菌酶復(fù)合對(duì)葡萄枝葉青貯品質(zhì)和瘤胃體外產(chǎn)氣特性的影響

收稿日期：2024-05-17；修回日期：2024-07-24

基金項(xiàng)目：吐魯番市重點(diǎn)研發(fā)專項(xiàng)“吐魯番市特色林果副產(chǎn)物飼料化微貯技術(shù)研究”；農(nóng)業(yè)農(nóng)村部國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-34）資助

作者簡(jiǎn)介：霍志偉（2000-），男，漢族，新疆沙灣人，碩士研究生，主要從事牧草生產(chǎn)與加工研究，E-mail：826047623@qq.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：zhangfanfan@shzu.edu.cn；lghdjs@163.com

摘要：本研究旨在探究聯(lián)合添加植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）與纖維素酶（cellulase）對(duì)葡萄（Vitis L.）枝葉青貯發(fā)酵品質(zhì)的改善效果，為葡萄枝葉資源飼料化利用提供依據(jù)。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)處理，CK處理（不添加任何菌劑）、PL處理（添加植物乳桿菌5×10⁵ cfu·g^-1 FM）、PLC處理（添加植物乳桿菌5×10⁵ cfu·g^-1 FM和纖維素酶0.3%FM）。發(fā)酵60 d后開袋檢測(cè)營養(yǎng)、發(fā)酵品質(zhì)和主要微生物數(shù)量，進(jìn)行體外發(fā)酵試驗(yàn)評(píng)定其產(chǎn)氣特性。結(jié)果表明：（1）相比于CK處理，PLC處理中乳酸（Lactic acid，LA）、乙酸（Acetic acid，AA）含量和乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）數(shù)量顯著增加（P<0.05），酸性洗滌纖維（Acid detergent fiber，ADF）含量和pH值、酵母菌（Yeast）和好氧細(xì)菌（Aerobic bacteria，AB）數(shù)量顯著降低（P<0.05）。（2）在青貯第60 d時(shí)PLC處理的有機(jī)物降解率、產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣速率最高。由此可見，聯(lián)合添加植物乳桿菌與纖維素酶能夠顯著改善葡萄枝葉青貯發(fā)酵品質(zhì)，減少營養(yǎng)物質(zhì)損耗，提高飼喂價(jià)值。

關(guān)鍵詞：葡萄枝葉；植物乳桿菌；纖維素酶；發(fā)酵品質(zhì)；產(chǎn)氣特性

中圖分類號(hào)：S816.53 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-0435（2024）10-3220-06

Effects of Fungal-enzyme Compound on the Quality of Vine Leaf Silage and the In vitro gas Production Characteristics of Rumen

HUO Zhi-wei¹， LI Hai-feng²， YAN Yun-feng^1，3， ZHENG Xiao-kai¹， LI Shuang-ming¹，

LIU Guo-hong^2*， ZHANG Fan-fan^1*

（1. School of Animal Science and Technology， Shihezi University， Shihezi， Xinjiang 832000， China; 2. Turpan Institute of Agricultural Science， Xinjiang Academy of Agricultural Sciences， Turpan，Xinjiang 838000， China;3. Jinzhou Vocational and Technical Education Center， Jinzhou， Hebei Province 052260， China）

Abstract：The purpose of this study was to investigate the effects of combined addition of Lactiplantibacillus plantarum and cellulase on the fermentation quality of Vitis L. branch and leaf silage，to provide a basis for the feed utilization of grape branch and leaf resources. Three treatments were set up，CK treatment （without adding any fungicide），PL treatment （adding Lactobacillus plantarum 5×10⁵ cfu·g^-1 FM），and PLC treatment （adding Lactobacillus plantarum 5×10⁵ cfu·g^-1 FM and cellulase 0.3%FM）. After 60 days of fermentation，the nutrients，fermentation quality and the number of main microorganisms were detected by opening the bag，and the gas production characteristics were evaluated by an In vitro fermentation test. The results showed that：1） Compared to the CK treatment，the contents of lactic acid，acetic acid and the number of lactic acid bacteria in PLC treatment were significantly increased （P<0.05），and the content and pH value of acid detergent fiber，yeast and aerobic bacteria were significantly decreased （P<0.05）. 2） At the 60th day of silage，the degradation rate of organic matter，gas production and gas production rate of PLC treatment were the highest. It can be seen that the combined addition of Lactobacillus plantarum and cellulase can significantly improve the fermentation quality of grape branch and leaf silage，reduce nutrient loss，and improve feeding value.

