵菌群標(biāo)志物在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制有待闡明。

小鼠模型鼻息肉的形成主要是通過(guò)2種途徑實(shí)現(xiàn)的。一種方法是在缺氧誘導(dǎo)因子、炎癥因子等多種因素的作用下，細(xì)胞外基質(zhì)分泌增加，鼻黏膜增厚受損并脫落進(jìn)入竇腔，鼻竇黏膜與浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞聚集形成組織團(tuán)塊，在增生的基底膜環(huán)包下重塑形成鼻息肉。另一種方法是鼻黏膜受反復(fù)的炎癥刺激，局部組織增殖和隆起，進(jìn)而發(fā)展為息肉。鼻息肉形成標(biāo)準(zhǔn)包括黏膜厚度增加、腺體結(jié)構(gòu)增生、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、局部有明顯突起呈息肉樣病變。因此造模要求理想的動(dòng)物模型應(yīng)該滿足以下要求：①?zèng)]有直接損害竇腔；②符合鼻源性鼻竇炎的病理生理要求；③這些模型復(fù)制來(lái)的鼻竇炎具有向其他鼻竇侵犯的能力；④在病理學(xué)上具有炎癥分期分級(jí)的征象；⑤方法簡(jiǎn)便，造模成功率高［3］。

2.2 中性粒細(xì)胞性慢性鼻竇炎伴鼻息肉小鼠模型的建立

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是細(xì)菌內(nèi)毒素的主要化學(xué)成分之一，是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的基本成分，位于其細(xì)胞壁的外層。LPS除了其毒性作用外，還可以通過(guò)Toll樣受體（toll-like receptor，TLR）4識(shí)別和信號(hào)傳導(dǎo)，是免疫系統(tǒng)的強(qiáng)效激活劑。已知LPS可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的氣道炎癥和促進(jìn)局部中性粒細(xì)胞聚集，一些研究已經(jīng)使用小鼠模型報(bào)道了LPS可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。Kim等［18］通過(guò)在大鼠鼻腔中滴注LPS建立慢性鼻竇炎動(dòng)物模型，連續(xù)滴鼻4 d后，觀察到大鼠鼻竇黏膜明顯增厚。Wang等［19］通過(guò)鼻內(nèi)持續(xù)滴注LPS建立了中性粒細(xì)胞性鼻息肉模型，表明TLR4信號(hào)通路可促進(jìn)Th1和Th17相關(guān)反應(yīng)的增強(qiáng)［20］。TLR4已被證明在調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的遷移、活化和壽命中起關(guān)鍵作用［21-22］。盡管中性粒細(xì)胞性鼻息肉與多種細(xì)菌感染有關(guān)，但難治性鼻息肉已被證實(shí)與革蘭陰性菌感染密切相關(guān)，且革蘭陰性菌釋放的內(nèi)毒素和LPS被認(rèn)為是重要的致病機(jī)制［23］。

聚肌苷酸：聚胞苷酸［poly（I： C）］是一種人工合成的病毒類似物，主要通過(guò)啟動(dòng)TLR3信號(hào)通路，在抗病毒免疫的啟動(dòng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在Clarke等［24］研究中顯示哮喘小鼠模型引起以中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主的炎癥。Bae等［25］在鼻炎小鼠模型的建立中使用poly（I： C）觸發(fā)了中性粒細(xì)胞性炎癥。Wee等［26］的研究探討了細(xì)菌和病毒來(lái)源的LPS和poly（I： C）是否影響中性粒細(xì)胞性鼻息肉的形成，為L(zhǎng)PS 與TLR4串聯(lián)、IL-17表達(dá)和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)之間的關(guān)系提供進(jìn)一步的支持證據(jù)。

