德興礦區(qū)原生植物根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析

收稿日期：2023-12-11；修回日期：2024-05-08

基金項目：國家重點研發(fā)計劃草種質(zhì)資源重要性狀基因型精準鑒定（2023YFD12000302）;國家重點研發(fā)計劃典型酸性廢石堆場及周邊污染土壤的修復(fù)技術(shù)集成及示范（2019YFC1805005）資助

作者簡介：張馨月（1999-），女，漢族，山東煙臺人，碩士研究生，主要從事裸露邊坡植被恢復(fù)研究，E-mail：zhangxinyue430@126.com;#隋永超（1994-），男，漢族，北京人，碩士，主要從事裸露邊坡植被恢復(fù)，E-mail：1815118314@qq.com;*通信作者Author for correspondence，E-mail：liberisa@163.com

摘要：為了解德興廢石堆場原生植物根際土壤真菌群落組成、分析群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)之間的關(guān)系，本研究采用高通量測序技術(shù)分析礦區(qū)的金星蕨（Parathelypteris glanduligera）、紫金牛（Ardisia japonica）、太平莓（Rubus pacificus）和芒草（Miscanthus sinensis）根際真菌群落多樣性。結(jié)果表明，4種原生植物根際土壤理化性質(zhì)差異顯著。4種植物根際土壤的優(yōu)勢真菌屬于擔子菌門和子囊菌門。主成分分析顯示，4種原生植物根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)存在差異，造成差異的指示屬主要有金星蕨的紅菇屬，紫金牛的古根菌屬和毛舌菌屬，芒草的棉革菌屬和色孢菌屬。芒草的根際真菌群落豐富度和多樣性最高。相關(guān)性分析表明，鉛Pb和速效磷是影響根際真菌群落變化的主要環(huán)境因子。共生營養(yǎng)型真菌是金星蕨和太平莓根際土壤中的優(yōu)勢功能菌群。研究結(jié)果有助于了解德興銅礦原生植物根際真菌生態(tài)功能，為廢石堆場生態(tài)重建和植被恢復(fù)及篩選修復(fù)菌群提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：土壤真菌；高通量測序；根際土；礦區(qū)植物

中圖分類號：S154.3；X53 文獻標識碼：A 文章編號：1007-0435（2024）10-3103-10

Analysis of Fungal Community Structure and Diversity in Rhizosphere Soil of Native Plants in Dexing Mining Area

ZHANG Xin-yue^1#， SUI Yong-chao^2#， WANG Qiong³， YANG Yue-qing³， LI Jin-bo¹， LI Chang-yi¹， XU Li-xin^1*

（1. Beijing Forestry University， Beijing 100083， China； 2. Beijing Greelin Technology Company， Beijing 100124， China； 3. Beijing General Research Institute of Mining and Metallurgy， Beijing 100160， China）

Abstract：To understand the fungal community structure in the rhizosphere soil of native plants in Dexing waste rock stockpiling field，the relationship between fungal community structure and soil physicochemical properties was analyzed. Illumina Miseq PE250 high-throughput sequencing technology was used to analyze the fungal diversity of rhizosphere soil of four plants， Parathelypteris glanduligera，Ardisia japonica，Rubus pacificus，Miscanthus sinensis. Results showed that there were significant differences in the physicochemical properties of the rhizosphere soil of the four native plants. The dominant phyla in the rhizosphere soils of four plants were Basidiomycota and Ascomycota. Principal component analysis showed that there were significant differences among the rhizosphere soil fungal community structure of the four native plants in the mining area. The indicator genera associated with the differences are mainly Russula for Parathely pteris glanduligera，Archaeorhizomyces and Trichoglossum for Ardisia japonica，Tomentella and Callistosporium for Miscanthus sinensis. The rhizosphere fungal community of Miscanthus sinensis had the highest richness and diversity. RDA analysis showed that Pb and available phosphorus were the main driving factors affecting the dominant rhizosphere fungal community structure. The FUNGuild function prediction showed that functional fungal for rhizosphere soil of Parathely pteris glanduligera and Rubus pacificus was mainly Symbiotroph. Above results provided a better understanding of soil fungal functions of native plants in Dexing waste rock stockpiling field，as well as the theoretical bases for artificial cultivation microorganisms and reconstruction in waste rock stockpiling field.

