腸道菌群代謝產(chǎn)物對腦卒中后神經(jīng)康復(fù)的影響及其機制研究

摘要 目的：探討腸道菌群代謝產(chǎn)物對腦卒中后神經(jīng)康復(fù)的影響及其機制。方法：于2021年5月—2022年6月在湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科連續(xù)招募132例急性缺血性腦卒中病人。使用16S核糖體RNA（rRNA）基因（V3-V4區(qū)）測序分析病人入院后24 h內(nèi)的腸道微生物組。根據(jù)3個月改良Rankin量表（mRS）評分，將病人分為預(yù)后良好組（mRS評分 0～2分，105例）和預(yù)后不良組（mRS評分3～6分，27例）。從每份糞便樣品分離0.2 g，通過氣相色譜/質(zhì)譜分析總短鏈脂肪酸（SCFAs）、乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽含量。結(jié)果：與預(yù)后良好組相比，預(yù)后不良組病人年齡更大，高血壓和心房顫動的發(fā)生率更高，基線美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（NIHSS）評分更高，擴散加權(quán)成像的Alberta卒中項目早期CT評分（DWI-ASPECTS）評分更低（P＜0.05）。預(yù)后不良組觀察到的物種和Chao1低于預(yù)后良好組（P＜0.05）。與預(yù)后良好組比較，預(yù)后不良組6個產(chǎn)生SCFAs的屬（擬桿菌屬、糞腸桿菌屬、羅氏菌屬、瘤胃球菌屬、糞球菌屬和丁酸球菌屬）的豐度均明顯降低（P＜0.05）。預(yù)后不良組總SCFAs、乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽的中值濃度分別為95.89、64.66、16.72和10.14 μmol/g，而預(yù)后良好組的中值濃度分別為119.30、82.05、20.89和14.16 μmol/g，兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（U值分別為3 501，3 509，3 877，4 407，P均＜0.000 1）。多變量分析結(jié)果顯示，總SCFAs［OR＝12.44，95%CI（1.50，103.07）］和丁酸鹽［OR＝59.72，95%CI（2.67，1 332.15）］是腦卒中病人90 d不良功能的獨立危險因素（P＜0.05）。結(jié)論：總SCFAs水平降低，尤其是丁酸鹽水平，與急性缺血性腦卒中病人90 d不良功能結(jié)局風(fēng)險增加相關(guān)，表明SCFAs可能是識別不良預(yù)后的有用生物標志物。

關(guān)鍵詞 腦卒中；腸道菌群；預(yù)后；神經(jīng)康復(fù)

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.20.030

Effect of Intestinal Flora Metabolites on Neurological Rehabilitation after Stroke

LI Wenya¹， LI Chunhui¹， XIAO Chun²， LIU Wenjuan¹， PENG Xiaoling¹

1.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410000， Hunan， China， E-mail： toury009@163.com; 2.Hunan Cancer Hospital， Changsha 410000， Hunan， China

Abstract Objective：To explore the effect of intestinal flora metabolites on neurological rehabilitation after stroke and its mechanism.Methods：From May 2021 to June 2022，132 patients with acute ischemic stroke were recruited continuously.16S ribosomal RNA（rRNA） gene （V3-V4 region） was used to analyze their intestinal microbiota within 24 hours after admission.According to the 3-month mRS score，participants were divided into two groups：better functional group（n＝105，mRS 0-2） and poor functional group（n＝27，mRS 3-6）.0.2 g was separated from each fecal sample，and the contents of total short-chain fatty acids （SCFAs），acetate，propionate，and butyrate were analyzed by gas chromatography/mass spectrometry.Results：Compared with the group with better prognosis，the patients with poor prognosis were older，with higher incidence of hypertension and atrial fibrillation，higher baseline National Institutes of Health Stroke Scale（NIHSS） score and lower the Alberta Stroke Programme Early CT Score applied to diffusion weighted imaging（DWI-ASPECTS） score（P＜0.05）.The observed species and Chao1 in the poor prognosis group were lower than those in the better prognosis group（P＜0.05）.Compared with the group with better prognosis，the abundance of six genera（Bacteroides， Enterobacter faecalis，Roche，Ruminococcus，Enterococcus faecalis，and Butyrococcus） producing SCFAs was lower，and all of them reduced significantly in the group with poor prognosis（P＜0.05）.The median concentrations of total SCFAs，acetate，propionate，and butyrate in patients with poor prognosis were 95.89，64.66，16.72，and 10.14 μmol/g，respectively，while those in patients with good prognosis were 119.30，82.05，20.89，and 14.16 μmol/g，respectively，and the difference between the two groups was statistically significant，the U values were 3 501，3 509，3 877，and 4 407，respectively（P＜0.000 1）.Multivariate analysis showed that total SCFAs（OR＝12.44，95%CI 1.50-103.07） and butyrate（OR＝59.72，95%CI 2.67-1 332.15） were independent risk factors for 90-day dysfunction in stroke patients（P＜0.05）.Conclusion：The decrease of total SCFAs level，especially butyrate level，is related to the increased risk of 90-day adverse functional outcome in patients with acute ischemic stroke，indicating that SCFAs may be a useful biomarker to identify adverse prognosis.