2.3 嗜酸性粒細(xì)胞性慢性鼻竇炎伴鼻息肉小鼠模型的建立

有研究報(bào)道，67%的CRSwNP患者鼻腔定植金黃色葡萄球菌，在幾乎一半的鼻息肉組織勻漿中發(fā)現(xiàn)了抗金黃色葡萄球菌腸毒素的特異性IgE［27］。金黃色葡萄球菌被認(rèn)為是人鼻黏膜上皮細(xì)胞中重要的炎癥誘導(dǎo)劑，其分泌的5種毒素作為超抗原可放大免疫反應(yīng)，激活TLR2，將炎癥向Th2型轉(zhuǎn)變，這種炎癥類型的主要病理變化為嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和活化。嗜酸性粒細(xì)胞呈圓形，胞質(zhì)內(nèi)充滿粗大、均勻、略帶折光性的嗜酸性粒細(xì)胞顆粒，可以被蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosinstaining，HE）染色染成橘紅色，細(xì)胞核常分為2～3葉，呈凹形或腎形，著色較淺。金黃色葡萄球菌腸毒素B型（Staphylococcus aureus enterotoxin B，SEB）是金黃色葡萄球菌分泌的一種內(nèi)毒素，與主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ類和T細(xì)胞受體結(jié)合來(lái)激活免疫系統(tǒng)，造成T細(xì)胞的激活和促炎因子的全身釋放。煙曲霉菌是另一種致病抗原，誘導(dǎo)鼻腔鼻竇上皮細(xì)胞釋放IL-33，增強(qiáng)Th2型炎癥［28］。

Yoon等［29］的研究證明SEB還參與ECRSwNP患者上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)、活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生、線粒體功能的破壞和鼻上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化。Kim等［30］報(bào)道SEB通過(guò)激活TLR2導(dǎo)致IL-6和IL-8的產(chǎn)生。在Didehdar等［31］的研究中，SEB可能誘導(dǎo)與鼻竇炎相關(guān)的低氣道高敏感個(gè)體產(chǎn)生持續(xù)的Th2反應(yīng)，Th2極化的細(xì)胞因子如IL-4可觸發(fā)漿細(xì)胞產(chǎn)生IgE。隨后，IgE覆蓋的嗜酸性粒細(xì)胞可以與SEB結(jié)合并導(dǎo)致陽(yáng)離子蛋白的釋放、嗜酸性粒細(xì)胞脫顆粒和局部嗜酸性炎癥。為此，有研究報(bào)道ECRSwNP患者中嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白與抗原特異性IgE呈正相關(guān)［32］。以往的研究顯示金黃色葡萄球菌在中國(guó)人群的鼻腔中有定植，并且在Cheng等［33］發(fā)表的一項(xiàng)研究中，所有36例CRSwNP患者的鼻腔組織（鼻甲和息肉）中SEB水平均顯著增加。在Cheng等［34］的研究中，嗜酸性粒細(xì)胞性CRSwNP和非嗜酸性粒細(xì)胞性CRSwNP組織與正常上皮組織相比，均觀察到總IgE、SEA和SEB的增加。Okano等［35］發(fā)現(xiàn)將SEB作用于鼻息肉細(xì)胞時(shí)，IL-5和IL-13等細(xì)胞因子水平都有上升，這些細(xì)胞因子募集嗜酸性粒細(xì)胞，管理嗜酸性粒細(xì)胞的分化，引起嗜酸性粒細(xì)胞性炎癥。Khalmuratova等［36］使用3%卵清蛋白（ovalbumins，OVA）加用10 ng SEB作用于BALB/C

小鼠來(lái)建立ECRSwNP，與使用相同劑量磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）的對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組顯示黏膜增厚并伴有息肉樣病變，破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞以及竇壁的不規(guī)則增厚。Rouyar等［37］研究證明連續(xù)使用22周SEB加屋塵螨會(huì)誘導(dǎo)小鼠的Th2型炎癥反應(yīng)，并且通過(guò)食物埋藏試驗(yàn)證明影響了未成熟嗅覺(jué)神經(jīng)元但不影響嗅覺(jué)。Martens等［27］使用SEB對(duì)小鼠鼻部進(jìn)行刺激，觀察到了鼻黏膜上皮屏障功能的損害，并降低了緊密連接蛋白1 （zona occludens1，ZO-1）和閉合蛋白（occludin，OCLN）mRNA的表達(dá)。金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的腸毒素不僅可以誘導(dǎo)特異性IgE，還可以作為超抗原，促進(jìn)T細(xì)胞釋放Th2型細(xì)胞因子［38］。Shin等［39］在ECRSwNP患者中發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia inducible factor 1，HIF-1）高表達(dá)，并用SEB建立的ECRSwNP模型驗(yàn)證了HIF-1 通路通過(guò)誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)了鼻息肉的發(fā)生，提出了HIF-1抑制劑或HIF-1通路可能成為治療和預(yù)防嗜酸性粒細(xì)胞性慢性鼻竇炎的潛在靶點(diǎn)。

