白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ調(diào)節(jié)Shh/Ptch1信號(hào)通路對(duì)腦卒中大鼠神經(jīng)功能的影響

摘要 目的：探究白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ（ATⅢ）調(diào)節(jié)音猬因子（Shh）/碎片蛋白1（Ptch1）信號(hào)通路對(duì)腦卒中大鼠神經(jīng)功能損傷的影響。方法：將60只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（sham組）、大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）組、ATⅢ L組、ATⅢ M組、ATⅢ H組與ATⅢ H＋Cyclopamine組，每組10只。ATⅢ L組、ATⅢ M組、ATⅢ H組分別灌胃0.5、1.0、2.0 mg/kg ATⅢ；ATⅢ H＋Cyclopamine組灌胃2 mg/kg ATⅢ，同時(shí)經(jīng)尾靜脈注射10 mg/kg的Shh信號(hào)特異性阻斷劑環(huán)巴胺；sham組和MCAO組灌胃等量的生理鹽水。各組大鼠給藥每日1次，均連續(xù)給藥4周。進(jìn)行平衡木行走實(shí)驗(yàn)評(píng)分和神經(jīng)功能缺損評(píng)分；檢測(cè)腦組織含水量；蘇木素-伊紅（HE）染色和尼氏染色檢測(cè)腦組織神經(jīng)元損傷情況；蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)腦組織中Shh、Patch1蛋白表達(dá)。結(jié)果：與MCAO組相比，ATⅢ L組、ATⅢ M組、ATⅢ H組大鼠平衡木實(shí)驗(yàn)評(píng)分、神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦組織含水量明顯降低，尼氏小體及腦組織中Shh、Patch1蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）；與ATⅢH組相比，ATⅢ H＋Cyclopamine組大鼠平衡木實(shí)驗(yàn)評(píng)分、神經(jīng)功能缺損評(píng)分及腦組織含水量明顯升高，尼氏小體數(shù)量及腦組織中Shh、Patch1蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論：ATⅢ可改善缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)功能缺損，其作用機(jī)制和Shh/Ptch1信號(hào)通路激活有關(guān)。

關(guān)鍵詞 腦卒中；白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ；音猬因子/碎片蛋白1信號(hào)通路；神經(jīng)功能；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.20.008

作者單位 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇一醫(yī)院（合肥 230031），E-mail：neighpey124@21cn.com

引用信息 周茜，陸平.白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ調(diào)節(jié)Shh/Ptch1信號(hào)通路對(duì)腦卒中大鼠神經(jīng)功能的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（20）：3704-3709.

腦卒中是臨床常見的一種腦血管疾病，具有較高的致殘率和致死率^［1］。缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）是腦卒中常見類型之一，占所有腦卒中的75%～90%，其會(huì)中斷局部腦組織血流，促進(jìn)組織軟化壞死及神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，從而導(dǎo)致病人出現(xiàn)昏迷或死亡^［2-3］。白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ（atractylenolide Ⅲ，ATⅢ）是白術(shù)的主要活性成分，有研究發(fā)現(xiàn)，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ可顯著改善癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力^［4］，但目前關(guān)于其對(duì)腦卒中大鼠神經(jīng)功能的改善作用鮮有報(bào)道。音猬因子（sonic hedgehog，Shh）是一種分泌蛋白，在機(jī)體的組織和器官中廣泛表達(dá)，可介導(dǎo)胚胎組織器官的生成發(fā)育，且對(duì)缺血性損傷有較好的促進(jìn)作用^［5-6］。Shh可結(jié)合特定的受體碎片蛋白1（patched 1，Ptch1）而解除Ptch1，通過抑制G蛋白偶聯(lián)受體平滑蛋白（smoothened，Smo）而激活下游轉(zhuǎn)錄因子膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源物（glima-associated oncogene homolog，Gli-1），從而啟動(dòng)與細(xì)胞周期進(jìn)程相關(guān)的靶基因的表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，激活癡呆大鼠腦組織中Shh/Ptch1通路，可改善大鼠的認(rèn)知功能障礙^［7-8］。但目前關(guān)于Shh/Ptch1通路對(duì)腦卒中大鼠神經(jīng)功能的影響報(bào)道較少。因此，本研究旨在探究ATⅢ通過調(diào)節(jié)Shh/Ptch1信號(hào)通路對(duì)腦卒中大鼠神經(jīng)功能損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只雄性SD大鼠均購自青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SCXK（青）2018-0013。大鼠體質(zhì)量為220～240 g，將大鼠統(tǒng)一飼養(yǎng)在動(dòng)物房內(nèi)，溫度22～25 ℃，相對(duì)濕度為50%，光照明暗12 h/12 h循環(huán)交替，自由飲水?dāng)z食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 試劑和儀器