Key words：Soil fungi;High-throughput sequencing;Rhizosphere soils;Mining plants

我國礦產(chǎn)資源豐富，伴隨著礦產(chǎn)資源的開發(fā)也產(chǎn)生了大量的固體廢棄物^［1］。礦山廢棄物的堆積導(dǎo)致重金屬及其化合物通過雨淋、風化、滲流等作用進入土壤，造成土壤重金屬污染^［2］。德興銅礦是國內(nèi)最大的露天銅礦，自開采以來已造成了207 km²尾礦堆積區(qū)，其土壤中存在不同程度的Cu，Pb，Zn和As重金屬污染^［3-4］。重金屬污染不僅破壞生態(tài)平衡，影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，還會通過食物鏈危害人類健康^［5］。因此，礦山開采引起的生態(tài)環(huán)境問題受到廣泛關(guān)注，對重金屬污染土壤進行治理刻不容緩。

植物-微生物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)是一種治理重金屬污染土壤的新興生物技術(shù)，植物的根際為微生物提供能量和營養(yǎng)，微生物通過代謝活動幫助植物生長發(fā)育抵抗外界脅迫，利用兩者之間的共生關(guān)系形成植物-微生物復(fù)合體系，在礦山生態(tài)修復(fù)方面發(fā)揮巨大的潛力^［6-7］。在修復(fù)治理中，已有成功范例通過在修復(fù)植物根際接種優(yōu)勢的土著菌群來提高宿主植物的污染修復(fù)效率。例如，何園園^［8］從鐵尾礦分離篩選到2株錳氧化菌并構(gòu)建成功能菌群，發(fā)現(xiàn)復(fù)合菌群既能增加苜蓿葉綠素含量、提高重金屬積累量，又能提高土壤中有機質(zhì)含量、脲酶活性，改善土壤的營養(yǎng)狀況。黃鵬飛^［9］從馬尾松根際分離到粘蓋牛肝菌屬和彩色豆馬勃屬等外生菌根真菌，外源接菌后馬尾松幼苗的苗高和生物量顯著增加。

礦區(qū)原生植物對礦區(qū)生態(tài)環(huán)境修復(fù)具有重要意義^［10］。礦區(qū)土壤存在養(yǎng)分匱乏，pH低以及重金屬含量高等問題，惡劣的土壤條件限制了植物的正常生長^［11］。自然定居在礦區(qū)廢棄地的植物抗逆性和重金屬積累能力強，既能適應(yīng)多種重金屬復(fù)合污染的土壤，又能克服外來物種對本土環(huán)境適應(yīng)性差的缺點，成為聯(lián)合修復(fù)技術(shù)中的最佳植物材料^［12-13］。金星蕨（Parathelypteris glanduligera）、紫金牛（Ardisia japonica）、太平莓（Rubus pacificus）和芒草（Miscanthus sinensis）是德興廢石堆及其周邊廣泛分布的幾種植物群體，具有良好的重金屬耐受性，吸收和富集重金屬，具有植物修復(fù)潛力^［14-15］。

植物和微生物之間的良好互作是聯(lián)合修復(fù)的關(guān)鍵^［16］。根際是植物和微生物相互作用的樞紐，定殖在根際的微生物能與植物形成共生關(guān)系，幫助植物吸收養(yǎng)分、促進其生長和提高植物對脅迫的耐受性及對病原體的抗性^［17］。真菌作為根際微生物的重要組分，對土壤中的重金屬十分敏感，能夠靈敏的反應(yīng)出土壤的污染狀況，通過調(diào)節(jié)自身的群落結(jié)構(gòu)和代謝能力來適應(yīng)污染環(huán)境，是土壤生態(tài)系統(tǒng)健康的指示物和潛在的修復(fù)物^［18-19］。微生物群落的結(jié)構(gòu)和組成受到根系分泌物影響，這就導(dǎo)致植物根際真菌群落具有物種特異性，能夠招募不同的核心菌群^［20］。大寶山礦區(qū)使用重金屬耐性植物進行原位修復(fù)，修復(fù)植物根際微生物選擇Enterobacteriaceae，Pseudomonadaceae和Comamonadaceae的優(yōu)勢菌屬作為核心根際微生物群落^［21］。Tang等^［22］通過探究中華山蓼在非尾礦土壤和鉛鋅礦區(qū)土壤的根際微生物群落存在差異，發(fā)現(xiàn)生長在尾礦土壤的中華山蓼根際能夠招募Filobasidium，Articulospora和Filobasidium等耐重金屬真菌類群。修復(fù)植物根際的核心菌群在修復(fù)前期幼苗成活、修復(fù)中期植被建立和修復(fù)后期生態(tài)恢復(fù)等階段發(fā)揮重要作用^［23］。因此，探究修復(fù)植物根際真菌群落結(jié)構(gòu)，找到發(fā)揮作用的核心菌群對礦區(qū)重金屬污染土壤的植物-微生物聯(lián)合修復(fù)至關(guān)重要。