Key words：Grape branches and leaves；Lactiplantibacillus plantarum；Cellulase；Fermentation quality；In vitro gas production characteristics

新疆地區(qū)由于水資源短缺，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)模式偏向于經(jīng)濟(jì)類作物等現(xiàn)狀，導(dǎo)致飼草資源遠(yuǎn)不能滿足養(yǎng)殖需要^［1］。因此從現(xiàn)有農(nóng)果產(chǎn)業(yè)中獲取飼草資源，可以作為新疆非常規(guī)飼草產(chǎn)業(yè)發(fā)展的新方向。目前，新疆葡萄栽培面積15萬hm²，產(chǎn)量350萬噸，產(chǎn)量和面積均居全國首位，葡萄產(chǎn)業(yè)具有明顯的資源和產(chǎn)業(yè)發(fā)展優(yōu)勢(shì)^［2］。葡萄修剪主要分為入冬前和夏季修剪兩個(gè)階段，每年修剪的鮮枝條重量約200萬噸，這些枝葉往往被焚燒或粉碎還田，不僅造成資源嚴(yán)重浪費(fèi)，且對(duì)農(nóng)田生態(tài)環(huán)境造成諸多潛在危害。因此，將葡萄枝葉進(jìn)行飼料化利用，不僅能提高廢棄資源利用效率，且有利于環(huán)境保護(hù)和養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展^［3-4］，具有較大的應(yīng)用價(jià)值。

葡萄枝葉中富含蛋白質(zhì)、多糖、維生素等多種營養(yǎng)物質(zhì)；但由于纖維含量高，且修剪后存放過程中易發(fā)霉變質(zhì)，從而嚴(yán)重破壞飼料品質(zhì)，致使反芻家畜利用效率大大降低，在生產(chǎn)中不適宜直接利用^［5］。青貯是由微生物驅(qū)動(dòng)的發(fā)酵過程，其中乳酸菌起到了至關(guān)重要的作用^［6］。前人諸多研究表明，植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）和纖維素酶（cellulase）聯(lián)合添加可以顯著改善飼料營養(yǎng)價(jià)值和飼用價(jià)值^［7］。其中，在青貯玉米、苜蓿等飼草中接種植物乳桿菌，可顯著降低pH值，提高乳酸含量，進(jìn)而抑制霉菌等有害微生物活動(dòng)，減少青貯原料營養(yǎng)成分的消耗，從而提高發(fā)酵品質(zhì)^［8-10］。此外，接種不同發(fā)酵類型乳酸菌對(duì)青貯適口性和有氧穩(wěn)定性等也有增益效果^［10］。在玉米秸稈青貯飼料中添加纖維素酶，可較大程度保留玉米秸稈的粗蛋白等營養(yǎng)物質(zhì)，提高玉米秸稈青貯飼料的營養(yǎng)價(jià)值^［11］；復(fù)合纖維素酶還可以通過分解纖維素、半纖維素等物質(zhì)來增加可溶性碳水化合物的含量，從而提高底物營養(yǎng)物質(zhì)含量，促進(jìn)乳酸菌對(duì)發(fā)酵底物營養(yǎng)物質(zhì)的利用和轉(zhuǎn)化^［12］。因此，乳酸菌和纖維素酶復(fù)合添加的復(fù)合效應(yīng)得到了大多數(shù)專家學(xué)者的共識(shí)^［13］。

目前，國內(nèi)對(duì)葡萄產(chǎn)業(yè)廢棄物的利用研究大多集中在葡萄籽、葡萄皮渣方面，葡萄枝葉發(fā)酵方面的研究較少^［14］。因此，本研究通過添加植物乳桿菌和纖維素酶進(jìn)行葡萄枝葉青貯，研究其對(duì)葡萄枝葉青貯品質(zhì)的影響，為葡萄枝葉資源化利用及葡萄枝葉青貯的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選擇種植于新疆吐魯番市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所試驗(yàn)地（89°20′46″N，42°94′79″E）所種植鮮食葡萄‘無核白’的枝葉（2022年8月采集）作為青貯原料。試驗(yàn)中采用的植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum，ACCC 11016）購買自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ACCC）。纖維素酶Ⅱ（酶活≥5000 U·g^-1），粉末狀，購自滄州夏盛酶生物技術(shù)有限公司^［15］。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