AT Ⅲ（純度＞99.91%，上海純優(yōu)生物科技有限公司）；尼氏染色液、RIPA裂解液（上海碧云天生物科技有限公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白試劑盒、Trizol試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（賽默飛世爾科技中國公司）；蘇木素染色液、伊紅染色液（北京雷根生物技術(shù)有限公司）；Shh信號(hào)特異性阻斷劑環(huán)巴胺（美國MCE公司）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）（美國Sigma公司）；兔抗鼠Shh抗體、兔抗鼠Ptch1抗體（美國Santa Cruz公司）；組織研磨器（武漢新縱科生物技術(shù)有限公司）。

1.3 分組和模型制備^［9］

將60只大鼠隨機(jī)分為6組：假手術(shù)組（sham組）、大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）組、ATⅢ L組、ATⅢ M組、ATⅢ H組與ATⅢ H＋Cyclopamine組，每組10只。各組大鼠參照Longa等方法制備缺血性腦卒中模型。麻醉大鼠并固定于鼠板上，切開大鼠頸部正中線處皮膚，將頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈分離，將頸總動(dòng)脈的近心端和頸外動(dòng)脈的分叉處結(jié)扎，用手術(shù)線在頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端靠近頸總動(dòng)脈分叉處打一個(gè)活結(jié)，將頸內(nèi)動(dòng)脈夾閉，在頸總動(dòng)脈上用眼科剪剪一個(gè)V形的小口，用鑷子將蘸有石蠟的線栓插入頸總動(dòng)脈，直到有輕微阻力時(shí)停止插入。將頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端靠近頸總動(dòng)脈分叉處全部結(jié)扎，縫合大鼠頸部皮膚，碘附消毒。腦缺血2 h后，拔出線栓形成再灌注。sham組除不插入線栓外，步驟和其余各組相同。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：大鼠出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損。

造模成功后2 h，ATⅢ L組、ATⅢ M組、ATⅢ H組分別灌胃0.5、1.0、2.0 mg/kg ATⅢ；ATⅢ H＋Cyclopamine組灌胃2.0 mg/kg ATⅢ，同時(shí)經(jīng)尾靜脈注射10 mg/kg的Shh信號(hào)特異性阻斷劑環(huán)巴胺；sham組和MCAO組灌胃等量的生理鹽水。各組大鼠給藥每日1次，均連續(xù)給藥4周。

1.4 平衡木行走實(shí)驗(yàn)評(píng)分

分別于造模后1 d、給藥1周、2周、4周時(shí)測(cè)定運(yùn)動(dòng)整合及協(xié)調(diào)能力，將長80 cm、寬2.5 cm的平衡木平放在距離地面高10 cm處，術(shù)前1周訓(xùn)練大鼠能順利在平衡木上行走，每天早晚各1次，每次10 min。按照Feeney 5級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分，詳見表1。

1.5 神經(jīng)功能缺損評(píng)分

采用Zeo Longa 5分評(píng)定法對(duì)大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

1.6 腦組織含水量測(cè)定

隨機(jī)處死各組部分大鼠，立即取腦，摘掉小腦及腦干，將腦組織表面的血液沖洗并擦拭干凈，沿大腦的中線切開腦組織，稱取缺血側(cè)腦組織重量為濕重；將稱量濕重后的腦組織置于恒溫烘烤箱中，烘干腦組織之恒重后稱取重量為干重。用濕重減干重再除以濕重計(jì)算各組大鼠腦組織含水量。

