呼倫貝爾退化草地接種叢枝菌根真菌對黃花苜蓿生長的影響

收稿日期：2024-04-17；修回日期：2024-05-18

基金項(xiàng)目：內(nèi)蒙古自治區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2022YFDZ0101）;引進(jìn)人才科研啟動經(jīng)費(fèi)（31051204）資助

作者簡介：萬吉鑫（2000-），女，漢族，重慶涪陵人，碩士研究生，主要從事退化草地修復(fù)研究，E-mail：wanjixin@163.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：yanggw@cau.edu.cn

摘要：將本土草種黃花苜蓿（Medicago falcata）補(bǔ)播呼倫貝爾草甸草原中，能夠提高草地生產(chǎn)力和牧草品質(zhì)，促進(jìn)退化草地恢復(fù)。為解決原位補(bǔ)播黃花苜蓿幼苗生長弱、建植成功率低的問題，本試驗(yàn)以未滅菌的呼倫貝爾退化草地土壤為基質(zhì)土，當(dāng)?shù)爻Ｓ醚a(bǔ)播物種-黃花苜蓿為研究對象，探究叢枝菌根真菌（AMF）種類及組合對黃花苜蓿幼苗生長的影響。結(jié)果表明，黃花苜蓿幼苗的生長受到AMF種類和組合的調(diào)控。同時接種摩西斗管囊霉（Funneliformis mosseae）和幼套近明球囊霉（Claroideoglomus etunicatum）顯著提高了黃花苜蓿的地下生物量和總生物量，抵消F. mosseae單接種的負(fù)效應(yīng)。共同接種F. mosseae和C. etunicatum活化了土壤速效磷，提高了土壤氮含量，促進(jìn)了黃花苜蓿根系對鐵、鉀、鎂、錳、磷的吸收，因而促進(jìn)了黃花苜蓿的生長。因此，在呼倫貝爾退化草甸草原進(jìn)行黃花苜蓿補(bǔ)播時，同時接種F. mosseae和C. etunicatum可能促進(jìn)黃花苜蓿幼苗生長，提高建植成功率。

關(guān)鍵詞：叢枝菌根真菌；共同接種；退化土壤；補(bǔ)播；黃花苜蓿

中圖分類號：S812 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1007-0435（2024）10-3017-09

Effect of Arbuscular Mycorrhizal Fungi Inoculation on Alfalfa Growth in

Hulunbuir Degraded Grassland

WAN Ji-xin， BI Yi-xian， YANG Gao-wen^*

（College of Grassland Science and Technology， China Agricultural University， Beijing 100193， China）

Abstract：Reseeding Medicago falcata in Hulunbuir meadow grassland can effectively improve grassland productivity and forage quality，and promote the restoration of degraded grassland. In order to solve the problems of weak growth of yellow alfalfa seedlings and low success rate of establishment，this experiment adopted indoor pot experiment. The no-sterilized soil of degraded grassland in Hulunbuir was used as the matrix soil，and the commonly used species of degraded grassland，yellow alfalfa，was used as the research object to explore the effects of arbuscular mycorrhizal fungi （AMF） on the growth of Medicago falcata seedlings. The results showed that the growth of alfalfa seedlings was regulated by the type and combination of AMF inoculation. After the single inoculation of Funneliformis mosseae，the aboveground and underground biomass of alfalfa decreased，while the simultaneous inoculation of F. mosseae and C. etunicatum significantly increased the underground biomass and total biomass of alfalfa，counteracting the negative effect of the single inoculation of F. mosseae. The joint inoculation of F. mosseae and C. etunicatum activated soil available phosphorus，increased soil nitrogen content，and promoted the absorption of Fe，K，Mg，Mn and P by the roots of alfalfa，thus promoting the growth of alfalfa. Therefore，simultaneous inoculation of F. mosseae and C. etunicatum might promote the growth of alfalfa seedlings and improve the success rate of alfalfa reseeding in Hulunbuir degraded meadow grassland.

