柴胡植物新品種DUS測(cè)試指南的研制

摘要：柴胡（Bupleurum chinense DC.）為傘形科柴胡屬多年生草本植物，以根入藥。柴胡生產(chǎn)中種質(zhì)混雜較為嚴(yán)重，新品種選育勢(shì)在必行。為完善柴胡植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性（Distinctness，uniformity and stability，DUS）測(cè)試指南，本試驗(yàn)收集了22份不同產(chǎn)地柴胡，對(duì)二年生與三年生柴胡基于形態(tài)學(xué)性狀開(kāi)展了DUS測(cè)試指南的研制，與原指南相比，增加了根的產(chǎn)量與含量相關(guān)的性狀，最終確定了41個(gè)測(cè)試性狀，其中包括24個(gè)必測(cè)的基本性狀，17個(gè)選測(cè)性狀；有質(zhì)量性狀0個(gè)、假質(zhì)量性狀15個(gè)和數(shù)量性狀26個(gè)；涉及到植株性狀6個(gè)、莖性狀4個(gè)、葉性狀7個(gè)、基生葉性狀7個(gè)、花性狀6個(gè)、根性狀10個(gè)、生育期性狀1個(gè)。本指南為我國(guó)柴胡性狀測(cè)試、新品種的授權(quán)提供了支撐，對(duì)柴胡新品種選育具有重大意義。

關(guān)鍵詞：柴胡；DUS；性狀

中圖分類(lèi)號(hào)：S567.79 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-0435（2024）10-3121-12

Development of DUS Test Guide for New Bupleurum Chinense Varieties

HE Long-jiao^1#， SUN Zhe^1#， FAN A-mei¹， DU Xiao-rong¹， LI Ao-xuan¹， LI Jia-jie³， SONG Yun^1，2， QIAO Yong-gang^1，2*

（1. College of Life Sciences， Shanxi Agricultural University， Taigu，Shanxi Province 030801， China; 2. Shanxi key lab.for Modernization of TCVM， Taigu， Shanxi Provinc 030801， China; 3. College of Traditional Chinese Medicine， Tianjin University of Traditional Chinese Medicine， Tianjin 301617， China）

Abstract：Bupleurum chinense DC. is a perennial herb of the genus Bupleurum in the Umbelliferae family，and its root can be used as medicine. The germplasm is seriously mixed in the production of Bupleurum chinense，and it is imperative to breed new varieties. In order to improve the DUS （Distinctness，uniformity and stability） test guidelines for Bupleurum chinense，22 samples of Bupleurum chinense from different habitats were collected in this study. The DUS test guidelines for 2-year-old and 3-year-old Bupleurum chinense were developed based on morphological traits，and the traits related to yield and content were added to prepare a more complete draft of DUS test guidelines for Bupleurum chinense medicinal plants in contrast to the original guidelines. A total of 41 traits were selected as the test traits of the DUS test guide for Bupleurum chinense，including 24 basic tested traits and 17 selected traits;there were 0 quality traits，15 false quality traits and 26 quantitative traits. It involved 6 plant traits，4 stem traits，7 leaf traits，7 basal leaf traits，6 flower traits，10 root traits，and 1 growth period trait. This guideline improves the lack of some traits and effective components in the DUS test guideline of Bupleurum chinense，which is of great significance for the breeding of new varieties of Bupleurum chinense in the future.

Key words：Bupleurum chinense；DUS；Characteristics

收稿日期：2024-02-23；修回日期：2024-04-06

基金項(xiàng)目：山西省基礎(chǔ)研究計(jì)劃自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目（20210302123390）；山西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（2024）；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新提升工程項(xiàng)目（CXGC2023041）資助

作者簡(jiǎn)介：

#何龍嬌（2000-），女，漢族，山西運(yùn)城人，碩士研究生，主要從事藥用植物遺傳學(xué)研究，E-mail：3219915173@qq.com；#孫哲（1997-），男，漢族，山西河津人，碩士研究生，主要從事藥用植物遺傳學(xué)研究，E-mail：297093122@qq.com；*通信作者Author for correspondence，Email：sxndqyg@126.com