1.7 蘇木素-伊紅（HE）染色

麻醉大鼠并取大鼠缺血側(cè)腦組織，固定腦組織于4%多聚甲醛溶液中，48 h后經(jīng)乙醇梯度脫水，后將切片組織用石蠟包埋，用切片機(jī)將組織切成薄片，厚度為3 μm，分別經(jīng)HE染色，于顯微鏡下觀察腦組織中神經(jīng)元病理學(xué)變化。

1.8 尼氏染色

取1.7中切片脫蠟處理，在37 ℃環(huán)境中用硫堇染色切片1 h。將切片分化5 s，消除切片中大部分的染色。中性樹膠將清洗后的切片組織封片。光學(xué)顯微鏡下觀察大腦皮層和海馬CA1區(qū)細(xì)胞形態(tài)，以評(píng)估腦損傷。

1.9 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)腦組織中Shh、Ptch1蛋白表達(dá)

收集胃黏膜組織，提取組織中總蛋白， 3，3′-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）法檢測(cè)蛋白濃度。配置等濃度蛋白溶液2 μg/mL，體積的煮沸溶液10 min后保存蛋白溶液于－20 ℃的冰箱。取蛋白樣品30 μg，電泳蛋白樣品后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，加入5%的脫脂奶粉到PVDF膜上，封閉PVDF膜1 h，分別加入一抗Shh、Ptch1（1∶1 000），在4 ℃環(huán)境中孵育一抗過夜，后清洗PVDF膜，加入相應(yīng)的二抗（1∶1 000），室溫孵育二抗2 h。將電化學(xué)發(fā)光（ECL）劑加入細(xì)胞中曝光，用顯影液顯影，用Image Lab軟件分析各條帶灰度值。

1.10 倫理審查

本研究獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（審批號(hào)：PH-2024-05-36）。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Graphpad priam 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），各組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠平衡木實(shí)驗(yàn)評(píng)分比較

造模后1 d，MCAO組、ATⅢ L組、ATⅢ M組、ATⅢ H組和ATⅢ H＋Cyclopamine組大鼠平衡木實(shí)驗(yàn)評(píng)分相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），且各組評(píng)分均高于sham組（P＜0.05）；給藥后1周、2周、4周時(shí)與MCAO組相比，ATⅢ L組、ATⅢ M組、ATⅢ H組大鼠平衡木實(shí)驗(yàn)評(píng)分明顯降低，且呈濃度依賴性（P＜0.05）；與ATⅢ H組相比，ATⅢ H＋Cyclopamine組大鼠平衡木實(shí)驗(yàn)評(píng)分明顯升高（P＜0.05）。詳見表3。

2.2 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較

MCAO組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分較sham組增加（P＜0.05）；與MCAO組相比，ATⅢ L組、ATⅢ M組、ATⅢ H組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分均逐漸降低，呈濃度依賴性（P＜0.05）；與ATⅢ H組相比，ATⅢ H＋Cyclopamine組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯增加（P＜0.05）。詳見圖1。

2.3 各組大鼠缺血側(cè)腦組織含水量比較

與sham組相比，MCAO組大鼠缺血側(cè)腦組織含水量明顯增加（P＜0.05）；與MCAO組相比，ATⅢ L組、ATⅢ M組、ATⅢ H組大鼠缺血側(cè)腦組織含水量明顯降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；與ATⅢ H組相比，ATⅢ H＋Cyclopamine組大鼠缺血側(cè)腦組織含水量明顯升高（P＜0.05）。詳見圖2。

2.4 各組大鼠腦組織病理學(xué)變化比較

sham組大鼠腦組織神經(jīng)元排列整齊緊密，細(xì)胞大小均一，神經(jīng)結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞膜完整且核膜清晰，胞質(zhì)感染均勻；MCAO組大鼠有大量壞死的神經(jīng)細(xì)胞，神經(jīng)元細(xì)胞減少，細(xì)胞膜破裂，核膜消失，胞質(zhì)染色變淺；ATⅢ L組、ATⅢ M組、ATⅢ H組大鼠神經(jīng)元損傷程度較MCAO組明顯改善，僅有少部分神經(jīng)元壞死及細(xì)胞核膜破裂，胞質(zhì)染色逐漸均勻，且隨著ATⅢ濃度的增加神經(jīng)元損傷程度減輕；ATⅢH＋Cyclopamine組神經(jīng)元損傷程度較ATⅢ H組加重，與MCAO組相似。詳見圖3。