目前關(guān)于礦區(qū)原生植物根際真菌群落結(jié)構(gòu)的研究較少，本文利用高通量測序技術(shù)研究德興銅礦廢石場原生植物根際真菌群落結(jié)構(gòu)，理解其原生植物根際真菌與土壤環(huán)境因子之間的關(guān)系，可以為開發(fā)具有生態(tài)修復(fù)潛力的微生物制劑提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)，對銅礦廢石堆場植被恢復(fù)和生態(tài)重建有重要意義。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況和研究材料

德興銅礦位于德興市泗州鎮(zhèn)（117°43′E，28°59′N），由銅場、富家塢和朱砂紅3個礦床組成，是亞洲最大的銅礦之一^［24］。該地區(qū)屬于亞熱帶濕潤季風區(qū)，氣候溫暖、光照充足、雨量充沛。年平均氣溫18.1℃，最高氣溫38.0℃，最低氣溫-2.5℃，年平均降水量1935.7 mm，實際日照時數(shù)1719.7 h，土壤主要為紅壤和山地黃紅壤^［1］。銅礦廢石堆場具有邊坡穩(wěn)定性差，廢石粒徑不均勻，土壤酸化，重金屬含量高等特點^［25］。在前期開展了礦區(qū)酸化廢石堆場周邊本土植被調(diào)研，通過觀察在典型立地條件下，植物的生長狀況、根系結(jié)構(gòu)及防護性等。金星蕨、紫金牛、太平莓和芒草是廢石堆場原生環(huán)境中的優(yōu)勢草本植物，是適宜礦山廢棄地生態(tài)恢復(fù)應(yīng)用的植物。

于2021年7月，在廢石堆場周邊未修復(fù)的污染地區(qū)（117°43′～117°45′，28°58′～29°00′），海拔166～323 m，采集4種優(yōu)勢植物的根際土壤，分別為金星蕨（Parathelypteris glanduligera）（樣品編號DXJ）、紫金牛Ardisia japonica（樣品編號DXZ）、太平莓Rubus pacificus（樣品編號DXT）、芒草Miscanthus sinensis（樣品編號DXM）。在堆場周邊每種植物隨機設(shè)置3個樣方，樣方大小為2 m×2 m，同一樣方多點取樣根際土壤樣本，等量混合均勻為一個樣品，共12個根際土壤樣品。采集0～20 cm的植物根系及土壤樣品，晃動根部，去除根部松散的土壤后，使用無菌刷子從根部收集0～5 mm的土壤作為根系土。土壤樣品分為兩份，一份裝入無菌采樣袋中，—80℃條件下保存用于土壤微生物DNA提取和高通量測序，另一份用于土壤理化性質(zhì)和重金屬檢測。

1.2 土壤理化性質(zhì)及重金屬檢測

土壤pH值采用電位法，依據(jù)（HJ962-2018）測定。土壤有機質(zhì)采用重鉻酸鉀氧化-容量法，依據(jù)（LY/T1237-1999）測定。土壤樣品中重金屬鉻、鋅、鉛含量依據(jù)（HJ491-2019）采用火焰原子吸收光譜儀測定。土壤樣品中砷含量依據(jù)（HJ680-2013）采用原子熒光光度計測定。土壤全氮含量采用凱氏法測定，土壤全鉀含量采用堿熔和酸溶法測定，土壤速效鉀含量采用乙酸銨浸提法測定，土壤全磷含量采用堿熔-鉬銻抗分光光度法測定，土壤堿解氮采用堿解擴散法測定，土壤有效磷采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗分光光度法測定。