柴胡是傘形科植物柴胡（Bupleurum chinense DC.）或狹葉柴胡（Bupleurum scorzonerifolium Willd.）的干燥根^［1］，具有鎮(zhèn)痛、抗炎抗氧化^［2］、抗抑郁^［3］、保肝、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用^［4-5］。柴胡皂苷為柴胡主要活性成分，具有抗炎、抗癲癇、抗腫瘤和護(hù)肝等功效^［6-7］。目前，在柴胡中已發(fā)現(xiàn)了超過(guò)75種柴胡皂苷^［8］，含量較高的皂苷包括皂苷a（SS-a）、皂苷b（SS-b）^［9］、皂苷c（SS-c）、皂苷d（SS-d）、皂苷e（SS-e）和皂苷f(shuō)（SS-f）^［10］。2020版《藥典》規(guī)定柴胡皂苷a（saikosaponin a，SSa）和柴胡皂苷d（saikosaponin d，SSd）在柴胡中的總量必須大于等于0.30%^［11］。

植物新品種的特異性（distinctness）、一致性（uniformity）和穩(wěn)定性（stability）（簡(jiǎn)稱(chēng)DUS）是授予植物新品種權(quán)的重要依據(jù)^［12］。我國(guó)育種工作者選育出多個(gè)柴胡新品種，賈和田等^［13］選育了‘冀柴1號(hào)’；李玉春等^［14］經(jīng)過(guò)系統(tǒng)選育、雜交育種培育出‘濟(jì)柴1號(hào)’。在新品種選育、認(rèn)定和保護(hù)過(guò)程都需要用到DUS測(cè)試指南，已發(fā)布實(shí)施的柴胡DUS測(cè)試指南存在植株生長(zhǎng)年限不明確^［15］、測(cè)試性狀不全面和化學(xué)成分相關(guān)性狀缺失的問(wèn)題，為了更好地鑒定與評(píng)價(jià)柴胡種質(zhì)，急需對(duì)柴胡DUS測(cè)試指南進(jìn)行補(bǔ)充與完善。

本試驗(yàn)以22個(gè)不同產(chǎn)地的柴胡種質(zhì)為材料，通過(guò)對(duì)二年生和三年生柴胡植株性狀以及主要化學(xué)成分性狀的觀察與測(cè)量，確定了數(shù)量性狀的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)質(zhì)量性狀與假質(zhì)量性狀賦代碼，通過(guò)補(bǔ)充完善形成了針對(duì)二年生與三年生柴胡的DUS測(cè)試指南，為柴胡的新品種的選育與保護(hù)提供DUS測(cè)試依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究收集22份不同產(chǎn)地柴胡的栽培種質(zhì)包括山西、陜西、甘肅、河北多個(gè)地區(qū)，22份柴胡種質(zhì)詳見(jiàn)表1，其中二年生柴胡共214株，三年生柴胡共197株。

1.2 DUS測(cè)試指南研制依據(jù)

根據(jù)我國(guó)《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測(cè)試指南總則》（GB/T19557.1）的要求^［16］，綜合分析我國(guó)柴胡屬植物分類(lèi)的相關(guān)技術(shù)與方法，植物便于直接觀測(cè)的表型形態(tài)特征作為優(yōu)先選擇的性狀，輔測(cè)性狀主要有生理性狀、化學(xué)成分等。

1.3 田間試驗(yàn)

2020年6月，將收集到的22份柴胡種子種植在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)申奉柴胡種質(zhì)資源圃（北緯37°25′，東經(jīng)112°25′），二年生植株性狀于2021年7-8月柴胡進(jìn)入盛花期后開(kāi)始測(cè)量，采用5點(diǎn)取樣法，每個(gè)點(diǎn)觀測(cè)2株樣本，每個(gè)樣本的觀測(cè)部位取樣數(shù)量為1，在田間對(duì)柴胡植株進(jìn)行地上部分形態(tài)特征的觀察，觀測(cè)完地上性狀后對(duì)其進(jìn)行掛牌標(biāo)記，11月地上部分枯萎后對(duì)其取根進(jìn)行地下性狀的測(cè)量。三年生植株性狀于2022年7-8月將其整株挖出開(kāi)始測(cè)量，方法同二年生。柴胡植株各生育時(shí)期及代碼見(jiàn)表2。

1.4 性狀檢測(cè)方法

柴胡地上部分性狀檢測(cè)方法：株高為植株基部到花序頂部的長(zhǎng)度，在測(cè)量時(shí)對(duì)植株進(jìn)行扶正，使用卷尺測(cè)量；葉的性狀均為觀測(cè)植株主莖中部葉片的性狀，基生葉測(cè)量時(shí)選取最大的葉片進(jìn)行測(cè)量，其中葉長(zhǎng)、葉寬采用直尺測(cè)量；莖的性狀均為觀測(cè)植株主莖距離地面第10節(jié)莖的性狀，莖粗用游標(biāo)卡尺測(cè)量，節(jié)間長(zhǎng)用直尺測(cè)量；花的性狀均為觀測(cè)植株主莖最頂端的花。葉形、葉尖形狀、葉色、莖的顏色等性狀為假質(zhì)量性狀，采用統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)目測(cè)進(jìn)行記錄。