2.5 各組大鼠尼氏小體數(shù)量比較

sham組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞尼氏小體結(jié)構(gòu)完整，多呈三角形；MCAO組大鼠尼氏小體數(shù)量較sham組明顯減少（P＜0.05）；與MCAO組相比，ATⅢ L組、ATⅢ M組、ATⅢ H組尼氏小體數(shù)量逐漸增加，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；與ATⅢ H組相比，ATⅢH＋Cyclopamine組大鼠尼氏小體數(shù)量明顯降低（P＜0.05）。詳見圖4、圖5。

2.6 各組大鼠腦組織中Shh、Ptch1蛋白表達(dá)比較

與sham組相比，MCAO組、ATⅢ L組、ATⅢ M組、ATⅢ H組大鼠腦組織中Shh、Patch1蛋白表達(dá)均明顯增加（P＜0.05），且ATⅢ L組、ATⅢ M組、ATⅢ H組大鼠腦組織中Shh、Patch1蛋白表達(dá)明顯高于MCAO組（P＜0.05）；與ATⅢH組相比，ATⅢ H＋Cyclopamine組大鼠腦組織中Shh、Patch1蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。詳見圖6～圖8。

3 討 論

缺血性腦卒中是一種常見的急性腦血液循環(huán)障礙性疾病，其病理機(jī)制復(fù)雜，和炎癥、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等多種因素密切相關(guān)^［9-10］。目前組織型纖溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，tPA）是臨床治療缺血性腦卒中最有效的藥物之一，但由于tPA的有效治療窗口僅為4～6 h，且在治療過程中極易發(fā)生出血轉(zhuǎn)化，因此其在臨床上的應(yīng)用具有一定局限性。據(jù)統(tǒng)計(jì)，1966年至今，僅有不足5%的缺血性腦卒中病人得到了tPA的有效治療^［11］，且目前多種治療缺血性腦卒中的神經(jīng)保護(hù)劑在臨床的應(yīng)用效果并不理想，由此可見開發(fā)新的防治缺血性腦卒中的藥物是目前臨床研究的重中之重。

本研究采用Longa線栓法制備缺血性腦卒中大鼠模型，其由于簡便易操作，對(duì)動(dòng)物的創(chuàng)傷性小，可重復(fù)性高，且和臨床上腦卒中病理體征相似，被學(xué)者們廣泛應(yīng)用。本研究結(jié)果顯示，MCAO組大鼠平衡木實(shí)驗(yàn)評(píng)分明顯降低，神經(jīng)功能缺損評(píng)分和腦組織含水量明顯升高，且HE染色顯示神經(jīng)細(xì)胞有大量的壞死，說明缺血性腦卒中模型制備成功。尼氏小體是神經(jīng)元內(nèi)嗜酸性顆粒，當(dāng)神經(jīng)功能正常時(shí)其結(jié)構(gòu)較固定，當(dāng)神經(jīng)功能損傷時(shí)，尼氏小體會(huì)減少甚至溶解，因此，通過尼氏小體數(shù)量可判斷腦組織神經(jīng)功能損傷情況^［12］。本研究結(jié)果顯示，MCAO組大鼠尼氏小體數(shù)量明顯減少，進(jìn)一步說明缺血性腦卒中大鼠有明顯的神經(jīng)功能損傷。白術(shù)為菊科植物白術(shù)的干燥根莖，其氣清香，性溫，味甘苦，具有益氣、健脾、止汗等功效，常被用于治療脾虛食少、慢性腹瀉、水腫、自汗等癥狀^［13］，近年來，藥理學(xué)研究表明，白術(shù)還具有抗菌、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫等作用，且對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)也有一定的調(diào)節(jié)作用^［14］。ATⅢ是常用中藥白術(shù)中含有的一種內(nèi)酯類有效成分，有研究發(fā)現(xiàn)，與MCAO組比較，ATⅢ能夠通過抑制caspase-3信號(hào)通路抑制谷氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，還能減輕慢性高劑量注射同型半胱氨酸誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶障礙^［15］。本研究結(jié)果顯示，與MCAO組比較，ATⅢ L組、ATⅢ M組、ATⅢ H組大鼠平衡木實(shí)驗(yàn)評(píng)分、神經(jīng)功能缺損評(píng)分和腦組織含水量降低，神經(jīng)細(xì)胞壞死數(shù)量減少，尼氏小體數(shù)量增加，提示ATⅢ可改善缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)功能缺損，減輕腦水腫，且呈濃度依賴。陳潔^［16］研究證實(shí)，ATⅢ可通過抑制酪氨酸蛋白激酶2（JAK2）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）/線粒體動(dòng)力相關(guān)蛋白（Drp1）通路減小MCAO小鼠腦梗死面積，促進(jìn)腦血流量恢復(fù)，改善腦缺血損傷。