Kagoya等［40］使用卡泊三醇（calcipotrol，MC903）維生素D3的類似物，在19 d內(nèi)建立了ECRSwNP小鼠模型，在此模型中嗜酸性粒細(xì)胞和M2巨噬細(xì)胞都有增加，IL-4、IL-5、IL-13、TSLP等炎癥因子都有顯著升高，趨化因子11（chemokine CC-motif ligand 11，CCL11）和CCL24的表達(dá)也升高。同時(shí)，在ECRSwNP小鼠模型中觀察到嗅覺(jué)上皮變薄和成熟嗅覺(jué)感覺(jué)神經(jīng)元減少。

總而言之，我們可以合理推測(cè)金黃色葡萄球菌分泌的SEB可能在ECRSwNP的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，并且SEB主要誘導(dǎo)Th2型炎癥，調(diào)節(jié)Th2型炎癥因子的產(chǎn)生，通過(guò)抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，增強(qiáng)嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞功能來(lái)?yè)p傷和重塑組織［41］。前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）可以調(diào)節(jié)原代鼻上皮細(xì)胞對(duì)SEB刺激后嗜酸性粒細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子/趨化因子的產(chǎn)生［42］。SEB破壞上皮細(xì)胞的完整性，抑制ZO-1和Occludin的表達(dá)，而殼聚糖-葡聚糖凝膠、PGE2、地塞米松和鈣通道阻滯劑等抗炎劑可以抑制SEB誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子，發(fā)揮抗炎作用［27］。

2.4 變應(yīng)性鼻炎小鼠模型的建立

由于變應(yīng)性鼻炎確切的發(fā)病機(jī)制不明，建立能夠更好模擬人類變應(yīng)性鼻炎的動(dòng)物模型有助于研究工作的開(kāi)展及深入。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)用不同的變應(yīng)原建立了多種穩(wěn)定可靠的變應(yīng)性鼻炎的動(dòng)物模型，如Tofukuji等［43］使用特異性過(guò)敏原免疫療法花粉病來(lái)構(gòu)建小鼠過(guò)敏性鼻炎模型，該模型可有效模擬人類疾病。Takahashi等［44］用OVA建立了過(guò)敏性鼻炎的小鼠模型，國(guó)內(nèi)也有用蒿屬花粉變應(yīng)原、蛔蟲變應(yīng)原、豚草花粉變應(yīng)原等建立過(guò)敏性鼻炎動(dòng)物模型的報(bào)道。用OVA激發(fā)小鼠造模已是一種被國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛采取相當(dāng)成熟的方法。因此選用OVA作為變應(yīng)原，行腹腔注射致敏，滴鼻激發(fā)，建立小鼠過(guò)敏性鼻炎模型，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)證明致敏效果良好。

小鼠變應(yīng)性鼻炎模型的鼻黏膜組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為光鏡下可見(jiàn)鼻黏膜水腫，黏膜下血管擴(kuò)張，腺體增生，黏膜固有層見(jiàn)大量嗜酸性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，纖毛有脫落現(xiàn)象，其與人類變應(yīng)性鼻炎的病理學(xué)表現(xiàn)相似。激發(fā)后鼻黏膜中嗜酸性粒細(xì)胞比例增高明顯。嗜酸性粒細(xì)胞在鼻黏膜內(nèi)聚集和激活后，釋放白三烯和血小板凝集因子，引起肥大細(xì)胞釋放組胺和趨化因子，吸引更多的嗜酸性粒細(xì)胞聚集，形成一種周而復(fù)始的持續(xù)性炎癥反應(yīng)，這種病理變化與人類季節(jié)性變應(yīng)性鼻炎花粉癥的速發(fā)相和遲發(fā)相反應(yīng)相似。

小鼠鼻炎模型建模見(jiàn)表1。

3 小鼠鼻竇炎模型結(jié)果檢測(cè)