地下性狀測(cè)量方法：根長(zhǎng)為主根的長(zhǎng)度（沒(méi)有主根的測(cè)量其最粗的根的長(zhǎng)度），使用直尺進(jìn)行測(cè)量，根粗測(cè)量部位為蘆頭下方1 cm處的粗度，使用游標(biāo)卡尺進(jìn)行測(cè)量，鮮重為根去除泥土之后的重量，干重為鮮重烘干水分后的重量，均使用電子天平進(jìn)行稱(chēng)量，根色使用比色紙進(jìn)行比對(duì)。

柴胡皂苷含量參照2020版《中國(guó)藥典》的方法進(jìn)行測(cè)定^［17］。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)品種的選擇

選擇性狀穩(wěn)定的品種作為標(biāo)準(zhǔn)品種^［18］，對(duì)所有的種質(zhì)性狀賦代碼值，篩選性狀最為均一的種質(zhì)，將該種質(zhì)的該性狀作為標(biāo)準(zhǔn)性狀。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

通過(guò)Excel計(jì)算出各數(shù)量性狀的最小值、最大值、平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，參照褚云霞等^［19］的方法對(duì)各數(shù)量性狀進(jìn)行分級(jí)，分級(jí)數(shù)是根據(jù)中值和級(jí)差而確定的。特異性與一致性的判斷通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析數(shù)量性狀數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)差（S）和變異系數(shù)（CV），穩(wěn)定性可通過(guò)分析柴胡兩個(gè)相同獨(dú)立生長(zhǎng)季節(jié)表型性狀的分布情況得出，其數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用t檢驗(yàn)^［20］。

其中：極差=最大值－最小值；

級(jí)數(shù)1=極差/（標(biāo)準(zhǔn)差平均值×2）；

級(jí)數(shù)2是級(jí)數(shù)1按照1、3、5、7、9的就小取值；

級(jí)差=極差/級(jí)數(shù)2。

式中，X為第j個(gè)性狀第i個(gè)植株的觀測(cè)值，x-為第j個(gè)性狀的平均值，n為每個(gè)性狀觀測(cè)的樣本量。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)試性狀的選擇與確定

通過(guò)查閱資料與田間實(shí)際觀察，初步選定了45個(gè)性狀作為柴胡DUS測(cè)試的候選性狀。在將觀測(cè)不便、極易受環(huán)境影響、難以描述、相關(guān)性強(qiáng)的性狀刪除后，篩選出41個(gè)性狀（表3），包括24個(gè)必測(cè)的基本性狀，17個(gè)選測(cè)性狀。其中有質(zhì)量性狀0個(gè)、假質(zhì)量性狀15個(gè)和數(shù)量性狀26個(gè)；涉及到植株性狀6個(gè)、莖性狀4個(gè)、葉性狀7個(gè)、基生葉性狀7個(gè)、花性狀6個(gè)、根性狀10個(gè)、生育期性狀1個(gè)。

2.2 數(shù)量性狀的描述與分級(jí)

2.2.1 二年生柴胡植株數(shù)量性狀的描述與分級(jí) 22個(gè)產(chǎn)地的二年生柴胡植株數(shù)量性狀的變異系數(shù)分布在14%～63%之間，性狀27（花：小苞數(shù)量）變異系數(shù)小于15%，其余性狀變異系數(shù)均大于15%，表明各性狀種間差異大。根的分支數(shù)、鮮重、干重以及柴胡皂苷含量的變異系數(shù)均大于50%，柴胡皂苷d<柴胡皂苷a<根分支數(shù)<根干重<根鮮重，表明柴胡根部性狀種間差異極大，詳見(jiàn)表4。性狀4，5，8，9，15，16，22，23，25，29，30，33分成3個(gè)連續(xù)分布的分級(jí)范圍；性狀2，3，6，17，26，27，34，35，36，37，38，39，40分成5個(gè)連續(xù)分布的分級(jí)范圍；性狀24分成7個(gè)連續(xù)分布的分級(jí)范圍，詳見(jiàn)表5。