Key words：Arbuscular mycorrhizal fungi;Co-inoculation;Degraded soil;Reseeding;Medicago falcata

草原約占我國國土面積的40%^［1］，是我國北方重要的陸地生態(tài)屏障^［2］，然而，由于氣候變化（如全球變暖和干旱）^［3-5］以及人類活動（如過度放牧、人口增長和過度利用土地）^［6-7］，中國約90%的草原面積已經(jīng)發(fā)生不同程度退化。草原退化會導(dǎo)致許多生態(tài)問題，例如植被覆蓋率降低、生物多樣性和生產(chǎn)力的減少^［8］、土壤質(zhì)地改變、土壤肥力降低^［9］，土壤微生物群落遭到破壞^［10］。補(bǔ)播是恢復(fù)退化草原的重要措施之一^［11］，通過補(bǔ)播解決恢復(fù)過程的種子限制，不僅能夠迅速提高草地生產(chǎn)力和物種多樣性^［12］，還具有防止水土流失、涵養(yǎng)水源、提高草原碳匯的功能^［13］。豆科牧草可以進(jìn)行生物固氮，含有較高蛋白質(zhì)，飼用價值高，是退化草地補(bǔ)播修復(fù)中常用草種^［14］。

黃花苜蓿（Medicago falcata）是一種多年生苜蓿屬豆科牧草^［15］，廣泛分布于我國北方草甸草原、森林草原，適口性好，能夠?yàn)榕?、羊等牲畜提供?yōu)質(zhì)飼草。黃花苜蓿具有抗寒、抗旱、耐貧瘠、壽命長的特點(diǎn)，是退化草地補(bǔ)播的優(yōu)良豆科牧草^［16］。在呼倫貝爾退化草甸草原補(bǔ)播黃花苜蓿，能提高土壤氮含量，增加草地生物量^［17］。同時，黃花苜蓿有更高的蛋白質(zhì)含量以及更高濃度的鈣、鉀、鎂，補(bǔ)播黃花苜蓿能提高牧草的營養(yǎng)價值^［18］。然而，在退化草地上補(bǔ)播黃花苜蓿，植株苗期易受干旱脅迫和養(yǎng)分限制等因素的影響，導(dǎo)致幼苗發(fā)育緩慢、建植成功率低。因此，在呼倫貝爾退化草地上急需探究促進(jìn)黃花苜蓿幼苗生長的有效措施。

接種叢枝菌根真菌（AMF），為促進(jìn)黃花苜蓿幼苗的生長和建植成功提供了新思路。AMF能與世界上三分之二以上的陸生植物物種形成共生關(guān)系^［19］，在土壤功能^［20］和植物生長中發(fā)揮著多種重要作用。例如促進(jìn)植物對營養(yǎng)物質(zhì)^［21］和水^［22］的吸收利用，防止病原體侵染^［23］和降低重金屬污染^［24］。前人研究發(fā)現(xiàn)，在滅菌土壤上接種AMF后，紫花苜蓿的地上地下生產(chǎn)力均得到大幅提升^［25］。李重祥^［26］采用盆栽試驗(yàn)將天然草原采集優(yōu)勢菌種接種于滅菌土壤上，也發(fā)現(xiàn)三種AMF接種均能不同程度促進(jìn)紫花苜蓿的氮磷吸收、地上部干物質(zhì)量積累。然而，前期的研究大多數(shù)是在滅菌土壤上接種AMF，探究AMF對豆科牧草的作用效果，但是針對實(shí)際應(yīng)用場景，在未滅菌土壤上接種AMF對黃花苜蓿生長的研究鮮有報道。因此，本研究以呼倫貝爾退化草甸草原的未滅菌土壤為基質(zhì)土，進(jìn)行接種AMF種類及組合處理，通過分析AMF對黃花苜蓿地上和地下生物量、營養(yǎng)元素和菌根侵染率等指標(biāo)的影響，篩選出促進(jìn)黃花苜蓿生長的最優(yōu)AMF種類或組合，為退化草地補(bǔ)播黃花苜蓿提供技術(shù)支持和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