1.3 土壤總DNA提取及高通量測序

采用ALFA-SEQ Advanced Soil DNA Kit（ADX1170）試劑盒對4種植物根際土樣品進行DNA提取。采用PCR反應(yīng)體系對ITS1區(qū)域進行擴增，引物為ITS5-1737F和ITS2-2043R。PCR反應(yīng)體系為：2x Premix Taq 25 μL，Primer-F（10 μM）1 μL，Primer-R（10 μM）1 μL，DNA50 ng，Nuclease-free water add to 50 μL。PCR的反應(yīng)條件為：94℃5 min；30個循環(huán)（94℃30 s，52℃30 s，72℃30 s）;72℃10 min。PCR產(chǎn)物電泳檢測：用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的片段長度和濃度，主帶長度在正常范圍內(nèi)的樣品用于進一步實驗。Pooling及切膠純化：使用E.Z.N.A.Gel Extraction Kit（Omega，USA）凝膠回收試劑盒回收PCR混合產(chǎn)物，TE緩沖液洗脫回收目標DNA片段。建庫及測序：由廣東美格基因科技有限公司進行后續(xù)的樣品建庫，按照NEBNext Ultra^TM II DNA Library Prep Kit for Illumina（New England Biolabs，USA）標準流程進行建庫操作，使用Illumina Nova 6000平臺對構(gòu)建的擴增子文庫進行PE250測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

原始測序序列使用cutadapt軟件質(zhì)控，利用usearch-fastq_mergepairs（V10，http：//www.drive5.com/usearch）過濾不符合的Tags，獲得原始的拼接序列；利用fastp（anultra-fastall-in-oneFASTQpreprocessor，version0.14.1，https：//github.com/OpenGene/fastp）對原始的拼接數(shù)據(jù)進行滑窗質(zhì)量剪裁，得到有效的拼接片段。利用UPARSE方法將相似性大于97%的序列進行OTU聚類；利用usearch-sintax將每個OTU的代表序列與UNITE（ITS）數(shù)據(jù)庫進行比對獲得物種注釋信息（設(shè)定置信度閾值默認為0.8）。生物信息學分析利用廣東美格基因科技有限公司提供的生物信息云平臺（http：//cloud.magigene.com/yomics）完成。

基于OTU豐度表，物種群落分析使用R軟件reshape2，dplyr，patchwork，installr和ggplot2軟件包進行群落組成分析；通過R語言中的vegan，doBy，ggalt，BiodiversityR和ggplot2軟件包繪制Rank-abundance稀釋曲線圖；Alpha多樣性分析使用usearch-alpha_div （V10，http：//www.drive5.com/usearch/）進行richness，chao1，shannon，simpson的計算；Batal多樣性分析使用R軟件vegan，dplyr和ggplot2軟件包進行PCA分析。

物種差異分析基于均一化的各個物種等級的豐度表OTU_table，使用non-parametric factorial Kruskal-Wallis（KW）sum-rank test檢測不同分組間豐度差異顯著的物種，然后用成組的Wilcoxon秩和檢驗來進行兩兩組間差異性判斷，用線性判斷分析（LDA）評估差異顯著物種的影響大小，LDA閾值為3.5，使用R軟件ggplot2繪制LEfSe物種差異分析圖。

FUNGuild功能預(yù)測是基于微生態(tài)guild對真菌群落進行分類分析的工具，基于土壤真菌群落對同類環(huán)境資源的利用途徑進行功能分類和注釋。使用bioincloud平臺（https：//www.bioincloud.tech）對真菌進行FUNGuild功能注釋。使用CANOCO5.0軟件對真菌群落進行冗余分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 礦區(qū)土壤的基本性質(zhì)

從表1可以看出，采樣點土壤pH呈酸性，pH值在4.22～4.86。金星蕨根際土壤銅污染值為27～40 mg·kg^-1，紫金牛根際土壤銅污染值為1910～3660 mg·kg^-1，太平莓根際土壤銅污染值為72～1330 mg·kg^-1，芒草根際土壤銅污染值為71～82 mg·kg^-1。4種植物根際Cu污染均超過土壤背景值（20.3 mg·kg^-1），金星蕨采樣點的Zn和As污染超標，紫金牛和太平莓采樣點的Cr，Pb和As污染嚴重，芒草采樣點的Cr，Zn，Pb和As污染嚴重。

金星蕨、紫金牛、太平莓和芒草的全磷含量無顯著差異。在全氮含量上，各根際土壤含量的高低依次為太平莓、芒草、紫金牛和金星蕨，太平莓和芒草之間的差異不顯著。在全鉀含量上，太平莓和芒草的含量高于金星蕨和紫金牛。在速效磷含量上，各根際土壤含量的高低依次為紫金牛、太平莓、芒草和金星蕨，紫金牛的速效磷和速效鉀含量顯著高于其余3種。太平莓和芒草的堿解氮含量顯著高于金星蕨和紫金牛。在有機質(zhì)含量上，太平莓和芒草的含量顯著高于金星蕨和紫金牛，太平莓和芒草之間差異不顯著，金星蕨和紫金牛之間差異不顯著。綜上，全氮、有效磷和速效鉀在4種原生植物之間存在一定差異。