2.2.2 三年生柴胡植株數(shù)量性狀的描述與分級(jí) 柴胡植株到盛花期基生葉絕大多數(shù)已經(jīng)枯萎，將基生葉相關(guān)的所有性狀去除。小苞數(shù)量在測(cè)試時(shí)僅有2株為6個(gè)，其余植株均為5個(gè)，變異系數(shù)為1%，特異性極低，在分級(jí)時(shí)將該性狀去除。其他性狀的變異系數(shù)分布在17%～72%之間，均大于15%，表明各性狀種間差異大。植株的叢生莖，根的分支數(shù)、鮮重、干重以及柴胡皂苷含量的變異系數(shù)均大于50%，表明柴胡根部性狀種間差異大，植株叢生莖種間差異極大，詳見(jiàn)表6。性狀2，4，5，8，16，25，26，29，30，33，35，36，37，39，40分成3個(gè)連續(xù)分布的分級(jí)范圍；性狀3，6，9，15，17，34，38分成5個(gè)連續(xù)分布的分級(jí)范圍，詳見(jiàn)表7。

2.3 假質(zhì)量性狀賦值

為了便于觀測(cè)與記錄，對(duì)假質(zhì)量性狀的每個(gè)表達(dá)狀態(tài)進(jìn)行賦代碼。根據(jù)實(shí)際觀察情況，將性狀1，7，10，11，12，14，18，19，20，21，28，41分為3個(gè)類(lèi)別，將性狀13與32分為4個(gè)類(lèi)別，性狀31分為7個(gè)類(lèi)別。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)品種的選擇

植物DUS測(cè)試指南需要標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)進(jìn)行參考，以減少不確定因素引起的差異。通過(guò)對(duì)22個(gè)產(chǎn)地柴胡性狀數(shù)據(jù)的整理，找出表達(dá)穩(wěn)定的產(chǎn)地的性狀作為標(biāo)準(zhǔn)性狀。選定CH3為性狀1收斂型的標(biāo)準(zhǔn)性狀，CH6為松散型的標(biāo)準(zhǔn)性狀；選定CH20為性狀2中的標(biāo)準(zhǔn)性狀；CH4為性狀6中的標(biāo)準(zhǔn)性狀；CH13為性狀10光滑的標(biāo)準(zhǔn)性狀；CH8為性狀11深的標(biāo)準(zhǔn)性狀；CH1為性狀13線性的標(biāo)準(zhǔn)性狀；CH3為性狀13線狀披針形的標(biāo)準(zhǔn)性狀；CH9為性狀14等于1的標(biāo)準(zhǔn)性狀；CH11為性狀15短的標(biāo)準(zhǔn)性狀；CH11為性狀18深的標(biāo)準(zhǔn)性狀；CH3為性狀20短的標(biāo)準(zhǔn)性狀；CH4為性狀26中的標(biāo)準(zhǔn)性狀；CH2為性狀32中間型的標(biāo)準(zhǔn)性狀；CH14為性狀33少的標(biāo)準(zhǔn)性狀，CH21為中的標(biāo)準(zhǔn)性狀；CH18為性狀34短的標(biāo)準(zhǔn)性狀；CH6為性狀35中的標(biāo)準(zhǔn)性狀；CH11，CH8，CH6分別為性狀41早、中、晚的標(biāo)準(zhǔn)性狀。

2.5 柴胡DUS測(cè)試指南性狀表

通過(guò)對(duì)二年生與三年生柴胡數(shù)量性狀分級(jí)，假質(zhì)量性狀賦值及標(biāo)準(zhǔn)品種選擇，繪制出柴胡植物新品種DUS測(cè)試指南性狀表，詳見(jiàn)表8。

3 討論

我國(guó)自1999年加入國(guó)際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟（UPOV）以來(lái)，植物品種的特異性、一致性和穩(wěn)定性（DUS）測(cè)試為品種保護(hù)、審定和登記等提供技術(shù)依據(jù)，在使優(yōu)良種質(zhì)得到較好保護(hù)的同時(shí)，也會(huì)促進(jìn)種質(zhì)資源開(kāi)發(fā)與利用。DUS測(cè)試中表型性狀描述是否足夠多、詳細(xì)，對(duì)品種保護(hù)也十分重要^［21］。孫建軍等^［22］以164份紫云英為材料，通過(guò)多年種植，確定了包括生長(zhǎng)習(xí)性、開(kāi)花期、越冬性等33個(gè)測(cè)試性狀。伍豐宇等^［20］對(duì)56份包括商業(yè)、栽培、穩(wěn)定品種的野牛草進(jìn)行觀測(cè)，加入花、葉性狀等28個(gè)性狀，較全面概括了野牛草的表型性狀。育種事業(yè)以及新品種不斷涌現(xiàn)的同時(shí)，許多現(xiàn)有的DUS測(cè)試部分性狀不再適用。如紀(jì)軍建等^［23］對(duì)153份谷子新品種的14個(gè)數(shù)量性狀進(jìn)行分級(jí)研究，發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有谷子測(cè)試指南中許多數(shù)量性狀的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)不再適用；賴(lài)運(yùn)平等^［24］利用現(xiàn)有玉米DUS測(cè)試指南中的基本性狀，對(duì)2020年四川省聯(lián)合體區(qū)試玉米品種的表型進(jìn)行多樣性分析，發(fā)現(xiàn)其對(duì)糯玉米和甜糯型玉米的區(qū)分效果不甚理想。