宿主植物：黃花苜蓿。種子采自呼倫貝爾草地農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站，地處內(nèi)蒙古呼倫貝爾陳巴爾虎旗（49°12′N，119°22′E），海拔高度為650 m。種子發(fā)芽率為64.2%。

供試菌劑：叢枝菌根真菌菌種為幼套近明球囊霉（Claroideoglomus etunicatum）（編號NM03F）、摩西斗管囊霉（Funneliformis mosseae）（編號BJ04A）和根內(nèi)根孢囊霉（Rhizophagus intraradices）（編號BJ09）。從北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營養(yǎng)與資源研究所購買。購買的接種劑為含有宿主植株根段、菌根真菌孢子和根外菌絲的砂土混合物。拿到菌劑后以砂土為擴(kuò)繁基質(zhì)，以盆栽高粱的方法在溫室中，培養(yǎng)3個月后，收獲盆栽基質(zhì)得到最終的AMF接種菌劑。

供試盆栽：上口徑9 cm，下口徑6 cm，盆高12 cm。

培養(yǎng)基質(zhì)：盆栽土壤采自呼倫貝爾退化草甸草原（49°26′N，120°9′E，海拔635 m），土壤pH值7.41，有機(jī)質(zhì)含量41.07 g·kg^-1，全碳含量28.21 g·kg^-1，全氮含量2.48 g·kg^-1，速效磷含量26.11 mg·kg^-1，速效鉀含量191.55 mg·kg^-1。原生植被中主要物種為匍匐委陵菜（Potentilla reptans）、車前（Plantago asiatica）。為保證基質(zhì)理化性質(zhì)均一，土壤過2 mm篩后混勻使用。為了最大程度模擬天然草地補(bǔ)播黃花苜蓿的實(shí)際應(yīng)用，本實(shí)驗(yàn)不對土壤進(jìn)行滅菌處理。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用單因素設(shè)計(jì)。因素為AMF種類或組合，包括不接種菌劑的對照（NA），單接種F. mosseae（Fm），C. etunicatum（Ce）或R. intraradices（Ri），混合接種F. mosseae和C. etunicatum（ME），F(xiàn). mosseae和R. intraradices（MI），C. Etunicatum和R. intraradices（IE）或F. mosseae，C. etunicatum和R. intraradices（MEI）混合接種，共8個處理。每個處理重復(fù)10次，共計(jì)80盆。

1.2.1 種子萌發(fā) 選取飽滿的黃花苜蓿種子，用10%過氧化氫消毒10 min后，用蒸餾水反復(fù)沖洗8次，在蒸餾水中浸泡2～3 h后裝入帶濾紙的培養(yǎng)皿中，再蓋上一層濾紙，加入適當(dāng)蒸餾水，保持濾紙濕潤，在智能人工氣候室（ZGND20170401，寧波江南儀器廠，中國）培養(yǎng)至萌發(fā)，培養(yǎng)條件為光照16 h，溫度為28℃，黑暗8 h，溫度設(shè)置為25℃^［27］。

1.2.2 培養(yǎng)基質(zhì)準(zhǔn)備 用95%酒精浸泡花盆60 min進(jìn)行消毒，晾干后，在花盆底部墊上一張定性濾紙，每盆裝入培養(yǎng)基質(zhì)300 g。對于接種處理，每盆接種含500個孢子的接種菌劑，孢子數(shù)量根據(jù)孢子密度換算確定，對照加入同等重量的滅菌菌劑。采用局部接種的方式進(jìn)行接種，先將花盆裝上200 g的基質(zhì)土壤，然后均勻地撒上接種菌劑，再覆蓋100 g基質(zhì)土壤。

1.2.3 幼苗移栽培養(yǎng) 待培養(yǎng)的黃花苜蓿種子長出兩片子葉后，移栽到已用蒸餾水澆透的花盆中，每盆移栽5株苗，5天后，間苗至3株。移栽初期保持土壤表層濕潤，及時補(bǔ)充水分?；ㄅ栉恢秒S機(jī)排列，每一周隨機(jī)換位置。在人工光照氣候室進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光照16 h，溫度為28℃，黑暗8 h，溫度設(shè)置為25℃。