Shh是Hedgehog基因家族成員之一，其信號(hào)由Shh蛋白、兩個(gè)跨膜蛋白質(zhì)受體Ptched和Smoothened組成的受體復(fù)合物以及下游的鋅指轉(zhuǎn)錄因子Gli蛋白家族等組成^［17］。分泌型信號(hào)蛋白是Shh信號(hào)通路級(jí)聯(lián)反應(yīng)的啟動(dòng)信號(hào)，跨膜受體Ptched和Smoothened是Shh信號(hào)傳導(dǎo)通路的介導(dǎo)受體。當(dāng)無信號(hào)傳導(dǎo)時(shí)，Ptched與Smoothened結(jié)合并抑制其活性，而當(dāng)Shh蛋白和Ptched蛋白結(jié)合后，Ptched就解除了對(duì)Smoothened的抑制作用^［18］。研究發(fā)現(xiàn)，Shh蛋白在腦缺血大鼠模型急性期有短暫性的升高，而外源性Shh蛋白能夠保護(hù)受損神經(jīng)細(xì)胞^［19］。本研究結(jié)果顯示，MCAO組大鼠腦組織中Shh、Ptch1蛋白表達(dá)升高，提示腦缺血發(fā)生時(shí)腦組織中Shh、Ptch1蛋白短暫性的升高保護(hù)腦組織，和上述研究一致。通過給予ATⅢ發(fā)現(xiàn)，ATⅢ L組、ATⅢ M組、ATⅢ H組大鼠腦組織中Shh、Ptch1蛋白表達(dá)高于MCAO組，提示ATⅢ可增加缺血性腦卒中大鼠腦組織中Shh/Ptch1信號(hào)的激活。許俊杰等^［20］研究發(fā)現(xiàn)，Shh信號(hào)可改善MCAO大鼠神經(jīng)功能，降低梗死面積。因此，推測(cè)Shh/Ptch1信號(hào)可能是ATⅢ改善腦卒中大鼠神經(jīng)損傷的作用機(jī)制，為了驗(yàn)證這一猜想，本研究采用Shh/Ptch1信號(hào)通路特異性阻斷劑環(huán)巴胺和高劑量的ATⅢ共同干預(yù)缺血性腦卒中大鼠，結(jié)果顯示，ATⅢ H＋Cyclopamine組大鼠較ATⅢ H組平衡木實(shí)驗(yàn)評(píng)分、神經(jīng)功能缺損評(píng)分和腦組織積水量明顯升高，尼氏小體數(shù)量減少，提示環(huán)巴胺能抑制ATⅢ對(duì)缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)功能缺損的改善作用。

綜上所述，ATⅢ可改善缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)功能缺損，其作用機(jī)制和Shh/Ptch1信號(hào)通路激活有關(guān)。

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（收稿日期：2023-04-10）

（本文編輯 王麗）