青貯前按鮮重的1%在原料表面噴灑尿素（含氮量46%）。青貯試驗(yàn)共分三個(gè)處理，分別為CK處理（葡萄枝葉原料，空白處理），PL處理（添加5×10⁵ cfu·g^-1 FM植物乳桿菌），PLC處理（添加5×10⁵ cfu·g^-1 FM植物乳桿菌和0.3%FM纖維素酶），每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，采用單向排氣閥厭氧袋進(jìn)行青貯，共計(jì)調(diào)制15袋。接種步驟：將各菌種分別在MRS、M17液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，平板計(jì)數(shù)后確定其數(shù)量，按比例配置菌液，以鮮重為基礎(chǔ)進(jìn)行添加，CK處理噴灑等量的無菌水。發(fā)酵至第60 d取樣，測(cè)定樣品營養(yǎng)品質(zhì)、發(fā)酵指標(biāo)、微生物數(shù)量及瘤胃體外產(chǎn)氣情況。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 營養(yǎng)品質(zhì)與發(fā)酵品質(zhì)測(cè)定 營養(yǎng)品質(zhì)：將取出的樣品放置在105℃ 2 h，再轉(zhuǎn)入65℃下至恒重，計(jì)算干物質(zhì)（Dry matter，DM）含量。隨后粉碎，過0.42 mm篩，用于測(cè)定營養(yǎng)成分。營養(yǎng)成分主要測(cè)定粗蛋白（Crude protein，CP）、可溶性碳水化合物（Water soluble carbohydrates，WSC）、中性洗滌纖維（Neutral detergent fiber，NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）、粗脂肪（Ether extract，EE）。其中CP使用自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定^［16］；WSC采用蒽酮-比色法測(cè)定；NDF和ADF使用全自動(dòng)纖維分析儀測(cè)定；EE采用全自動(dòng)脂肪分析儀測(cè)定^［17］。

發(fā)酵品質(zhì)測(cè)定方法：取10 g鮮樣置于錐形瓶中，加入90 mL蒸餾水，搖勻后用保鮮膜封口，放置在4℃冰箱24 h后取出，立即使用pH計(jì)測(cè)定pH值^［3］。將浸提液經(jīng)紗布過濾后，在12 000 r·min^-1離心10 min，用于檢測(cè)氨態(tài)氮（NH-N）、乳酸（LA）、乙酸（AA）、丙酸（Propionic acid，PA）、丁酸（Butyric acid，BA），NH-N采用苯酚-次氯酸比色法測(cè)定，有機(jī)酸采用高效液相色譜儀檢測(cè)。

1.3.2 微生物數(shù)量測(cè)定 微生物主要測(cè)定好氧細(xì)菌（AB）、乳酸菌（LAB）、酵母菌（Yeast）、霉菌（Mold），其中，乳酸菌和酵母菌分別采用MRS培養(yǎng)基和MEA（Malt extract agar）培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)48 h，好氧細(xì)菌和霉菌采用PCA（Plate count agar）培養(yǎng)基和SCDA（Salt czapek dox agar）培養(yǎng)基，28℃好氧培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，計(jì)算各類微生物數(shù)量^［16］。

1.3.3 瘤胃體外產(chǎn)氣測(cè)定 在石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院獸醫(yī)院進(jìn)行，瘤胃液來自3頭體重相近、身體健康，裝有永久瘤胃瘺管的哈薩克羊，于飼喂前1 h抽取瘤胃液。瘤胃液經(jīng)過濾后，裝入已預(yù)熱且充有二氧化碳的保溫瓶內(nèi)帶回試驗(yàn)室，用于配置后續(xù)的混合液。人工瘤胃液按照Menke法配置^［18］，人工瘤胃液與瘤胃液按照2∶1的比例混合，配成混合人工瘤胃液（保持二氧化碳通入）?？瞻坠軆H加入人工瘤胃混合液，精準(zhǔn)稱取各處理樣品0.2 g，緩慢放入玻璃注射器底部，加入混合人工瘤胃液30 mL（保持二氧化碳通入），將注射器內(nèi)壁涂抹凡士林防止漏氣，將玻璃注射器放入39℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱，立刻開始計(jì)時(shí)。每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置3個(gè)空白組以校正發(fā)酵產(chǎn)氣量，在發(fā)酵的0（初始發(fā)酵時(shí)間），2，4，6，8，10，12，18，24，36，42，48 h，記錄各時(shí)間段產(chǎn)氣量，計(jì)算有機(jī)物消化率（OMD）、代謝能（ME）和產(chǎn)氣參數(shù)模型。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2021整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用IBM SPSS Statistics 20軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），多重比較采用Duncan法，利用Origin 2017軟件進(jìn)行繪圖^［3］。產(chǎn)氣參數(shù)模型采用DPSV 7.05軟件中一元非線性回歸模型（Gompertz模型）計(jì)算。計(jì)算公式^［19-20］：