1.3 取樣及測定

植物生長1個月后，測定黃花苜蓿的株高、生物量，植物根系的根瘤數(shù)，菌根侵染率^［27］，植株地上地下部碳、氮、磷、鋅、鈣、鎂等營養(yǎng)元素含量^［28］，以及盆栽土壤的碳、氮（元素分析儀vario MACRO cube，德國）和速效磷含量^［29］。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用單因素方差分析（One-way ANOVA）探究接種AMF種類或組合處理的效應(yīng)。數(shù)據(jù)分析在R 4.2.0中進(jìn)行，利用“rio”包和“tidyverse”包導(dǎo)入并整理數(shù)據(jù)，用“car”包下的qqPlot函數(shù)對數(shù)據(jù)正態(tài)性進(jìn)行檢驗(yàn)，用bartlett.test函數(shù)對數(shù)據(jù)方差齊次性進(jìn)行檢驗(yàn)。本試驗(yàn)的數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗(yàn)均滿足正態(tài)性和方差齊次性，之后利用aov函數(shù)進(jìn)行方差分析，并利用“agricolae”包下的LSD.test函數(shù)進(jìn)行多重比較，通過“randomForest”包分析各指標(biāo)對總生物量的重要性。作圖在GraphPad Prism 9軟件中進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 AMF接種種類或組合對黃花苜蓿生物量的影響

與NA相比，接種Fm顯著降低了黃花苜蓿地上生物量（P<0.05），其余接種處理間無顯著差異（圖1a）。在所有處理中，混合接種ME的黃花苜蓿地下生物量最高，顯著高于NA和其他接種處理（P<0.05）；接種Fm的黃花苜蓿地下生物量最低，顯著低于NA和其他接種處理（P<0.05）；其余接種處理間無顯著差異（圖1b）。在所有處理中，混合接種ME處理的黃花苜?？偵锪孔罡?，顯著高于對照（NA）和其他接種處理（P<0.05）；接種Fm的黃花苜?？偵锪孔畹?，顯著低于NA和其他接種處理（P<0.05）；其余接種處理間無顯著差異（圖1c）。

2.2 AMF接種種類或組合對黃花苜蓿根系性狀的影響

與NA相比，接種ME顯著提高了黃花苜蓿的總根長和根表面積（P<0.05），對根體積沒有顯著影響。接種Fm處理的總根長和根表面積在所有處理中最低。

2.3 AMF接種種類或組合下黃花苜蓿根瘤數(shù)和菌根侵染率

與NA相比，所有接種處理均顯著降低了黃花苜蓿的根瘤數(shù)（P<0.05），其中接種處理Fm，Ce，Ri，IE和ME間無顯著差異，接種處理ME，IE和MEI間無顯著差異（圖3a）。在所有處理中，接種Ce的黃花苜蓿的菌根侵染率最高，且顯著高于NA，而接種Fm的黃花苜蓿菌根侵染率最低，且顯著低于NA，其余接種處理間均無顯著差異，且與NA也無顯著差異（圖3b）。

2.4 AMF接種種類或組合對黃花苜蓿地上地下部碳氮磷含量的影響

與NA相比，僅接種Fm顯著降低了黃花苜蓿地上部植株氮含量（P<0.05，圖4b）；接種Fm顯著增加了黃花苜蓿地上部植株磷含量，且顯著高于其他接種處理（P<0.05，圖4c），接種Ce，Ri，ME，MI，IE，MEI相互間無顯著差異，接種Ce，ME和NA間無顯著差異。

與NA相比，接種Ri，ME，MI和IE均顯著降低了黃花苜蓿地下部植株碳含量（P<0.05），而其余處理與NA均無顯著差異，且相互間也無顯著差異（圖4 d）；所有接種處理均顯著降低了黃花苜蓿地下部根系氮含量（P<0.05，圖4e）；接種ME顯著提高了黃花苜蓿地下部植株磷含量（P<0.05），且顯著高于接種Fm，Ce，Ri，MEI和MI的地下部植株磷含量（P<0.05，圖4f）。