Keywords acute ischemic stroke; intestinal flora; prognosis; neurological rehabilitation

基金項目 湖南省衛(wèi)健委科研計劃項目（No.202201322612）

作者單位 1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院（長沙 410000），E-mail：toury009@163.com；2.湖南省腫瘤醫(yī)院（長沙 410000）

引用信息 李文雅，李春輝，肖純，等.腸道菌群代謝產(chǎn)物對腦卒中后神經(jīng)康復(fù)的影響及其機制研究［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（20）：3801-3806.

在我國，由局灶性閉塞或動脈狹窄引起的缺血性腦卒中嚴重危及人類健康^［1］。新出現(xiàn)的證據(jù)表明，腸腦軸在腦卒中發(fā)展中起著重要作用^［2］。之前的一項研究表明，在缺血性腦卒中病人中也發(fā)現(xiàn)了腸道微生物群的顯著生態(tài)失調(diào)^［3-4］。據(jù)報道，腸道微生物群來源的短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）參與調(diào)節(jié)大腦功能，并有助于維持腸道和血腦屏障的滲透性^［5］。因此，SCFAs可能是腦卒中的新治療靶點。目前，尚未在不同預(yù)后的腦卒中病人中得到充分評估糞便SCFAs譜與腦卒中結(jié)局的潛在關(guān)聯(lián)。本研究進行了基于16S核糖體RNA （rRNA）基因測序的研究，以表征缺血性腦卒中急性期的腸道微生物群，并比較不同功能結(jié)局［3個月改良Rankin量表（modified Rankin Scale，mRS）0～2分與3～6分］病人的SCFAs水平^［6］，旨在確定其與腦卒中預(yù)后的關(guān)系，為腦卒中的臨床治療提供了新的見解。

1 資料與方法

1.1 受試者和樣本收集

于2021年5月—2022年6月在湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科連續(xù)招募參與者。納入標準：1）年齡≥50歲；2）當?shù)鼐幼?個月以上；3）在癥狀發(fā)作的3 d內(nèi)通過磁共振成像（MRI）證實前循環(huán)中的缺血性腦卒中；4）受試者簽署書面知情同意書。排除標準：1）出血性腦卒中；2）慢性炎癥或免疫疾病史；3）嚴重肝或腎功能障礙、血液病和惡性腫瘤史；4）在過去1個月內(nèi)服用益生菌、抗生素、皮質(zhì)類固醇或免疫抑制劑；5）糞便或血液樣品收集不足。

1.2 資料收集和指標測定

入院后，通過面對面訪談收集人口統(tǒng)計信息和病史，并評估基線美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（NIHSS）和擴散加權(quán)成像的Alberta卒中項目早期CT評分（DWI）。入院后24 h內(nèi)采集糞便和空腹血樣。使用帶勺子的無菌糞便容器收集糞便樣本，每個樣本重約2 g。收集后，新鮮糞便和血清樣本立即（在1 h內(nèi)）儲存在－80 ℃下，直至進行分析。采集空腹血樣，在醫(yī)院中心實驗室測量總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）水平。在腦卒中后3個月，通過電話訪談使用mRS評分評估病人的功能結(jié)果。根據(jù)3個月的mRS評分，參與者被分為兩組：預(yù)后良好組（mRS評分0～2分）和預(yù)后不良組（mRS評分3～6分）。

1.3 糞便DNA提取、聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）擴增和測序

使用PowerSoil DNA Extraction 88試劑盒（深圳市易瑞生物技術(shù)股份有限公司）從糞便樣品中提取糞便基因組DNA。通過PCR擴增細菌16S rRNA基因的V3-V4可變區(qū)，使用正向引物（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和反向引物（5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）。將PCR產(chǎn)物以等摩爾比混合并純化。文庫構(gòu)建和測序步驟由北京生物標記技術(shù)有限公司完成。在Illumina HiSeq 2500平臺上對PCR擴增子測序。根據(jù)2個配對末端序列之間的重疊，使用SeqPrep合并配對末端序列，并使用開源軟件Quantitative Insights into Microbial Ecology（QIIME，版本1.9.1）評估結(jié)果的質(zhì)量。將＞200 bp的序列修剪為200 bp，而那些＜200 bp的序列被去除。QIIME工作流腳本pick_closed_reference_otus.py用于移除嵌合體、聚類基于參考的操作分類單元并生成BIOM文件。將所有樣品標準化到相同的水平，以避免由于使用不同的測序深度而可能產(chǎn)生的誤差。為了保留盡可能多的序列，在本研究中，每個樣本都被標準化為3 500個序列。