3.1 蘇木精-伊紅染色

HE染色法是石蠟包埋后切片常用的染色方法。蘇木精染液為堿性，主要使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核酸著紫藍(lán)色，伊紅染液為酸性染料，主要使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色。在HE染色的小鼠頭顱切片組織中，可以觀察到上皮黏膜形態(tài)與分布，從外到內(nèi)分別為纖毛層、杯狀細(xì)胞層、上皮細(xì)胞層和基底層以及包裹在中心的骨骼組織。在Th2型炎癥誘導(dǎo)的慢性鼻竇炎伴息肉中就有嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，嗜酸性粒細(xì)胞的計(jì)數(shù)也常用于對(duì)這類疾病進(jìn)行分類，若一個(gè)高倍視野下的嗜酸性粒細(xì)胞個(gè)數(shù)超過(guò)總炎癥細(xì)胞的10%則為ECRSwNP［5］，也是較非ECRSwNP更為嚴(yán)重的一個(gè)類型，其臨床癥狀更加嚴(yán)重，治療后也有更高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，因此區(qū)分ECRSwNP和非ECRSwNP是為了更好地為患者提供有效的治療和恰當(dāng)?shù)念A(yù)后，取病理組織做HE染色則是簡(jiǎn)便易行的操作流程，也是組織學(xué)、病理學(xué)與科研中最基本、使用最廣泛的技術(shù)方法。在HE染色中，嗜酸性粒細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞核紫色分葉狀，嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)與機(jī)體發(fā)揮過(guò)敏反應(yīng)和防御寄生蟲的作用，在小鼠鼻息肉模型建立中，HE染色也呈現(xiàn)跟人鼻息肉一樣的特征變化。

3.2 過(guò)碘酸雪夫染色

過(guò)碘酸雪夫染色（periodic acidc shiff，PAS）是糖原染色，通常染糖原時(shí)會(huì)與酸性黏多糖產(chǎn)生反應(yīng)呈藍(lán)色，與中性多糖不反應(yīng)。PAS染色可用于糖原的鑒定和黏液的顯示，在研究中常被用來(lái)觀察杯狀細(xì)胞的黏液物質(zhì)，計(jì)數(shù)杯狀細(xì)胞的數(shù)量［19］。杯狀細(xì)胞是上皮的屏障細(xì)胞，鼻息肉的形成常伴有杯狀細(xì)胞和黏液細(xì)胞的增殖，因此在小鼠鼻竇炎鼻息肉模型中染色杯狀細(xì)胞可以更直觀地展現(xiàn)上皮的變化。

3.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunoso-rbent assay，ELISA）通過(guò)抗原或抗體的固相化來(lái)量化樣品中特定目標(biāo)分子的含量，ELISA常用于檢測(cè)包括血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、尿液、唾液或其他液體樣本，ELISA在小鼠鼻竇炎鼻息肉模型中常用于檢測(cè)鼻腔灌洗液中的炎癥因子水平，同時(shí)與實(shí)驗(yàn)干預(yù)組和人類鼻腔灌洗液中炎癥因子水平進(jìn)行對(duì)比。使用導(dǎo)管從小鼠氣管開(kāi)口的后方插入，收集鼻腔灌洗液至少1 mL用于ELISA檢測(cè)，檢測(cè)指標(biāo)包括纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor，TGF-β）、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17等各種炎癥因子的水平以及血清總IgE。

3.4 天狼星紅染色

嗜酸性粒細(xì)胞是炎癥細(xì)胞之一，在變態(tài)反應(yīng)疾病中發(fā)揮作用，嗜酸性粒細(xì)胞質(zhì)中含次級(jí)顆粒，這種顆粒中主要含有堿性蛋白，比如嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子、嗜酸性粒細(xì)胞衍生神經(jīng)素、嗜酸性粒細(xì)胞過(guò)氧化物酶等，這些次級(jí)顆?？梢员粔A性染料著色。天狼星紅染色法可以將嗜酸性粒細(xì)胞胞質(zhì)染成紅色，核呈藍(lán)色，相比于HE染色著色更加強(qiáng)烈，對(duì)比更加明顯，更容易區(qū)分組織中其他炎癥細(xì)胞。因此很多研究者都曾使用天狼星紅染色評(píng)估嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，如Rouyar等［37］使用天狼星紅染色法對(duì)小鼠建模組織進(jìn)行染色，觀察到了明顯的紅色細(xì)胞質(zhì)的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。

