蒺藜苜蓿MtBOP的克隆、亞細胞定位及表達分析

摘要：葉柄上葉基因（BLADE-ON-PETIOLE，BOP）參與調(diào)控植物生長發(fā)育中如葉片和花朵的形態(tài)形成和脫落等重要發(fā)育過程。本研究將蒺藜苜蓿R108作為材料，通過生物信息學分析、亞細胞定位及表達模式分析等實驗，探究MtBOP基因的特性。MtBOP基因完整編碼區(qū)為1452 bp，編碼483個氨基酸。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育進化樹結(jié)果可知其與豌豆（Pisum sativum）和紅三葉草（Trifolium pratense）親緣關(guān)系最近。通過信號肽預測分析，其不具有信號肽。亞細胞定位結(jié)果顯示MtBOP定位于細胞核和細胞質(zhì)。表達模式分析表明，該基因的表達量在脫落酸、細胞分裂素、水楊酸、赤霉素調(diào)節(jié)下有上調(diào)趨勢，而在生長素，茉莉酸甲酯調(diào)節(jié)下出現(xiàn)下調(diào)趨勢。酵母自激活檢測顯示MtBOP不具有自激活活性。本研究為進一步探究蒺藜苜蓿的MtBOP基因提供了科學依據(jù)，而且BOP可用于后續(xù)相關(guān)基因功能實驗。

關(guān)鍵詞：蒺藜苜蓿；MtBOP；亞細胞定位；表達分析；轉(zhuǎn)錄自激活

中圖分類號：S541 文獻標識碼：A 文章編號：1007-0435（2024）10-3026-08

Cloning，Subcellular Localization and Expression Analysis of MtBOP from Medicago truncatula

LI Yan-ru¹， DONG Di²， CHAO Yue-hui^1*

（1.College of Grassland Industry and Grassland，Beijing Forestry University， Beijing 100083， China；2. Institute of Ecological Conservation and Restoration， Chinese Academy of Forestry， Beijing 100091， China）

Abstract：BLADE-ON-PETIOLE （BOP）gene is involved in regulating important plant developmental processes such as leaf and flower morphogenesis and shedding. In this study，Medicago truncatula R108 was used as a material to explore the characteristics of MtBOP through bioinformatics analysis，subcellular localization and expression pattern analysis. The complete coding region of MtBOP gene is 1452 bp，encoding 483 amino acids. According to phylogenetic tree results，it is closely related to Pisum sativum and Trifolium pratense. It has no signal peptide according to signal peptide prediction analysis. Subcellular localization results showed that MtBOP was located in the nucleus and cytoplasm. The analysis of expression pattern showed that the expression level of this gene was up-regulated under the regulation of abscisic acid，cytokinin，salicylic acid and gibberellin，while the expression of auxin and methyl jasmonate was down-regulated. The yeast self-activation test showed that MtBOP had no self-activation activity. This study provides scientific basis for further study of MtBOP gene of Medicago truncatula，and BOP can be used for subsequent related protein experiments.

Key words：Medicago truncatula;MtBOP;Subcellular localization;Expression analysis;Transcription from activation

收稿日期：2024-05-17；修回日期：2024-07-10

基金項目：內(nèi)蒙古草業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心有限公司項目（CCPTZX2023B04）資助

作者簡介：

李艷茹（1997-），女，漢族，山東菏澤人，碩士研究生，主要從事草類植物育種研究，E-mail：liyanru03@163.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：chaoyuehui@bjfu.edu.cn

