茯苓酸調(diào)節(jié)miR-145-5p/KLF5軸對ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響

摘要 目的：探討茯苓酸調(diào)節(jié)miR-145-5p/Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子5（KLF5）軸對氧化修飾的低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。方法：將人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）分為對照組、ox-LDL組、ox-LDL＋茯苓酸組、ox-LDL＋茯苓酸＋inhibitor-NC組、ox-LDL＋茯苓酸＋miR-145-5p inhibitor組。分組處理后，CCK-8法、Edu染色檢測細(xì)胞增殖；酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）試劑盒檢測白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平；試劑盒檢測丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）含量；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測各組細(xì)胞miR-145-5p和KLF5 mRNA表達(dá)水平；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率；蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western Blot）檢測細(xì)胞中KLF5、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)量。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-145-5p和KLF5的關(guān)系。結(jié)果：與對照組相比，ox-LDL組HUVEC細(xì)胞活性、增殖率、SOD和GSH、miR-145-5p表達(dá)和Bcl-2蛋白表達(dá)水平下降，IL-1β、TNF-α、MDA、凋亡率、KLF5 mRNA表達(dá)、KLF5、Bax蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。與ox-LDL組相比，ox-LDL＋茯苓酸組和ox-LDL＋茯苓酸＋inhibitor-NC組HUVEC細(xì)胞活性、增殖率、SOD和GSH、miR-145-5p表達(dá)和Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高，IL-1β、TNF-α、MDA、凋亡率、KLF5 mRNA表達(dá)、KLF5、Bax蛋白表達(dá)水平下降（P＜0.05）。與ox-LDL＋茯苓酸＋inhibitor-NC組相比，ox-LDL＋茯苓酸＋miR-145-5p inhibitor組細(xì)胞活性、增殖率、SOD和GSH、miR-145-5p表達(dá)和Bcl-2蛋白表達(dá)水平下降，IL-1β、TNF-α、MDA、凋亡率、KLF5 mRNA表達(dá)、KLF5、Bax蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-145-5p和KLF5存在靶向調(diào)控關(guān)系。結(jié)論：茯苓酸可以減少ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)miR-145-5p/KLF5軸有關(guān)。

關(guān)鍵詞 血管內(nèi)皮細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；茯苓酸；miR-145-5p；Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子5；氧化修飾的低密度脂蛋白；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.20.007

Effect of Poric Acid on ox-LDL-induced Apoptosis of Vascular Endothelial Cells by Regulating miR-145-5p/KLF5 Axis

LYU Jingjing， ZHANG Yihan， WANG Dongdong

Zhengzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine， Zhengzhou 450006， Henan， China， E-mail： lvjingjing1980@126.com

Abstract Objective：To investigate the effect of poric acid on oxidized low densitylipoprotein（ox-LDL）-induced apoptosis of vascular endothelial cells by regulating miR-145-5p/Krüppel-like factor 5（KLF5） axis.Methods：Human umbilical vein endothelial cells（HUVEC） were grouped into control group，ox-LDL group，ox-LDL＋poric acid group，ox-LDL＋poric acid＋inhibitor-NC group，and ox-LDL＋poric acid＋miR-145-5p inhibitor group.After grouping，CCK-8 method and Edu staining were applied to detect cell proliferation.The levels of interleukin（IL）-1β and tumor necrosis factor-α（TNF-α） were detected by enzyme linked immunosorbent assay（ELISA） kits.The contents of malondialdehyde（MDA），superoxide dismutase（SOD） and glutathione（GSH） were analyzed with the kit.The expression levels of miR-145-5p and KLF5 mRNA were detected by reverse transcriptase-polymerase chain reaction（qRT-PCR）.The apoptosis rate was detected by flow cytometry.Western Blot was applied to detect the expression of KLF5，Bax and Bcl-2 proteins in the cells.The relationship between miR-145-5p and KLF5 was verified by double luciferase reporter gene experiment.Results：Compared with the control group，the HUVEC cell activity，proliferation rate， SOD and GSH，the expression of miR-145-5p，and the protein expression level of Bcl-2 in ox-LDL group decreased obviously，the IL-1β，TNF-α，MDA，apoptosis rate， the expression of KLF5 mRNA，the protein expression levels of KLF5 and Bax increased obviously（P＜0.05）.Compared with ox-LDL group，the HUVEC cell activity，proliferation rate，SOD and GSH，the expression of miR-145-5p，and the protein expression level of Bcl-2 in ox-LDL＋poric acid group and ox-LDL＋poric acid＋inhibitor-NC group increased obviously，the IL-1β，TNF-α，MDA，apoptosis rate，the expression of KLF5 mRNA，the protein expression levels of KLF5 and Bax decreased obviously（P＜0.05）.Compared with ox-LDL＋poric acid＋inhibitor-NC group，the HUVEC cell activity， proliferation rate，SOD and GSH，the expression of miR-145-5p，and the protein expression level of Bcl-2 in ox-LDL＋poric acid＋miR-145-5p inhibitor group decreased obviously，the IL-1β，TNF-α，MDA，apoptosis rate，the expression of KLF5 mRNA，the protein expression levels of KLF5 and Bax increased obviously（P＜0.05）.The double luciferase reporter gene experiment verified that there was a targeted regulatory relationship between miR-145-5p and KLF5.Conclusion：Poric acid can reduce the apoptosis of vascular endothelial cells induced by ox-LDL，and its mechanism may be related to the regulation of miR-145-5p/KLF5 axis.