OMD=0.986×GP+0.0606×CP+11.03；

ME＝0.1639×GP+0.0079×CP+0.0239×EE+0.04；

X=C×exp［-C×exp（-C×X）］。

式中：GP為24 h的產(chǎn)氣量（mL）；CP為粗蛋白質(zhì)含量（%）；EE為粗脂肪含量（%）。X為產(chǎn)氣量（mL）；C為理論最大產(chǎn)氣量（mL）；C為產(chǎn)氣速率（mL·h^-1）；C為產(chǎn)氣延滯時(shí)間（h）；X為體外培養(yǎng)時(shí)間（h）^［16］。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加植物乳桿菌和纖維素酶對(duì)葡萄枝葉青貯飼料營養(yǎng)品質(zhì)、發(fā)酵品質(zhì)和微生物數(shù)量的影響

由表1可知，各處理的NH-N/TN和LAB數(shù)量均顯著高于葡萄枝葉原料（P＜0.05）。CK和PL處理CP含量顯著低于PLC處理（P＜0.05）。PLC處理的NDF含量顯著低于CK處理和葡萄枝葉原料（P＜0.05）。PL和PLC處理的ADF含量顯著低于CK處理和葡萄枝葉原料（P<0.05）。在葡萄枝葉整個(gè)青貯過程中未檢測(cè)到BA。PLC處理的LA含量顯著高于CK和PL處理（P＜0.05）。CK和PL處理的AA含量顯著低于PLC處理（P＜0.05）。CK處理的PA含量顯著高于PL和PLC處理（P＜0.05）。PL和PLC處理的NH-N/TN顯著高于葡萄枝葉原料（P＜0.05）。PLC處理的乳酸菌數(shù)量顯著高于CK處理和PL處理（P＜0.05）。

2.2 不同處理對(duì)葡萄枝葉青貯飼料體外消化率的影響

體外產(chǎn)氣過程中，各處理產(chǎn)氣量均呈現(xiàn)上升態(tài)勢(shì)，在接近48 h均已達(dá)到最大產(chǎn)氣量。根據(jù)產(chǎn)氣規(guī)律分析，葡萄枝葉青貯在發(fā)酵過程中的產(chǎn)氣量均呈現(xiàn)出先上升后穩(wěn)定的趨勢(shì)。

發(fā)酵60 d葡萄枝葉青貯體外產(chǎn)氣規(guī)律如圖1所示，發(fā)酵第2，4，6，8，10，12，18 h，各處理產(chǎn)氣量均極顯著高于CK處理（P＜0.01），PLC處理的產(chǎn)氣量均極顯著高于PL處理（P＜0.01）；發(fā)酵第24 h，PLC處理的產(chǎn)氣量極顯著高于CK處理和PL處理（P＜0.01）；發(fā)酵第30、36、42、48 h，各處理產(chǎn)氣量均極顯著高于CK處理（P＜0.01），PLC處理均極顯著高于PL處理的產(chǎn)氣量（P＜0.01）。

60 d葡萄枝葉青貯OMD和ME、產(chǎn)氣模型參數(shù)如表2所示，PLC處理的OMD、ME和產(chǎn)氣延滯時(shí)間均極顯著高于CK處理和PL處理（P＜0.01），PL處理和CK處理的OMD、ME和產(chǎn)氣延滯時(shí)間均無顯著差異；各處理的理論最大產(chǎn)氣量均極顯著高于CK處理（P＜0.01），PLC處理的理論最大產(chǎn)氣量極顯著高于PL處理（P＜0.01）；各處理產(chǎn)氣速度均極顯著低于CK處理（P＜0.01），PLC處理和PL處理的產(chǎn)氣速度差異不顯著。

3 討論

3.1 不同處理對(duì)葡萄枝葉青貯飼料營養(yǎng)品質(zhì)、發(fā)酵品質(zhì)和微生物數(shù)量的影響

有研究表明，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，各組葡萄枝葉的DM含量逐漸降低，這與發(fā)酵過程中LAB分解CP、WSC等發(fā)酵底物有關(guān)^［21］，LA大量產(chǎn)出pH值隨之降低，抑制有害菌的生長^［22］。Bao等^［23］發(fā)現(xiàn)，CK中DM含量較低，主要是因?yàn)槎喾N微生物對(duì)有機(jī)物質(zhì)的消耗。由于菌酶對(duì)各處理WSC含量下降，乳酸菌通過發(fā)酵作用分解青貯原料中的糖分，糖分逐漸減少，導(dǎo)致WSC含量下降。研究證明，植物乳桿菌可以降低青貯飼料的pH值^［24］，而青貯飼料的CP含量與pH值變化緊密關(guān)聯(lián)，隨著青貯進(jìn)行pH值逐漸下降，PL和PLC處理在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的pH值均低于CK處理，說明添加植物乳桿菌和纖維素酶后，通過抑制雜菌和分解纖維類物質(zhì)，使得pH值降低，隨著pH值降低抑制了蛋白酶活性，一定程度降低了CP損耗^［25］。