植物生長發(fā)育過程中需要特定基因來控制器官的形態(tài)建成^［1-5］。BOP（BLADE-ON-PETIOLE）屬于NPR1家族，是植物生長和發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子，在植物組織器官的形態(tài)建成過程中具有重要功能^{［2-3，5］}。BOP抑制I類KNOX基因的表達，I類KNOX基因不僅在莖尖分生組織的建立和維持方面起著重要作用^［6-7］，而且KNOX基因表達的抑制決定著簇葉結(jié)構(gòu)的啟動與器官的建立^［8-9］。在營養(yǎng)發(fā)育過程中，通過活躍的細胞分裂，葉原基從最初的原基細胞擴展到三個具有極性發(fā)育軸的成熟器官：近端軸、近軸-遠軸和中側(cè)軸^［10］。之后，沿著三個極性發(fā)育軸，細胞產(chǎn)生不同的發(fā)育性狀。最終，葉片的形態(tài)是通過調(diào)節(jié)細胞分裂和分化決定的。遠軸-近軸的建立至關(guān)重要，遠軸-近軸的同一性影響著葉片的生長和對稱性，而且其他兩個軸的發(fā)育模式也會受到影響而發(fā)生改變^［3］。在近軸-遠軸發(fā)育過程中，葉片沿該軸兩側(cè)對稱，分為兩個區(qū)域，包括葉柄的近端區(qū)域和葉片發(fā)育的遠端區(qū)域。該軸的形成似乎與生長素向幼葉原基生長尖端的極性運輸有關(guān)^［11］。有研究表明，擬南芥（Arabidopsis thaliana）中特異性BTB-POZ結(jié)構(gòu)域蛋白BOP通過誘導AS2轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)葉片近端-遠端軸的形態(tài)發(fā)生，為更好地構(gòu)建葉柄組織創(chuàng)造條件^［12］。擬南芥中BOP是花器官脫落過程中不可或缺的基因，且參與花序近端區(qū)域多種細胞分化類型的調(diào)節(jié)^［13］。在植物生長過程中，葉片的形態(tài)形成和脫落直接影響植物的生命周期，因此，BOP基因在植物發(fā)育過程中起著重要作用。苜蓿葉片的發(fā)育狀況不僅影響其產(chǎn)量，還決定了其品質(zhì)的優(yōu)良程度^［14］。因此，對苜蓿葉片發(fā)育的研究不僅能提升苜蓿的利用價值和經(jīng)濟價值，還能為其品種改良提供重要依據(jù)。

蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）是一年生的豆科（Leguminosae）苜蓿屬（Medicago L.）植物，具有生長周期短、遺傳轉(zhuǎn)化效率高、自花授粉、固氮、耐寒性較強等特點^［15-16］，蒺藜苜蓿作為國際豆科模式植物的研究材料，是在水稻（Oryza sativa）和擬南芥之后，第3個完成全基因組序列測定的植物，是備受觀察研究的豆科模式植物^［17-18］，對其進行研究，有助于研究其他豆科牧草植物的特性^［19］。本研究從蒺藜苜蓿中克隆獲得MtBOP基因，并對其進行了亞細胞定位、酵母自激活檢測、生物信息學分析和實時熒光定量表達分析研究，可為今后豆科植物中BOP基因的功能研究奠定基礎(chǔ)，并提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗應(yīng)用的植物是野生型蒺藜苜蓿R108。將種子在4℃條件下春化3 d，之后放置于晝夜相對時間為16 h/8 h，相對溫度為23℃，直到根系正常發(fā)育。移至花盆后，在光周期為16 h/8 h，晝夜溫差為25℃/23℃的生長條件下進行培養(yǎng)。試驗所用的反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PrimeSTAR MAX、限制性內(nèi)切酶、pMD19-T克隆載體、X-α-Gal，金擔子素（Aureobasidin A）、酵母轉(zhuǎn)化試劑盒等是在TAKARA公司購買；于天根公司購買大腸桿菌感受態(tài)DH5α；在OMEGA公司購買了純化試劑盒、RNA提取試劑盒和DNA提取試劑盒；在艾克瑞公司選購了DL5000 DNA Marker；于康維公司選購熒光定量TB Green；于Sigma公司訂購了利福平、卡那霉素、脫落酸（ABA）、細胞分裂素（6-BA）、生長素（IAA）、赤霉素（GA）、茉莉酸甲酯（MeJA）和水楊酸（SA）等。實驗室配制保存了實驗所用農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105、酵母菌株Y2HGold和酵母誘餌表達載體pGBKT7。其他常規(guī)試劑均應(yīng)用進口分裝或國產(chǎn)分析純化。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計 基于目前已知的蒺藜苜?；蚪M序列數(shù)據(jù)，通過Primer Premier 5.0軟件，設(shè)計特異性引物MtBOP-F和MtBOP-R，用以擴增MtBOP基因得到全長序列，再用通用引物M13-F M13-R來檢測MtBOP基因的克隆。將BD載體序列作為基礎(chǔ)，設(shè)計引物BD-MtBOP-F和BD-MtBOP-R連接BD載體，用以酵母表達載體的構(gòu)建，使用通用引物T-7和3-BD進行檢測。特異性引物Y3-MtBOP-F和Y3-MtBOP-R用以構(gòu)建亞細胞定位的載體，使用通用引物Y3-F和Y3-R進行檢測。蒺藜苜蓿Actin做為內(nèi)參基因，熒光定量的內(nèi)參引物為MtActin-F和MtActin-R，特異性引物MtBOP-RT-F和MtBOP-RT-R，以MtBOP基因序列為基礎(chǔ)，進行實時熒光定量分析。