Keywords vascular endothelial cells; apoptosis; poric acid; miR-145-5p; apoptosis， KLF5; oxidized low density lipoprotein; experimental study

基金項(xiàng)目 河南省中醫(yī)藥科學(xué)研究專項(xiàng)課題（No.2018ZY3008，2023ZY2151）

作者單位 鄭州市中醫(yī)院（鄭州 450006），E-mail：lvjingjing1980@126.com

引用信息 呂靜靜，張溢寒，汪東東.茯苓酸調(diào)節(jié)miR-145-5p/KLF5軸對ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（20）：3697-3703.

血管內(nèi)皮細(xì)胞是血液循環(huán)中營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)钠琳虾屯ǖ?，運(yùn)輸O、CO和中間代謝產(chǎn)物等各種物質(zhì)^［1］。血液中低密度脂蛋白（LDL）大量沉積和氧化應(yīng)激直接導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，引發(fā)炎癥反應(yīng)，最終形成血栓，從而誘發(fā)冠心病、腦卒中等心腦血管疾病^［2］。隨著人們生活水平的提高，血栓引發(fā)的心腦血管疾病也在逐年升高^［3］。中藥屬于天然植物，毒副作用小，逐漸成為新藥的研發(fā)方向^［4］。茯苓是我國傳統(tǒng)中藥，是多種復(fù)方藥和中成藥的原料藥物，具有健脾利濕、利水消腫和寧心的功效。茯苓酸是茯苓的主要活性成分，是從茯苓中提取的一種三萜類化合物，具有提高免疫力、抗炎、抗氧化、降血糖、抗腫瘤等多種藥理作用，在炎癥、氧化應(yīng)激以及血管內(nèi)皮損傷中均發(fā)揮重要作用^［5］?？茏诶虻?sup>［^6］研究表明，桂枝茯苓膠囊可改善由高脂去卵巢引起的血管內(nèi)皮損傷。任麗娟等^［7］研究表明，茯苓酸可以抑制脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和凋亡反應(yīng)。因此，推測茯苓酸對血管內(nèi)皮細(xì)胞也有保護(hù)作用。Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子5（KLF5）是Krüppel轉(zhuǎn)錄因子家族成員，在心血管損傷反應(yīng)中具有重要調(diào)控作用^［8］。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，KLF5與miR-145-5p存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，有研究表明miR-145-5p可以直接負(fù)調(diào)控KLF5的表達(dá)，進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。茯苓酸對血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用是否與miR-145-5p/KLF5軸有關(guān)鮮有報(bào)道。因此，本研究就茯苓酸是否可通過調(diào)節(jié)miR-145-5p/KLF5軸影響氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡進(jìn)行探究，旨在為臨床治療和新藥開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）購于武漢原生原代生物公司。

1.2 主要試劑

茯苓酸購自滁州仕諾達(dá)生物科技有限公司；白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）試劑盒購自江西江藍(lán)純生物試劑有限公司；ox-LDL購自上海羽哚生物科技有限公司；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）試劑盒購自上海齊源生物科技有限公司；胎牛血清購自武漢賽奧斯生物科技有限公司；Trizol試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海文韌生物科技有限公司；總RNA提取試劑盒和胰蛋白酶購自上海海方生物技術(shù)有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購自深圳子科生物科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）試劑盒和CCK-8試劑盒購自無錫菩禾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；KLF5、Bax和Bcl-2一抗和二抗均購自美國Abcam公司；miR-145-5p inhibitor和inhibitor-NC購自上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技有限公司。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組培養(yǎng)

在RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞，培養(yǎng)環(huán)境（37 ℃、5%CO），培養(yǎng)結(jié)束后用胰蛋白酶消化傳代，然后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。將對數(shù)生長期的HUVEC細(xì)胞分為對照組（無處理）、ox-LDL組（100 mg/mL的ox-LDL^［9］處理）、ox-LDL＋茯苓酸組（100 mg/mL的ox-LDL＋20 μmol/L茯苓酸^［10］共同處理）、ox-LDL＋茯苓酸＋inhibitor-NC組（100 mg/mL的ox-LDL＋20 μmol/L茯苓酸＋轉(zhuǎn)染inhibitor-NC共同處理）、ox-LDL＋茯苓酸＋miR-145-5p inhibitor組（100 mg/mL的ox-LDL處理＋20 μmol/L茯苓酸＋轉(zhuǎn)染miR-145-5p inhibitor共同處理），干預(yù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 CCK-8法、Edu染色檢測細(xì)胞增殖

CCK-8法：將各組細(xì)胞接種到96孔板中，分別培養(yǎng)48、72 h后，棄去細(xì)胞上清液，向每個(gè)孔中加入含有10 μL CCK-8溶液的100 μL完全培養(yǎng)基，孵育2 h，在酶標(biāo)儀450 nm處測定各組細(xì)胞的吸光度值。Edu染色：將各組細(xì)胞以5×10⁴個(gè)/孔接種到96孔板中。無菌培養(yǎng)36 h，然后向每孔中加入適量Edu孵育2 h，按照Edu-555細(xì)胞增殖檢測試劑盒說明書指導(dǎo)進(jìn)行Edu及4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色后以熒光顯微鏡采集各組細(xì)胞圖像，采用Image J軟件定量各組Edu陽性細(xì)胞數(shù)及總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算各組細(xì)胞增殖率，計(jì)算公式：增殖率＝Edu陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5 炎性因子水平檢測

取各組細(xì)胞上清液，然后根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）試劑盒說明書操作步驟檢測IL-1β和TNF-α水平。

1.6 MDA、SOD、GSH含量檢測

按照商品化試劑盒說明書檢測各組細(xì)胞MDA、SOD、GSH含量。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

取實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞接種于96孔板中，每孔1×10⁵個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過夜，胰蛋白酶消化處理細(xì)胞，磷酸鹽緩沖溶液（PBS）清洗，離心機(jī)離心并收集細(xì)胞，然后按照凋亡試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行后續(xù)操作，最后用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況。

1.8 qRT-PCR檢測各組細(xì)胞miR-145-5p和KLF5 mRNA表達(dá)

提取各組細(xì)胞中的總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后熒光定量PCR擴(kuò)增cDNA。KLF5 mRNA以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，miR-145-5p以U6為內(nèi)參，使用2^－ΔΔCt方法計(jì)算miR-145-5p和KLF5 mRNA的相對表達(dá)量。KLF5 mRNA正向引物為5′-AGCTCACCTGAGGACTCATA-3′，反向引物為5′-GTGCGCAGTGCTCAGTTCT-3′；miR-145-5p′正向引物為5′-CGGTCCAGTTTTCCCAGGAA-3′，反向引物為5′AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′；U6正向引物為5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′；反向引物為5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′；GAPDH正向引物為5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′，反向引物為5′-AATGGTCGTTGAGGGCAATG-3′。

1.9 蛋白質(zhì)免跡印跡法（Western Blot）檢測各組細(xì)胞蛋白表達(dá)

用蛋白裂解液裂解細(xì)胞，蛋白提取試劑盒提取總蛋白質(zhì)，檢測細(xì)胞中KLF5、Bax、Bcl-2的蛋白表達(dá)，電泳分離并轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉液中封閉；加入一抗KLF5、Bax、Bcl-2、GAPDH（稀釋1∶2 000）4 ℃搖床過夜，洗膜，加入二抗（稀釋1∶5 000）常溫下孵育2 h，電化學(xué)發(fā)光（ECL）液顯影后用Image-Pro Plus分析蛋白質(zhì)條帶的灰度值，計(jì)算蛋白相對表達(dá)量。

1.10 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測KLF5與miR-145-5p的靶向關(guān)系

構(gòu)建KLF5野生型載體（KLF5-WT）和突變型載體（KLF5-MUT），將KLF5-WT和KLF5-MUT分別與miR-NC和miR-145-5p mimic共轉(zhuǎn)染于HUVEC細(xì)胞中，48 h后，進(jìn)行熒光素酶活性檢測。