2.5 AMF接種種類或組合對黃花苜蓿植物地下部營養(yǎng)元素含量的影響

與NA相比，接種ME和MI顯著增加了黃花苜蓿地下部根系鐵含量，且兩者均顯著高于其他接種處理（P<0.05），但兩者間無顯著差異（圖5a）。接種ME還顯著增加了黃花苜蓿地下部根系鉀含量、鎂含量，且顯著高于其他接種處理（P<0.05，圖5b-c）。接種處理對黃花苜蓿地下部根系鈣含量無顯著影響（圖5e）。

2.6 AMF接種種類或組合對土壤養(yǎng)分含量的影響

與NA相比，接種ME，MI，IE和MEI顯著降低了土壤碳含量，其中接種MEI的土壤碳含量顯著低于其他任何接種處理（P<0.05）；而接種Fm，Ce，Ri的土壤碳含量與NA相比無顯著差異，且三者相互間也無顯著差異（圖6a）。與NA相比，接種ME顯著提高了土壤氮含量和速效磷含量（P<0.05），且在所有接種處理中氮含量和速效磷均最高，但與接種Ri，MI，IE間無顯著差異（圖6a-b）；而接種MEI的土壤氮含量最低，顯著低于其他任何接種處理（P<0.05，圖6b）。

2.7 各指標(biāo)相關(guān)性分析和隨機(jī)森林模型

總生物量、地上生物量和地下生物量與總根長、根系鐵含量、地上部鎂含量均具有顯著正相關(guān)關(guān)系。總生物量和地下生物量還與根表面積、根系鎂和磷含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系，而與根系碳含量呈顯著負(fù)相關(guān)。菌根侵染率與總生物量、地上生物量以及地上部氮含量呈顯著正相關(guān)（圖7a）。此外，隨機(jī)森林模型的結(jié)果表明，根系磷、鉀、碳、鐵元素含量和植株氮、磷、碳含量對總生物量的重要性更高，而其他變量對總生物量變化的重要性較低（圖7b）。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，未滅菌的退化土壤上接種Fm菌劑后地上地下生物量均表現(xiàn)為下降（圖1），在前人的研究中，有類似的結(jié)果發(fā)現(xiàn)。例如在紫花苜蓿上單接種商業(yè)菌劑Glomus spp后植物根系生物量表現(xiàn)為下降^［30］。但是，在未滅菌的退化土壤上共同接種Fm和Ce菌劑提高了黃花苜蓿的地下生物量和總生物量（圖1），與前人在橡膠樹（Hevea brasiliensis）和馬鈴薯（Solanum tuberosum）上混合接種AMF菌劑后表現(xiàn)出積極的結(jié)果一致^［31-32］。單接種Fm菌劑產(chǎn)生負(fù)面影響，可能是Fm菌劑抑制本土AMF或其他有益微生物發(fā)揮積極的作用。然而，共同接種Fm和Ce菌劑，可抵消Fm菌劑負(fù)面影響。這與Horsch等^［33］研究結(jié)果一致，接種來自不同科的多種AMF物種確實(shí)會對植物生長產(chǎn)生更有益的影響，多種AMF為植物提供功能互補(bǔ)的積極作用。增加有益物種或具有互補(bǔ)功能的物種進(jìn)行混合菌劑接種可能將表現(xiàn)出更高的生物量增加^［34-35］。但本實(shí)驗(yàn)中其余混合接種菌劑與單一菌劑接種處理差異并不明顯，Qin等^［36］的研究也發(fā)現(xiàn)單一和混合AMF接種對植物生物量的影響之間不存在顯著差異。總的來說，在退化草甸草原未滅菌土壤上接種具有互補(bǔ)性的菌劑可能對黃花苜蓿的生長能發(fā)揮更積極的作用，降低單接種造成植物生長抑制的風(fēng)險。