2.2 根際土壤真菌群落稀釋曲線及OTU分析

通過對4組土壤樣品進行高通量測序，聚類共得到個1380 OTUs。由圖1（a）可知，稀釋曲線能夠反應(yīng)測序數(shù)據(jù)量的合理性，4種植物根際土壤真菌樣品的稀釋曲線都趨于平緩，說明測序深度可以最大程度的表征真菌群落的組成。

統(tǒng)計OTU中門、綱、目、科、屬、種及OTU等分類水平序列信息，并計算各分類群的相對豐度，供試土壤樣品共注釋到真菌分類14門，35綱，65目，116科，134屬，178種。由圖1（b）可知，所有樣品種共有OTUs數(shù)目為474個，其中各樣品所特有OTUs數(shù)目依次為芒草>太平莓>紫金牛>金星蕨。芒草根際特有OTUs數(shù)目最高（DXM，318），金星蕨根際特有OTUs數(shù)目最低（DXJ，175）。

2.3 根際土壤真菌群落組成分析

從圖2（a）中可以看出，重金屬污染的銅礦地區(qū)4種樣品在門水平上相對豐度排名前十的菌門為擔子菌門（Basidiomycota）、子囊菌門（Ascomycota）、羅茲菌門（Rozellomycota）、被孢囊門（Mortierellomycota）、球囊菌門（Glomeromycota）、毛霉門（Mucoromycota）、壺菌門（Chytridiomycota）、尾蟲門（Cercozoa）。其中擔子菌門和子囊菌門在4組土壤樣品中的相對豐度總和在75.60%～85.60%，這兩個菌門在真菌群落中占有很大優(yōu)勢。

從圖2（b）中可以看出，在屬水平上，相對豐度排名前十的菌屬為紅菇屬（Russula）、古根菌屬（Archaeorhizomyces）、廣義粉孢牛肝菌屬（Tylopilus）、樹粉孢屬（Oidiodendron）、色孢菌屬（Callistosporium）、南方牛肝菌屬（Austroboletus）、棉革菌屬（Tomentella）、青霉屬（Penicillium）。其中，在金星蕨土樣中，紅菇屬為優(yōu)勢屬，相對豐度為54.51%，次優(yōu)勢菌屬為廣義粉孢牛肝菌屬，相對豐度為6.34%。在紫金牛土樣中，古根菌屬為優(yōu)勢屬，相對豐度為37.18%。在太平莓土樣中，紅菇屬為優(yōu)勢屬，相對豐度為53.96%，次優(yōu)勢菌屬為廣義粉孢牛肝菌屬，相對豐度為10.43%。在芒草土樣中，樹粉孢屬為優(yōu)勢屬，相對豐度為3.83%，次優(yōu)勢菌屬為色孢菌屬，相對豐度為3.07%。

2.4 根際土壤真菌群落Batal多樣性分析

在OTU水平，通過Batal多樣性分析4種礦山植物根際真菌群落結(jié)構(gòu)的差異。如圖3所示，不同樣品之間群落結(jié)構(gòu)存在一定的差異，除芒草外，其他3種植物樣本的簇彼此靠近或有重疊，說明芒草根際的真菌群落結(jié)構(gòu)與其余3種植物差異大。

2.5 根際土壤真菌群落Alpha多樣性分析

不同地區(qū)不同植物根際土壤樣品中真菌Alpha多樣性分析結(jié)果如表2所示。Chao1指數(shù)可以描述微生物群落的豐富度，廢石場4種植物真菌群落豐富度從高到低依次為芒草>紫金牛>太平莓>金星蕨，芒草最高（DXM，794.03），金星蕨最低（DXJ，623.83）。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)可以反映微生物群落的多樣性，4種植物真菌群落多樣性從高到低依次為芒草>紫金牛>金星蕨>太平莓，芒草最高（DXM，3.60），太平莓最低（DXT，2.42）。芒草根際真菌群落的Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)都顯著高于金星蕨和太平莓（P<0.05）。