1.2 倫理審查

本研究方案已通過河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審核批準(zhǔn)（審批號：DWLL202302035）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組HUVEC細(xì)胞增殖能力比較

與對照組相比，ox-LDL組HUVEC細(xì)胞活力和增殖率均明顯降低（P＜0.05）；與ox-LDL組比較，ox-LDL＋茯苓酸組和ox-LDL＋茯苓酸＋inhibitor-NC組HUVEC細(xì)胞活力和增殖率均明顯升高（P＜0.05）；與ox-LDL＋茯苓酸＋inhibitor-NC組比較，ox-LDL＋茯苓酸＋miR-145-5p inhibitor組HUVEC細(xì)胞活力和增殖率均明顯降低（P＜0.05）。詳見圖1、表1。

2.2 各組HUVEC細(xì)胞中IL-1β和TNF-α水平比較

與對照組相比，ox-LDL組HUVEC細(xì)胞IL-1β和TNF-α水平均明顯升高（P＜0.05）；與ox-LDL組比較，ox-LDL＋茯苓酸組和ox-LDL＋茯苓酸＋inhibitor-NC組HUVEC細(xì)胞IL-1β和TNF-α水平明顯降低（P＜0.05）；與ox-LDL＋茯苓酸＋inhibitor-NC組比較，ox-LDL＋茯苓酸＋miR-145-5p inhibitor組HUVEC細(xì)胞IL-1β和TNF-α水平均明顯升高（P＜0.05）。詳見表2。

2.3 各組HUVEC細(xì)胞MDA、SOD、GSH比較

與對照組相比，ox-LDL組HUVEC細(xì)胞MDA含量明顯升高，SOD和GSH水平明顯降低（P＜0.05）；與ox-LDL組比較，ox-LDL＋茯苓酸組和ox-LDL＋茯苓酸＋inhibitor-NC組HUVEC細(xì)胞MDA含量明顯降低，SOD和GSH水平明顯升高（P＜0.05）；與ox-LDL＋茯苓酸＋inhibitor-NC組比較，ox-LDL＋茯苓酸＋miR-145-5p inhibitor組HUVEC細(xì)胞SOD和GSH水平明顯降低，而MDA含量明顯升高（P＜0.05）。詳見表3。

2.4 各組HUVEC細(xì)胞凋亡率比較

與對照組比較，ox-LDL組HUVEC細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與ox-LDL組比較，ox-LDL＋茯苓酸組和ox-LDL＋茯苓酸＋inhibitor-NC組HUVEC細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）；與ox-LDL＋茯苓酸＋inhibitor-NC組比較，ox-LDL＋茯苓酸＋miR-145-5p inhibitor組HUVEC細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）。詳見圖2、表4。

2.5 各組HUVEC細(xì)胞miR-145-5p和KLF5 mRNA表達(dá)比較

與對照組比較，ox-LDL組HUVEC細(xì)胞miR-145-5p表達(dá)明顯降低，KLF5 mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與ox-LDL組比較，ox-LDL＋茯苓酸組和ox-LDL＋茯苓酸＋inhibitor-NC組HUVEC細(xì)胞miR-145-5p表達(dá)明顯升高，KLF5 mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與ox-LDL＋茯苓酸＋inhibitor-NC組比較，ox-LDL＋茯苓酸＋miR-145-5p inhibitor組HUVEC細(xì)胞KLF5 mRNA表達(dá)明顯升高，miR-145-5p表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。詳見表5。

2.6 各組HUVEC細(xì)胞KLF5、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)比較

與對照組比較，ox-LDL組HUVEC細(xì)胞KLF5、Bax表達(dá)明顯升高，Bcl-2表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與ox-LDL組比較，ox-LDL＋茯苓酸組和ox-LDL＋茯苓酸＋inhibitor-NC組HUVEC細(xì)胞KLF5、Bax表達(dá)明顯降低，Bcl-2表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與ox-LDL＋茯苓酸＋inhibitor-NC組比較，ox-LDL＋茯苓酸＋miR-145-5p inhibitor組HUVEC細(xì)胞Bcl-2表達(dá)明顯降低，而KLF5、Bax表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。詳見表6、圖3。

2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測

利用TargetScan網(wǎng)站預(yù)測KLF5與miR-145-5p的結(jié)合位點(diǎn)，詳見圖4。與miR-NC和KLF5-WT共轉(zhuǎn)染組比較，miR-145-5p mimic和KLF5-WT共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性明顯降低（P＜0.05）；與miR-NC和KLF5-MUT共轉(zhuǎn)染組比較，miR-145-5p mimic和KLF5-MUT共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表7。