3.5 免疫熒光與免疫組化

免疫熒光是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗體（或抗原），從而確定目標(biāo)蛋白的性質(zhì)、定位以及定量。通過(guò)對(duì)石蠟切片進(jìn)行烤片、脫蠟復(fù)水、洗滌、抗原修復(fù)、一抗二抗孵育等步驟來(lái)制作熒光切片，檢測(cè)目的蛋白的含量與表達(dá)。Ryu等［49］使用小鼠鼻竇部分石蠟切片做了免疫熒光與免疫組化，證實(shí)了IL-17A和白細(xì)胞分化抗原68 （cluster of differentiation 68，CD68）細(xì)胞計(jì)數(shù)的高表達(dá)差異。

3.6 蛋白免疫印跡

蛋白免疫印跡法（western blotting，WB）是電泳分離后的蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到酸纖維素膜（nitrocellulose membrane，NC）或聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）上，然后通過(guò)特異性抗體檢測(cè)某特定蛋白的技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的定量分析。通過(guò)提取小鼠鼻黏膜組織蛋白，使用WB檢測(cè)目的蛋白含量是一種十分有效且能證明觀點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)方法，Kim等［42］提取鼻腔組織蛋白進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)測(cè)量目的蛋白的表達(dá)差異性，證明白藜蘆醇不僅抑制活性氧的產(chǎn)生，還阻止炎癥介質(zhì)的釋放。

3.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real time PCR，

qPCR）是利用模板DNA經(jīng)過(guò)變性、退火和延伸3個(gè)基本反應(yīng)過(guò)程來(lái)檢測(cè)目的蛋白核酸的表達(dá)，可通過(guò)對(duì)小鼠鼻部組織進(jìn)行RNA的提取、逆轉(zhuǎn)和擴(kuò)增來(lái)確定靶基因或靶蛋白的表達(dá)水平。Kim等［45］從鼻組織中提取總RNA，使用qPCR分析發(fā)現(xiàn)CD19、CD138和膜輔蛋白的表達(dá)增高。

各檢測(cè)方法匯總表見(jiàn)表2。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

本文總結(jié)了近幾年來(lái)CRSwNP的小鼠模型建立方法和研究現(xiàn)狀，動(dòng)物模型是研究疾病發(fā)生發(fā)展的重要工具，對(duì)挖掘慢性鼻竇炎-鼻息肉疾病的形成機(jī)制有著重要作用，為針對(duì)性治療提供強(qiáng)有力的理論基礎(chǔ)。在慢性鼻竇炎小鼠模型這方面還亟待解決的問(wèn)題：目前多數(shù)文獻(xiàn)利用的慢性鼻竇炎伴或不伴鼻息肉造模方法持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月，相對(duì)于其他疾病的造模時(shí)間成本太高，不利于前期藥物的篩選及機(jī)制的驗(yàn)證。但由于鼻竇炎是慢性炎癥性疾病，如果縮短造模時(shí)間，就無(wú)法更直觀地呈現(xiàn)慢性炎癥的病理過(guò)程，所以既能呈現(xiàn)慢性炎癥又能縮短時(shí)間的動(dòng)物模型研究迫在眉睫。

慢性鼻竇炎是一種多因素異質(zhì)性疾病，眾多科學(xué)家在近年來(lái)對(duì)其進(jìn)行持續(xù)的深入研究，雖然取得了一些研究成果，提供了一部分治療的靶點(diǎn)，但慢性鼻竇炎小鼠模型在國(guó)際上仍然沒(méi)有金標(biāo)準(zhǔn)，各種造模方法均不能完全模擬人類慢性鼻竇炎病理生理變化過(guò)程。但相信隨著學(xué)術(shù)界同仁的不懈努力，動(dòng)物模型會(huì)越來(lái)越完善，具有代表性，從而接近人類慢性鼻竇炎疾病的本質(zhì)。這些模型的發(fā)展將有助于我們進(jìn)一步揭秘慢性鼻竇炎這一疾病的確切病理生理機(jī)制，為疾病的精準(zhǔn)治療及管理提供新的思路。

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（責(zé)任編輯：鄭巧蘭）