1.2.2 MtBOP基因克隆 選取生長健壯的蒺藜苜蓿植株的新鮮葉片，將取好的健康葉片剪碎，然后放入研缽中，并輔以液氮將葉片充分研磨，之后根據(jù)RNA提取試劑盒的說明，進行蒺藜苜?？俁NA的提取。將提取的蒺藜苜蓿葉片總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的要求進行反轉(zhuǎn)錄。將得到的蒺藜苜蓿的cDNA作為模板，以BOP-F和BOP-R為引物，對蒺藜苜蓿cDNA進行擴增，進而得到想要的MtBOP基因片段。將得到的PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，在確認基因片段大小正確之后，根據(jù)OMEGA純化試劑盒要求純化符合預期長度的片段。將純化后的PCR產(chǎn)物與T載進行連接，然后將其轉(zhuǎn)到DH5α大腸桿菌感受態(tài)中，在含有氨芐抗性的固體LB培養(yǎng)基上均勻涂抹，放入37℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，挑取LB培養(yǎng)基上的單菌落，使用通用引物M13-F和M13-R來進行鑒定，之后使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，將基因片段大小符合的PCR產(chǎn)物送公司測序。

1.2.3 亞細胞載體構(gòu)建及亞細胞定位 使用特異性引物Y3-BOP-F和Y3-BOP-R，將MtBOP質(zhì)粒作為模板進行PCR擴增。將PCR產(chǎn)物進行純化，并應(yīng)用EcoRI酶對載體進行酶切，之后應(yīng)用無縫連接酶連接純化后的PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物，再將連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)到DH5α大腸桿菌感受態(tài)中。對條帶正確的單菌落進行質(zhì)粒提取，再轉(zhuǎn)到農(nóng)桿菌的感受態(tài)EHA105中，將測序正確的單菌落，放入28℃避光振蕩培養(yǎng)2 d。準備生長健壯的本生煙草為材料，將菌液用注射器注入健康的煙草葉片中，將注射菌液后的煙草進行48 h的避光培養(yǎng)，之后使用共聚焦顯微鏡下觀察信號在煙草葉片細胞中的分布情況。

1.2.4 生物信息學分析 MtBOP基因序列的獲取，是先從NCBI網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）查找MtBOP的基因序列，之后在（https：//iris.angers.inra.fr/obh/）中與蒺藜苜蓿R108基因組序列比對。使用Phyre2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）工具進行蛋白質(zhì)二級和三級結(jié)構(gòu)的預測。利用NCBI CD（http：//www.ncbi.nlm.gov/cdd/？term）進行保守結(jié)構(gòu)域分析。應(yīng)用ExPASy網(wǎng)站（http：//expasy.org/）進行蛋白質(zhì)等電點和分子量的分析利用。根據(jù)SignalP5.0網(wǎng)站（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0）預測信號肽用。通過NCBI網(wǎng)站BLAST工具（https：// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi） 查找BOP同源蛋白，利用MEME網(wǎng)站（http：//meme-suite.org/tools/meme）以及TBtools、MEGA5.0 軟件進行系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析。

1.2.5 BD-MtBOP載體的構(gòu)建及Y2HGold酵母感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化 提取符合要求的大腸桿菌菌液的質(zhì)粒作為模板，使用引物BD-BOP-F和BD-BOP-R進行PCR擴增，構(gòu)建BD-MtBOP載體。將BD載體在37℃時利用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ進行酶切15 min。使用無縫連接酶在50℃時將純化后載體與PCR產(chǎn)物進行連接，之后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中。將轉(zhuǎn)化好的菌液均勻涂抹在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，之后進行單菌落PCR篩選驗證，將片段長度符合要求的送到公司測序。提取測序正確的菌液質(zhì)粒，并依照酵母轉(zhuǎn)化試劑盒給出的步驟將BD-MtBOP轉(zhuǎn)入Y2HGold酵母感受態(tài)細胞中。

1.2.6 自激活作用檢測 將轉(zhuǎn)化后的BD-MtBOP和BD空載酵母菌液在SD/-Trp培養(yǎng)基上涂布均勻，并進行單菌落檢驗，看其是否轉(zhuǎn)化成功。之后將轉(zhuǎn)化成功的酵母菌液分別在缺失培養(yǎng)基SD/-Trp，SD/-Trp/X-α Gal和SD/-Trp/X-α-Gal/AbA上點涂，倒置在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3天后，觀察并記錄其生長狀態(tài)。