2.6 根際土壤真菌群落物種差異分析

為了進一步探究4種樣品真菌群落結(jié)構(gòu)之間的差異，采用LEfSe分析方法找到在統(tǒng)計學意義上具有顯著差異的菌群標志物（圖4）。采用線性回歸分析（LDA）來估算每個物種豐度對差異效果影響的大小，LDA越大表示差異越顯著。結(jié)果顯示（屬水平，LDA>3.5），金星蕨的菌群標志物有2個，紅菇科（Russulaceae）和紅菇屬（Russula）；紫金牛有4個，古根菌科（Archaeorhizomycetaceae）、古根菌屬（Archaeorhizomyces）、地舌菌科（Geoglossaceae）、毛舌菌屬（Trichoglossum）；太平莓有2個，嗜酸菌屬（Fodinomyces）和串擔革菌屬（Botryobasidium）；芒草的菌群標志物最多，有氯霉屬（Chloridium）、毛球藻科（Chaetosphaeriaceae）、透孢黑團科（Massarinaceae）、革菌科（Thelephoraceae）、棉革菌屬（Tomentella）、口蘑科（Tricholomataceae）、色孢菌屬（Callistosporium）、圓盤菌科（Orbiliaceae）及未分類的科和屬。

2.7 根際土壤真菌群落與土壤理化性質(zhì)相關(guān)性分析

為了研究根際土壤微生物優(yōu)勢菌屬與環(huán)境因子之間的關(guān)系，對相對豐度前15的優(yōu)勢菌屬與重金屬和土壤pH之間的關(guān)系進行RDA分析。從圖5可以看出，Axis1和Axis2對真菌群落優(yōu)勢屬的總解釋率為96.56%，影響微生物群落結(jié)構(gòu)改變的主要環(huán)境因子是Pb（P=0.002，解釋了數(shù)據(jù)52.1%的變異）、速效磷（P=0.002，解釋了數(shù)據(jù)28.2%的變異），其次為全氮、速效鉀和As。全磷、全鉀、堿解氮、Zn、有機質(zhì)、Cr對微生物群落的影響小。與As的含量呈正相關(guān)的真菌屬有廣義粉孢牛肝菌屬（Tylopilus）、雙旦菌屬（Geminibasidium）、紅菇屬（Russula）、孢子絲菌（Sporothrix）、南牛桿菌屬（Austroboletus）。與速效磷的含量呈正相關(guān)的真菌屬有被孢霉屬（Mortierella）、古根菌屬（Archaeorhizomyces）。與堿解氮和有機質(zhì)呈正相關(guān)的真菌屬有樹粉孢屬（Oidiodendron）、色孢菌屬（Callistosporium）、氯霉屬（Chloridium）、曲霉屬（Aspergillus）、棉革菌屬（Tomentella）。青霉菌屬（Penicillium）與Pb含量呈正相關(guān)。

2.8 根際土壤真菌群落FUNGuild功能預(yù)測

采用FUNGuild對根際土壤真菌進行功能預(yù)測（表3），檢測出的土壤真菌可劃分為3個單營養(yǎng)型（共生營養(yǎng)型、腐生營養(yǎng)型、病理營養(yǎng)型），4個混合營養(yǎng)型（腐生營養(yǎng)型-共生營養(yǎng)型、病理營養(yǎng)型-共生營養(yǎng)型、病理營養(yǎng)型-腐生營養(yǎng)型-共生營養(yǎng)型、病理營養(yǎng)型-腐生營養(yǎng)型）。金星蕨和太平莓根際土壤中的優(yōu)勢菌群是共生營養(yǎng)型，占比分別為64.09%和64.71%；紫金牛根際未分類真菌占比最大（79.95%），其次為共生營養(yǎng)型（14.37%）；芒草根際未分類真菌占比最大（82.88%），其次為腐生營養(yǎng)型（4.43%）。

根據(jù)Guilds小類，檢測出7個單一功能群和12個混合功能群（圖6）。金星蕨和太平莓的功能類群相似，外生菌根真菌占比最高，相對豐度分別為63.93%和64.59%。紫金牛中，外生菌根真菌占比最高（3.18%），其次是動物腐生-真菌寄生蟲-未命名腐生真菌（2.94%）和叢枝菌根真菌（1.17%）。芒草中杜鵑花類菌根真菌占比最高（3.83%），其次是外生菌根真菌（3.56%）和未命名腐生真菌（3.55%）。