本試驗(yàn)最初篩選了45個(gè)性狀，檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)植株形態(tài)表型有直立型和匍匐生長(zhǎng)型，在田間觀察時(shí)，柴胡所有產(chǎn)地的植株均直立生長(zhǎng)；柴胡所有的莖均為空心；柴胡的花均為黃色，顏色無(wú)明顯區(qū)別，不滿(mǎn)足特異性的要求，因此將以上4個(gè)性狀刪除。柴胡總皂苷包括柴胡皂苷a和d以及其他柴胡皂苷的總和，具有極強(qiáng)的相關(guān)性，因此刪除。24個(gè)基本性狀除柴胡皂苷a和d的含量為藥用植物特別重要的性狀外，其余性狀在二年生柴胡植株和三年生柴胡植株中可直接觀察或測(cè)量，均有明顯的特征。

本指南與現(xiàn)有的柴胡與狹葉柴胡植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測(cè)試指南（NYT 2589-2014）相比，將二年生與三年生的柴胡分開(kāi)進(jìn)行DUS測(cè)試指南的研制，制定不同的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，在使用時(shí)更具有針對(duì)性。藥用植物為經(jīng)濟(jì)作物，產(chǎn)量在生產(chǎn)中很重要，將柴胡的產(chǎn)量性狀（鮮重、干重、干鮮比）列入指南，更加有利于生產(chǎn)中挑選高產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)品種。近年來(lái)有部分中藥材均有將產(chǎn)量相關(guān)的性狀加入指南中，如黃芪DUS測(cè)試指南（NYT 2592-2014）^［25］中包括單根鮮重、干重等性狀；方明雅等^［26］在菱屬DUS測(cè)試指南中加入果實(shí)鮮重及干重等性狀。同時(shí)本指南還加入了有效成分（柴胡皂苷a和柴胡皂苷d）含量，彌補(bǔ)了藥用植物測(cè)試指南中化學(xué)成分的缺失，豐富了測(cè)試指南的內(nèi)容，也體現(xiàn)了藥用植物本身的特異性。本指南中所選的標(biāo)準(zhǔn)品種的性狀在二年生和三年生植株中均穩(wěn)定表達(dá)，更具有代表性，滿(mǎn)足標(biāo)準(zhǔn)品種的要求。

本指南對(duì)性狀的完善有利于提高柴胡DUS測(cè)試的科學(xué)性，豐富了柴胡表型性狀，今后可基于表型性狀對(duì)柴胡進(jìn)行遺傳多樣性分析，促進(jìn)柴胡選種育種事業(yè)的發(fā)展。如張曉娟等^［27］對(duì)55個(gè)紫花苜蓿品種農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量性狀進(jìn)行分析及綜合評(píng)價(jià)，以提高新品種選育效率。王鳳宇等^［28］以590份燕麥營(yíng)養(yǎng)器官表型性狀進(jìn)行遺傳多樣性分析，明確燕麥各性狀之間的相關(guān)關(guān)系，進(jìn)而為燕麥育種和種質(zhì)資源創(chuàng)新利用提供理論依據(jù)。在國(guó)內(nèi)外植物新品種保護(hù)不斷發(fā)展的同時(shí)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并改進(jìn)指南中存在的問(wèn)題，需要廣大中藥材專(zhuān)家及育種工作者付出努力，共同推進(jìn)測(cè)試指南的研制。

4 結(jié)論

本研究對(duì)22份不同產(chǎn)地的柴胡通過(guò)田間種植、性狀調(diào)查及數(shù)據(jù)測(cè)定最終篩選確定了41個(gè)測(cè)試性狀，包括24個(gè)必測(cè)的基本性狀和17個(gè)選測(cè)性狀，有假質(zhì)量性狀15個(gè)和數(shù)量性狀26個(gè)，同時(shí)也篩選到了13個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品種，完善了柴胡DUS測(cè)試指南的研制。本指南的成功研制對(duì)于提高我國(guó)柴胡新品種保護(hù)，促進(jìn)選種育種事業(yè)的發(fā)展有著重要意義。

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（責(zé)任編輯 閔芝智）