1.2.7 MtBOP實時熒光定量表達分析 對蒺藜苜蓿長勢健康的葉片，分別噴施的ABA（50 μmol·L^-1），6-BA（10 μmol·L^-1），SA（10 μmol·L^-1），IAA（10 μmol·L^-1），GA（10 μmol·L^-1），MeJA（10 μmol·L^-1），進行激素誘導。處理后按7個不同時間點進行葉片組織的采集，分別是0 h，0.5 h，1 h，3 h，6 h，9 h，12 h，并使用液氮進行速凍處理。之后對上述樣品進行充分研磨，提取總RNA，并進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。使用蒺藜苜蓿Actin作為內(nèi)參基因，使用特異性引物MtBOP-RT-F和MtBOP-RT-R按照試劑說明書進行實時熒光定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒺藜苜蓿MtBOP基因的克隆

使用MtBOP-F和MtBOP-R作為引物，蒺藜苜蓿cDNA為模板進行PCR擴增。擴增之后得到一條清晰、長度大小約為1452 bp的條帶（圖1，圖2），進行T載體連接。將條帶正確的菌液送到生物公司進行測序驗證，測序結(jié)果顯示，蒺藜苜蓿MtBOP堿基序列與所獲得的堿基序列一致，表明成功克隆了蒺藜苜蓿MtBOP基因。克隆載體命名為pMD-MtBOP。MtBOP基因長度為1452 bp，編碼483個氨基酸。

2.2 MtBOP蛋白特性

MtBOP分子式為CHNOS，由483個氨基酸組成，分子量為53449.61，理論pI為6.21，帶負電殘基總數(shù)為55，帶正電殘基總數(shù)為43，不穩(wěn)定指數(shù)為44.62，表明其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。根據(jù)二級和三級結(jié)構(gòu)預測的結(jié)果表明，構(gòu)成MtBOP蛋白的主要是α螺旋和無規(guī)則卷曲，其中α螺旋占二級結(jié)構(gòu)總比例的50.1%，無規(guī)則卷曲則占37.47%，其余結(jié)構(gòu)含有延伸鏈7.45%和β轉(zhuǎn)角4.97%（圖3，圖4）。對MtBOP蛋白保守結(jié)構(gòu)域進行預測，結(jié)果表明，在BOP蛋白中，有BTB/POZ和ANK-reapts兩個結(jié)構(gòu)域存在（圖5）。通過信號肽預測分析，可能性為0.15%，不具有信號肽（圖6）。利用MEGA5.0 及TBtools對BOP同源蛋白進行比對，同時進行系統(tǒng)發(fā)育進化樹的繪制，結(jié)果顯示蒺藜苜蓿中的MtBOP蛋白與豌豆（Pisum sativum）和紅三葉草（Trifolium pratense）中氨基酸序列最相似（圖7）。

2.3 蒺藜苜蓿MtBOP亞細胞定位分析

為了更好的檢測MtBOP在細胞中的定位情況，將已經(jīng)轉(zhuǎn)化成功的35S-MtBOP-YFP和35S-YFP載體的農(nóng)桿菌菌株，注射到本生煙草下表皮細胞中。共聚焦顯微鏡下觀察其在細胞中的分布情況，結(jié)果表明，MtBOP蛋白定位于細胞核和細胞質(zhì)（圖8）。

2.4 蒺藜苜蓿MtBOP基因表達模式分析

通過熒光定量來進行MtBOP基因在不同激素處理情況下表達模式的分析。結(jié)果顯示，經(jīng)過ABA處理后，MtBOP基因在6 h和12 h時表達量顯著升高（圖9A）。經(jīng)過6-BA處理，MtBOP基因在1 h時表達量最高，其余時間變化不明顯（圖9B）。經(jīng)過SA處理后，MtBOP基因表達量在9 h后顯著下降，不過總體并沒有顯著差異（圖9C）。經(jīng)過IAA處理，MtBOP基因在3 h后有明顯下降（圖9D）。經(jīng)過GA處理后，MtBOP基因表達量在6 h之前沒有明顯變化，但在9 h時迅速升高之后又下降（圖9E）。經(jīng)過MeJA處理后，MtBOP基因表達量在3 h時下降，之后又升高，不過總體顯著差異變化不大（圖9F）。總體來說，在ABA，6-BA，SA，GA調(diào)節(jié)下MtBOP有上調(diào)趨勢，在IAA和MEJA條件下出現(xiàn)下調(diào)趨勢。