共同接種Fm和Ce菌劑顯著提高黃花苜蓿幼苗的總根長和根表面積（圖2a，c），有利于幼苗擴(kuò)大養(yǎng)分吸收的面積。隨機(jī)森林模型結(jié)果表明，根系養(yǎng)分含量對總生物量的貢獻(xiàn)較大（圖7b）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，共同接種Fm和Ce菌劑后根系鐵、鉀、鎂、錳、磷的含量顯著提高（圖5），這些元素轉(zhuǎn)運(yùn)至地上部有利于促進(jìn)黃花苜蓿的光合作用，積累更多的同化物。前人的研究表明，營養(yǎng)元素的可用性會影響植物生產(chǎn)力^［37］。鐵、鉀、鎂、錳等營養(yǎng)元素是生物驅(qū)動過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，例如光合作用、呼吸作用、生物分子合成、氧化還原穩(wěn)態(tài)以及細(xì)胞生長和免疫系統(tǒng)功能，此外鐵和錳與微生物呼吸有關(guān)，鐵還與生物固氮過程相關(guān)^［38-39］。因此，共同接種Fm和Ce菌劑可能通過提高土壤速效磷和氮含量（圖6），促進(jìn)了黃花苜蓿幼苗生物量的積累。

本研究發(fā)現(xiàn)，各接種處理均有菌根侵染，但接種AMF菌劑的處理根系根瘤數(shù)都降低（圖3），這可能是因?yàn)锳M真菌與多種本地微生物相互作用，本地微生物（如根瘤菌）與AMF競爭而受到負(fù)面影響，這與Giovannini等^［40］的綜述結(jié)果一致。接種AMF對豆科植物結(jié)瘤的影響往往是積極的，而根瘤菌對AMF定植的影響卻并不總是積極的，根瘤菌增強(qiáng)了AMF定植^［41］，或減少^［42］，或沒有影響^［43］?？赡苷f明根瘤菌和AMF是功能協(xié)同，但是在資源利用方面存在競爭關(guān)系。當(dāng)AM真菌與不同種類本地微生物相互作用時^［44］，與本地真菌生態(tài)位的重疊程度過高可能導(dǎo)致接種菌劑會失效^［45］。如果接種的菌劑是優(yōu)越的競爭者，就能在宿主根中占主導(dǎo)地位，將成功建立^［46］。

總體來說，本試驗(yàn)是在非滅菌土上進(jìn)行，滅菌和不滅菌處理的區(qū)別在于未滅菌處理部分通常含有本地AM真菌繁殖體，而大多數(shù)溫室AMF接種試驗(yàn)中土壤一般進(jìn)行了滅菌處理，對照盆栽基質(zhì)不含AM真菌繁殖體或AMF多樣性高度降低。因此，未滅菌的土壤上接種部分AMF對黃花苜蓿幼苗生長沒有顯著影響，可能與本土AMF的互作有關(guān)。然而，本實(shí)驗(yàn)為了針對在天然退化草地補(bǔ)播黃花苜蓿配施AMF菌劑的應(yīng)用情況，并未對取回的呼倫貝爾退化草地土進(jìn)行滅菌的處理，保留了原生的微生物群落。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Fm和Ce菌劑混合接種效果最好，能夠最大程度地指導(dǎo)原位的草地修復(fù)補(bǔ)播實(shí)踐。

4 結(jié)論

我們研究發(fā)現(xiàn)，在未滅菌的退化草甸草原土壤上共同接種幼套近明球囊霉和摩西斗管囊霉能達(dá)到最優(yōu)的促生效果，且能夠抵消摩西斗管囊霉菌劑單獨(dú)接種的負(fù)效應(yīng)，說明補(bǔ)播實(shí)踐中叢枝菌根真菌混合接種比單接種效應(yīng)更好。同時接種幼套近明球囊霉和摩西斗管囊霉菌劑顯著提高了根系菌根侵染率，活化了土壤速效磷，增加了土壤氮含量，顯著提高了根系的鐵、鉀、鎂、錳、磷含量，從而顯著提高了黃花苜蓿的地下生物量和總生物量。因此，在退化草甸草原補(bǔ)播黃花苜蓿時建議同時接種幼套近明球囊霉和摩西斗管囊霉混合菌劑。

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（責(zé)任編輯 付 宸）