3 討論

3.1 廢石場原生植物根際真菌群落組成分析及其核心菌群

在德興廢石場4種原生植物根際土壤真菌中，門分類水平上4種植物根際土壤真菌群落組成基本一致，擔子菌門和子囊菌門是原生植物根際土壤的優(yōu)勢真菌菌門，豐度占比75.60%～85.60%。這與Cd脅迫下地膚根際土壤^［27］、高砷硫鐵礦周邊污染土壤^［28］及云南勐糯鉛鋅礦區(qū)土壤^［29］真菌群落結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果相一致。子囊菌門和擔子菌門是土壤生態(tài)系統(tǒng)中的兩大優(yōu)勢真菌門類。子囊菌門和擔子菌門真菌作為分解者，通過分解胞外酶來分解土壤中的木質(zhì)素和纖維素^［30］，轉(zhuǎn)移和降解土壤中的重金屬^［31］，從而能夠適應(yīng)重金屬污染環(huán)境，在4種原生植物根際土壤中大量存在。因此，我們推斷在礦山土壤中重金屬脅迫下，原生植物根際真菌群落經(jīng)過自然選擇，出現(xiàn)了一些適應(yīng)能力強和重金屬耐性高的真菌類群。

外生菌根真菌的菌絲對于重金屬具有吸附作用，可以阻止過多的重金屬進入植物根部，增強植物對重金屬的耐受性^［32］。在屬水平上分析，紅菇屬（Russula）是金星蕨和太平莓根際相對豐度最高的優(yōu)勢菌群，其豐度分別為54.51%和53.96%。古根菌屬（Archaeorhizomyces）是紫金牛根際相對豐度最高的菌群。紅菇屬和古根菌屬真菌是土壤中常見的外生菌根真菌。并且在芒草根際也存在棉革菌屬（Tomentella）等外生菌根真菌。這些結(jié)果都表明外生菌根真菌在4種原生植物根際大量存在，因此推測外生菌根真菌在4種原生植物根際承擔著重要的功能。

FUNGuild功能預(yù)測相對豐度表也可以看出，共生營養(yǎng)型真菌在金星蕨和太平莓根際土壤中占主導(dǎo)地位。共生型營養(yǎng)真菌在惡劣環(huán)境中可以在根際與宿主植物形成共生關(guān)系，從而幫助植物抵抗土壤中的重金屬脅迫，促進植物吸收養(yǎng)分^［33］。本研究中，4種原生植物根際土壤中的共生營養(yǎng)型真菌主要包括外生菌根真菌、叢枝菌根真菌和內(nèi)生植物真菌。德興廢石場土壤中Cu，Pd及As等重金屬污染嚴重，外生菌根真菌可以通過真菌的細胞壁分泌粘液或有機酸等提取和固定土壤中的重金屬，從而更能適應(yīng)重金屬污染的環(huán)境^［30］。在礦山修復(fù)的的實踐應(yīng)用中，常利用外生菌根真菌的菌根修復(fù)土壤中的重金屬污染^［34］。因此，德興廢石場使用4種原生植物及其根際微生物進行原位修復(fù)時，可以采用紅菇屬、古根菌屬和棉革菌屬等外生菌根真菌作為核心微生物菌群。

3.2 原生植物根際真菌群落多樣性

植物根際的微生物群落不僅會受到土壤環(huán)境的影響，植物的種類也會影響根際微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性。Shen等^［35］通過對比實驗探究狗牙根、扁穗冰草等不同復(fù)墾植物對石油污染土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響，發(fā)現(xiàn)不同植物種類的根際微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性存在明顯差異。本研究的Batal多樣性分析結(jié)果表明礦區(qū)的4種原生植物根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)存在一定的差異，芒草根際真菌群落結(jié)構(gòu)與其他3種樣品的真菌群落差異大。結(jié)合OTU分析和Alpha多樣性分析發(fā)現(xiàn)，芒草根際特有OTU數(shù)目最多，根際真菌群落的豐富度和多樣性最高，表明芒草根際的真菌群落更復(fù)雜更穩(wěn)定，其根際的真菌群落對德興廢石場污染土壤的適應(yīng)性更強。