2.5 酵母自激活檢測

BD-MtBOP為實驗組，在SD/-Trp，SD/-Trp/X-a-Gal和SD/-Trp/X-a-Gal/ AbA培養(yǎng)基內(nèi)點涂，之后放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3天觀察其生長狀況。結(jié)果顯示，BD-MtBOP可以在SD/-Trp正常生長，在SD/-Trp/X-a-Gal生長正常沒有發(fā)生顏色變化，在SD/-Trp/X-a-Gal/ AbA不能夠正常生長，結(jié)果顯示MtBOP沒有自激活活性（圖10）。

3 討論

BOP（BLADE-ON-PETIOLE）基因是在擬南芥中首次被發(fā)現(xiàn)并進行研究的，目前，在蒺藜苜蓿中BOP基因的研究還未見到報道。本試驗在蒺藜苜蓿中成功克隆并獲得了MtBOP基因，該基因長度大小約為1452 bp，編碼483個氨基酸。蒺藜苜蓿作為模式植物，其遺傳轉(zhuǎn)化體系成熟，是豆科植物中的代表性植物，研究BOP基因在蒺藜苜蓿生長過程中的功能，能夠為蒺藜苜蓿的品種改良提供理論基礎(chǔ)，也能夠為其他豆科植物中BOP的相關(guān)研究和應(yīng)用提供參考。

BOP基因?qū)儆贜PR1家族。NPR1蛋白作為植物防御信號中的一個重要調(diào)節(jié)因子，不斷參與植物體內(nèi)的免疫防御反應(yīng)過程^［20］。而且NPR1蛋白參與植物體內(nèi)的多種抗性代謝通路，還在植物抗病性研究和生長發(fā)育中有著重要作用^［21］。在植物細胞核內(nèi)，NPR1蛋白可以與TGACG序列特異性結(jié)合蛋白TGA結(jié)合，參與SAR反應(yīng)，可以在SA的誘導下激活下游防衛(wèi)基因PR1的表達^［22-23］。BOP在生化功能上與NPR1相似，有研究表明，BOP蛋白通過與TGA轉(zhuǎn)錄因子的直接相互作用控制模式，并證明類似于與植物防御正式相關(guān)的信號機制可能用于控制發(fā)育模式，BOP基因可能與植物的抗病性和生長發(fā)育方面相關(guān)，在本研究中表明的BOP基因含有BTB/POZ和ANK-reapts兩個保守結(jié)構(gòu)域，也與該研究一致^［1］。有研究顯示，BOP1在陸地棉中的鈴柄離層組織中優(yōu)勢表達，推測BOP1可能通過控制離層分化從而調(diào)控葉片脫落^［24］；還有研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥花器官基部BOP基因顯著表達，說明BOP基因通過控制花器官離層細胞分化，參與花器官的脫落過程，而且在擬南芥bop1、bop2突變體中葉片離層細胞分化受到抑制^［13］，BOP可能參與離層的形成和分化，從而影響植物的生長發(fā)育。我們可以推測MtBOP基因可能參與蒺藜苜蓿生長發(fā)育過程，進而影響蒺藜苜蓿的正常生長，本研究對BOP在蒺藜苜蓿的花和葉中潛在功能的研究提供了理論支持。

4 結(jié)論

本試驗在蒺藜苜蓿中成功克隆了MtBOP基因，通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，MtBOP蛋白分子量為53 449.61，不穩(wěn)定指數(shù)為44.62，表明其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，且MtBOP蛋白不具有信號肽，其與豌豆和紅三葉草親緣關(guān)系最近。亞細胞定位顯示其定位于細胞核與細胞質(zhì)。酵母自激活檢測可知該蛋白不具有自激活活性。根據(jù)表達模式分析，表達量在脫落酸、細胞分裂素、水楊酸和赤霉素調(diào)節(jié)下有上調(diào)趨勢，但生長素，茉莉酸甲酯調(diào)節(jié)下出現(xiàn)下調(diào)趨勢。本試驗為蒺藜苜蓿MtBOP的深入研究奠定了基礎(chǔ)，而且BOP可用于后續(xù)相關(guān)蛋白實驗。

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（責任編輯 劉婷婷）