1.4 糞便SCFAs檢測

從每份糞便樣品分離0.2 g，用于分析總SCFAs、乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽含量。樣品首先在1.0 mL含有2，2-二甲基丁酸內(nèi)標的超純水中勻漿。然后將勻漿以12 000 r/min離心（4 ℃，10 min）。將所得上清液轉(zhuǎn)移到新的Eppendorf管中，并與10 μL 50%硫酸、0.5 g硫酸鈉和2 mL分析純乙醚混合。將混合物渦旋1 min，然后以5 000 r/min離心（室溫，10 min）。最后收集乙醚層，進行氣相色譜質(zhì)譜選擇性檢測（5977B GC/MSD，美國Agilent Technologies公司）。無HP脂肪酸相（HP-FFAP）毛細管柱（長30 m，內(nèi)徑0.25 mm，19091F-433，美國Agilent Technologies公司）用于色譜分離，氦氣作為載氣。柱溫箱溫度以15 ℃/min的速度從90 ℃升至180 ℃。收集氣相色譜/質(zhì)譜（GC/MS）數(shù)據(jù)，并使用MassHunter工作站軟件（美國Agilent Technologies公司）進行分析。根據(jù)內(nèi)標計算最終濃度，并表示為每克濕糞便的微摩爾數(shù)（μmol/g）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。定性資料用例數(shù)、百分比（%）表示，通過χ²檢驗進行比較；定量資料用中位數(shù)（四分位間距）或均數(shù)±標準差（x±s）表示，通過t檢驗或Mann-Whitney U檢驗進行比較。多變量邏輯回歸模型包括單變量模型中所有具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.10）的變量以及具有臨床意義的變量。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 研究人群基本特征

本研究共招募了132名受試者（89名男性和43名女性），年齡50～91歲（平均64.5歲）。經(jīng)過90 d的隨訪，27例病人（20.5%）的功能結(jié)果不佳（mRS評分 3～6分），納入預(yù)后不良組。其余105例病人納入預(yù)后良好組。與預(yù)后良好組相比，預(yù)后不良組病人年齡大，高血壓和心房顫動的發(fā)生率更高，基線NIHSS評分更高，DWI評分更低（P＜0.05）。小血管閉塞在預(yù)后良好組中更常見，而預(yù)后不良組更可能有其他病因（包括心源性栓塞、其他確定原因的腦卒中和原因不明的腦卒中）。兩組性別、糖尿病、冠心病病史、TC、HDL、LDL、氧化三甲胺（TMAO）、白細胞介素（IL）-10、IL-17、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。此外，使用抗凝劑、抗血小板聚集藥物、他汀類藥物、抗高血壓藥物和抗糖尿病藥物等用藥史方面組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表1。

2.2 腸道微生物多樣性比較

微生物群落的α多樣性分析包括物種豐富度（由觀察到的物種、Chao1表示）和均勻度（由香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)表示），分析結(jié)果顯示，預(yù)后不良組觀察到的物種和Chao1低于預(yù)后良好組（P＜0.05）。兩組香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見圖1。

2.3 腸道微生物區(qū)系的分類學(xué)差異

在屬水平上，與預(yù)后良好組相比，預(yù)后不良組6個產(chǎn)生SCFAs的屬（擬桿菌屬、糞腸桿菌屬、羅氏菌屬、瘤胃球菌屬、糞球菌屬和丁酸球菌屬）的豐度均明顯降低（P＜0.05）。詳見圖2。

2.4 兩組SCFAs、乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽水平比較

本研究進一步分析了糞便中總SCFAs、乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽的水平。預(yù)后不良組總SCFAs、乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽的中值濃度分別為95.89，64.66，16.72和10.14 μmol/g，預(yù)后良好組的中值濃度分別為119.30，82.05，20.89和14.16 μmol/g，兩組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（U值分別為3 501，3 509，3 877，4 407，P均＜0.000 1）。詳見圖3。

2.5 SCFAs和90 d不良功能結(jié)果之間的關(guān)系

多變量分析結(jié)果顯示，在模型3中總SCFAs［OR＝12.44，95%CI（1.50，103.07）］和丁酸鹽［OR＝59.72，95%CI（2.67，1 332.15）］是腦卒中病人90 d不良功能的獨立危險因素（P＜0.05）。詳見表2。