基于LEfSe分析方法，進一步探究芒草和其他植物的根際真菌群落的差異。LEfSe分析結(jié)果表明，芒草根際有有革菌科、棉革菌屬、口蘑科、色孢菌屬、圓盤菌科、未分類的科和屬等8個有顯著差異的菌群標記物（P<0.05）。棉革菌屬和色孢菌屬同時還在芒草根際真菌群落中占有較高的豐度，是芒草根際的優(yōu)勢菌屬。Huang等^［36］研究表明，在鉛鋅尾礦中，棉革菌屬是馬尾松根際優(yōu)勢的外生菌根真菌，它能夠幫助植物根系吸收水分，氮、磷等礦質(zhì)元素，提高植物對土壤中Pb，Zn和Cd等重金屬污染的耐受性。色孢菌屬的真菌是腐生真菌，在土壤養(yǎng)分循環(huán)中具有重要作用，能夠分解土壤中的有機質(zhì)，提高土壤的肥力^［37-38］。因此，芒草根際的棉革菌屬和色孢菌屬真菌可能不僅對重金屬具有一定的耐受性，也能增強宿主植物耐脅迫能力。棉革菌屬和色孢菌屬的真菌可能是影響芒草根際真菌群落結(jié)構(gòu)的重要菌屬。本研究發(fā)現(xiàn)，在不同的原生植物根際聚集特定的真菌類群，這對篩選協(xié)同植物共生和修復(fù)重金屬污染土壤的微生物具有積極作用。

3.3 優(yōu)勢真菌對土壤理化性質(zhì)的響應(yīng)

土壤理化性質(zhì)是影響植物根際真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的主要因素^［39］。重金屬是影響真菌群落的重要因子^［40］，具體表現(xiàn)在它能夠通過毒害作用減少真菌種類，改變原有群落內(nèi)部的種群競爭關(guān)系，促進耐性菌群成為重金屬污染環(huán)境中的優(yōu)勢種群^［41］。4種原生植物根際土壤理化性質(zhì)與屬水平優(yōu)勢真菌的相關(guān)性分析表明，Pb含量對4種原生植物根際土壤真菌群落分布的貢獻度最高（52.1%）。在德興廢石場，植物根際土壤真菌群落優(yōu)勢屬的相對豐度一定范圍內(nèi)受到Pb影響較大，這與楊金水等^［42］研究結(jié)果一致。青霉菌屬的相對豐度與Pb含量呈正相關(guān)，這與賈輝等^［43］的研究結(jié)果一致。青霉菌屬真菌通過菌絲分泌草酸，葡萄糖酸等有機酸，與鉛離子反應(yīng)形成沉淀，同時細胞壁的吸附機制可以固定鈍化土壤中的重金屬，從而使其能在Pb含量高的土壤中良好的生存^［44］。在研究中，速效磷含量對4種原生植物根際土壤真菌群落分布的貢獻度次之（28.2%）。速效磷的含量與被孢霉屬和古根菌屬的相對豐度呈正相關(guān)，會對4種原生植物根際真菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響，這與李靜等^［45-47］研究結(jié)果相符。

Pb和速效磷是影響4種原生植物根際土壤真菌群落的主要環(huán)境因子。堿解氮和有機質(zhì)經(jīng)分析并非影響根際真菌群落的主要因素，但是與樹粉孢屬、色孢菌屬、氯霉屬、曲霉屬及棉革菌屬的相對豐度呈正相關(guān)，在德興廢石場原生植物的根際微生物微生物群落塑造中發(fā)揮了一定的作用。因此，與土壤養(yǎng)分有關(guān)的環(huán)境因子速效磷、堿解氮和有機質(zhì)在4種原生植物根際真菌群落中發(fā)揮重要作用。

4 結(jié)論

德興銅礦4種原生植物根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和功能特征存在差異，不同的原生植物根際聚集特定的真菌類群。芒草及其根際的棉革菌屬和色孢菌屬等核心菌群形成了特有的共同體，從而對德興廢石場污染土壤的適應(yīng)性更強。Pb和速效磷是影響德興銅礦4種原生植物根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子，與土壤養(yǎng)分有關(guān)的環(huán)境因子速效磷、堿解氮和有機質(zhì)在根際真菌群落中發(fā)揮重要作用，可以通過改善土壤的養(yǎng)分狀況促進植物根際被孢霉屬、古根菌屬、色孢菌屬和棉革菌屬等真菌的生長，從而幫助廢石堆場植被恢復(fù)。因此，礦區(qū)原生植物及其根際核心菌群共同適應(yīng)污染土壤，為下一步篩選修復(fù)菌群和廢石堆場的生態(tài)恢復(fù)提供了依據(jù)。

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（責任編輯 彭露茜）