3 討 論

血管內(nèi)皮損傷及功能障礙是動脈粥樣硬化形成的早期環(huán)節(jié)，ox-LDL、活性氧（ROS）、糖尿病等因素都會引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，引發(fā)功能紊亂^［10-11］。動脈粥樣硬化的治療方案目前尚不成熟，是死亡率一直居高不下的主要原因^［12］。因此，在動脈粥樣硬化前期進(jìn)行防治尤為主要。在動脈粥樣硬化前期發(fā)展過程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的一種表現(xiàn)形式，因此，開發(fā)新的藥物來防止血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷對預(yù)防動脈粥樣硬化是一個(gè)有效的方法^［13-14］。

有研究顯示，多種天然活性物質(zhì)如紫草素、丹皮酚、銀杏素等都可以調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激，發(fā)揮保護(hù)心血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用^［15］，因此，中藥天然活性物質(zhì)將成為臨床治療的研究方向。茯苓酸是一種天然中藥成分，具有消炎、抗腫瘤、抗氧化的作用^［16］。苗樹船等^［10］研究表明茯苓酸可以抑制過氧化氫誘導(dǎo)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡促進(jìn)細(xì)胞存活。孫蘭等^［17］研究表明桂枝茯苓膠囊對慢性盆腔炎大鼠具有治療作用，可能與降低炎癥水平有關(guān)。劉鳳^［18］研究表明茯苓酸可以減輕ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC氧化應(yīng)激損傷。本研究結(jié)果表明，與ox-LDL組相比，ox-LDL＋茯苓酸組和ox-LDL＋茯苓酸＋inhibitor-NC組HUVEC細(xì)胞活性、增殖率、SOD和GSH、Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯升高，IL-1β、TNF-α、MDA、凋亡率、Bax蛋白表達(dá)水平明顯下降。提示茯苓酸對ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用。

miRNA是一種不編碼蛋白的微小RNA，其通過堿基互補(bǔ)的氫鍵與目的mRNA進(jìn)行結(jié)合，實(shí)現(xiàn)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的目的，抑制目標(biāo)mRNA^［19］。有研究表明，miR-145-5p調(diào)控鈣調(diào)素依賴蛋白激酶Ⅱδ（CaMKⅡδ），導(dǎo)致人主動脈血管平滑肌細(xì)胞（HAVSMCs）自噬改變，抑制動脈粥樣硬化的進(jìn)展^［20］。KLF5心血管損傷反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。徐楊等^［21］研究表明，川皮苷可通過調(diào)控miR-145-5p/KLF5軸來抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，從而減少缺氧/復(fù)氧（H/R）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明，與對照組相比，ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞miR-145-5p表達(dá)明顯降低，KLF5表達(dá)明顯升高，細(xì)胞凋亡率明顯升高。提示miR-145-5p/KLF5軸可能參與血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。與ox-LDL組相比，ox-LDL＋茯苓酸組和ox-LDL＋茯苓酸＋inhibitor-NC組HUVEC細(xì)胞中miR-145-5p表達(dá)明顯升高，KLF5表達(dá)明顯下調(diào)，細(xì)胞凋亡率明顯下降，提示茯苓酸有抑制細(xì)胞凋亡的作用，其可能是通過調(diào)節(jié)miR-145-5p/KLF5軸實(shí)現(xiàn)的。在ox-LDL＋茯苓酸共同處理基礎(chǔ)上，下調(diào)miR-145-5p，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)使用茯苓酸相比，miR-145-5p inhibitor使得KLF5表達(dá)明顯升高，細(xì)胞凋亡率升高，提示下調(diào)miR-145-5p可以減弱茯苓酸對細(xì)胞的保護(hù)作用。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步證實(shí)，miR-145-5p可靶向負(fù)調(diào)控KLF5的表達(dá)。提示茯苓酸可能通過上調(diào)miR-145-5p表達(dá)，下調(diào)KLF5表達(dá)，進(jìn)而減弱ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞凋亡。

綜上所述，茯苓酸可通過上調(diào)miR-145-5p，下調(diào)KLF5，來減少ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞凋亡。但本研究僅從體外細(xì)胞培養(yǎng)水平上進(jìn)行初步分析，后續(xù)還需進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)深入探討。

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（收稿日期：2023-03-25）

（本文編輯 王麗）