上述因素加上用藥史、TOAST分型、NIHSS基線、DWI進行調(diào)整。

3 討 論

隨著對“腸道-腦軸”的廣泛認可，腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間通過腸道微生物群的交流受到了關(guān)注^［7］。腸道微生物群生態(tài)失調(diào)已被證明是腦卒中發(fā)展和進展的驅(qū)動力，重塑腸道微生物群為缺血性腦卒中提供了一種有效的治療方法^［8］。之前通過16S rRNA測序表明，大動脈粥樣硬化性腦卒中病人中存在腸道菌群失調(diào)，腸道微生物群的菌群失調(diào)指數(shù)與腦損傷程度和預(yù)后不良相關(guān)^［9］。動物研究表明，腦卒中會導(dǎo)致腸道屏障功能障礙，如緊密連接蛋白的破壞、交感神經(jīng)系統(tǒng)的失調(diào)和腸道運動障礙，從而導(dǎo)致腸道微生物群生態(tài)失調(diào)^［10-11］。這可能會反向阻礙神經(jīng)再生和擴大腦卒中核心容量，導(dǎo)致不良的功能結(jié)果。在臨床研究中，Yamashiro等^［12］發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中病人出現(xiàn)腸道生態(tài)失調(diào)，并與宿主代謝和炎癥相關(guān)。本研究進一步調(diào)查了不同預(yù)后腦卒中病人的腸道微生物群，并確定了預(yù)后不良組中6個產(chǎn)生SCFAs的屬（擬桿菌屬、糞腸桿菌屬、羅氏菌屬、瘤胃球菌屬、糞球菌屬和丁酸球菌屬）的豐度均顯著降低，這一發(fā)現(xiàn)與先前的觀察結(jié)果一致，即減少SCFAs產(chǎn)生菌（如糞腸桿菌屬、薔薇菌屬和糞球菌屬）可預(yù)測不良的早期腦卒中結(jié)果^［13］。本研究結(jié)果強調(diào)了特定細菌與不利的3個月腦卒中預(yù)后相關(guān)。

SCFAs主要包括乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽，主要由腸道微生物發(fā)酵膳食纖維產(chǎn)生。SCFAs調(diào)節(jié)腸道和血腦屏障的通透性，并改善高血壓、糖尿病、多發(fā)性硬化、情感和認知功能障礙以及心血管疾病^［14］。在日本進行的一項小樣本病例對照研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中病人的乙酸水平下降，戊酸水平上升^［12］。此外，在腦卒中后認知障礙小鼠中觀察到梭桿菌屬細菌增加和SCFAs缺乏，服用益生菌可緩解抑郁和焦慮^［15］。本研究中，觀察到預(yù)后不良腦卒中病人的糞便SCFAs急劇下降。紊亂的腸道微生物群和低SCFAs水平，尤其是丁酸鹽，似乎預(yù)示著不良的腦卒中預(yù)后。這一發(fā)現(xiàn)與先前的觀察結(jié)果一致，即調(diào)節(jié)腦卒中后凋亡和炎癥的丁酸鹽可能通過干擾相關(guān)酶的乙?；g接影響葡萄糖代謝，并改善大腦中動脈閉塞模型（MCAO）大鼠神經(jīng)功能^［16-17］。研究表明，SCFAs的減少與各種疾病和不良后果有關(guān)。例如，SCFAs的定量減少也被證明有助于慢性腎臟疾病的進展^［18］。此外，多發(fā)性硬化病人的丙酸顯著減少，而丙酸攝入增加了T-調(diào)節(jié)細胞，減少了年度復(fù)發(fā)和腦萎縮，表明丙酸可能是一種有效的免疫調(diào)節(jié)補充劑^［19］。SCFAs譜的變化因不同疾病而異，迄今為止很少進行SCFAs干預(yù)的臨床試驗。因此，仍然不確定哪些SCFAs對于改善腦卒中病人的預(yù)后有益。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，出現(xiàn)90 d不良功能結(jié)局的腦卒中病人體內(nèi)缺乏產(chǎn)SCFAs細菌和糞便中SCFAs水平較低?？係CFAs水平降低，尤其是丁酸鹽水平，與90 d不良功能結(jié)局風(fēng)險增加相關(guān)，表明SCFAs可能是識別不利預(yù)后的有用生物標志物。膳食纖維補充劑能增加SCFAs水平，并有助于產(chǎn)生SCFAs細菌，可能有助于改善腦卒中病人預(yù)后。

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（收稿日期：2023-04-11）

（本文編輯 王麗）