前人研究表明，在青貯中添加菌劑后，可顯著降低pH值，抑制有害雜菌繁殖促進(jìn)發(fā)酵^［7］；添加酶制劑可以促進(jìn)纖維素分解，降低NDF和ADF在青貯飼料中的含量^［26］，并將多糖分解為單糖，從而給微生物生長提供能源物質(zhì)。本試驗(yàn)中PLC處理的NDF和ADF最低，說明添加植物乳桿菌和纖維素酶后，促進(jìn)了纖維素和半纖維素的降解，使得NDF含量降低，纖維素酶對(duì)木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)的破壞使得ADF含量相對(duì)較低，部分NDF會(huì)被轉(zhuǎn)化成有機(jī)酸，如LA和AA，從而進(jìn)一步降低NDF含量，說明植物乳桿菌和纖維素酶聯(lián)合添加也起到相同的效果^［27］。LA含量越高，一定程度可表明青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)好^［28］。本試驗(yàn)中各處理LA、AA含量和乳酸菌數(shù)量均高于CK處理，酵母菌、好氧細(xì)菌、霉菌數(shù)量和PA含量均低于CK處理，這可能是由于植物乳桿菌和纖維素酶發(fā)揮作用，大量產(chǎn)生乳酸，提供營養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)乳酸菌生長，且pH值降低抑制酵母菌、好氧細(xì)菌和有害微生物（霉菌）繁殖，從而改善青貯發(fā)酵品質(zhì)^［29］。

3.2 不同處理對(duì)葡萄枝葉青貯飼料體外消化率的影響

降解率能夠反映青貯飼料在反芻動(dòng)物瘤胃中降解的難易程度^［30］，有機(jī)物降解率的增加表明微生物活性更高，從而使得青貯發(fā)酵效果更佳^［31］。本試驗(yàn)中，添加植物乳桿菌和纖維素酶處理的有機(jī)物降解率均顯著高于CK處理。這可能是因?yàn)橹参锶闂U菌的添加有助于優(yōu)化青貯過程中的微生物環(huán)境，促進(jìn)有益菌群的生長，而纖維素酶則直接作用于纖維素分子，將其分解為更易于動(dòng)物吸收的小分子物質(zhì)^［32］，從而提高了有機(jī)物的降解率。在葡萄枝葉青貯中，PLC處理的有機(jī)物降解率最高，達(dá)到46.03%。其次，在代謝能方面，添加植物乳桿菌和纖維素酶的處理也均顯著高于CK處理。這可能是因?yàn)橹参锶闂U菌促進(jìn)了飼料中有益菌群的繁殖，改善了發(fā)酵環(huán)境，而纖維素酶則通過分解纖維素等難消化物質(zhì)，增加了飼料中可利用的能量來源，從而提高動(dòng)物對(duì)其的消化吸收能力^［33-34］。在葡萄枝葉青貯中，PLC處理的代謝能最高，達(dá)到5.92 MJ·kg^-1。最后，在產(chǎn)氣模型參數(shù)方面，添加植物乳桿菌和纖維素酶的處理均顯著高于CK處理。這可能是因?yàn)橹参锶闂U菌通過發(fā)酵作用產(chǎn)生LA等有益物質(zhì)，調(diào)節(jié)飼料pH值，為纖維素酶的活性創(chuàng)造有利條件^［35］；纖維素酶則直接作用于纖維素等有機(jī)物，將其分解為更易于被微生物利用的小分子物質(zhì)。這些分解產(chǎn)物不僅提高了飼料的營養(yǎng)價(jià)值，還為微生物的發(fā)酵作用提供了更多底物，從而加快了產(chǎn)氣速度^［36］。因此，添加植物乳桿菌和纖維素酶可顯著提高青貯飼料的有機(jī)物降解率和代謝能。

4 結(jié)論

聯(lián)合添加植物乳桿菌（5×10⁵ cfu·g^-1 FM）和纖維素酶（50 U·mg^-1）能夠通過提高乳酸和乙酸含量以最大化減少粗蛋白損失，同時(shí)有效降低酸性洗滌纖維含量以綜合改善葡萄枝葉青貯發(fā)酵品質(zhì)。此外，有助于提高哈薩克羊?qū)ζ咸阎θ~青貯中有機(jī)物的降解率和代謝能。

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（責(zé)任編輯 劉婷婷）