蝮蛇咬傷對中性粒細胞NETs和炎癥損傷影響的臨床研究

[摘要]目的探討蝮蛇咬傷后中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophilextracellulartraps，NETs）標志物嗜中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophilelastase，NE）以及細胞游離DNA（cellfreeDNA，cf-DNA）變化和與炎癥標志物及組織損傷標志物的相關(guān)性。方法選取2021年9月—2022年12月杭州市中醫(yī)院皮膚科收治的蝮蛇咬傷患者作為研究對象，研究包括36例蝮蛇咬傷患者，20例健康體檢者；比較兩組中性粒細胞、淋巴細胞計數(shù)、嗜中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophilelastase，NE）、細胞游離DNA（cellfreeDNA，cf-DNA）、血清淀粉樣蛋白A（serumamyloidA，SAA）、C反應蛋白（C-reactiveprotein，CRP）、中性粒細胞淋巴細胞比值（neutrophil-to-lymphocyteratio，NLR）、肌酸激酶（creatinekinase，CK）、肌酸肌酶同工酶（creatinekinase-MB，CKMB）、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartictransaminase，AST）和乳酸脫氫酶（lactatedehydrogenase，LDH）水平，計算Pearson相關(guān)系數(shù)并利用Python軟件編寫代碼繪制熱力圖、箱線圖，分析中性粒細胞計數(shù)與NETs標志物、炎癥標志物和組織損傷標志物之間的相關(guān)性。結(jié)果蝮蛇咬傷后中性粒細胞計數(shù)升高，NETs標志物NE、cf-DNA升高，CRP、SAA、NLR、AST升高，淋巴細胞計數(shù)降低。蝮蛇咬傷后中性粒細胞數(shù)值與NE酶、cf-DNA血清含量呈正相關(guān)，而與炎標志物CRP和SAA之間沒有明顯相關(guān)性；而CRP與SAA、CKMB與LDH強正相關(guān)，CK與NE、SAA與NE之間呈正相關(guān)，淋巴細胞數(shù)與NLR呈負相關(guān)。結(jié)論蝮蛇咬傷可能引起NETs水平上升，促進炎癥加重和組織損傷。

[關(guān)鍵詞]蝮蛇咬傷；中性粒細胞；中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)；血清淀粉樣蛋白A

[中圖分類號]R459.7[文獻標識碼]A[DOI]10.3969/j.issn.1673-9701.2024.20.004

Clinicalstudyontheeffectsofsnakebitesonneutrophiltraps（NETs）andinflammatorydamage

YUTao，YUANChenda，YANGMin

DepartmentofDermatology，HangzhouHospitalofTraditionalChineseMedicineAffiliatedtoZhejiangChineseMedicalUniversity，Hangzhou310007，Zhejiang，China

[Abstract]ObjectiveToinvestigatethechangesinneutrophilsandtheirextracellulartrap（NETs）markers，includingneutrophilelastase（NE）andcell-freeDNA（cf-DNA），afterGloydiusbrevicaudusbitenandtheircorrelationwithinflammatoryandtissuedamagemarkers.MethodsAtotalof36patientsbitenbyGloydiusbrevicaudusand20healthyindividualswereincludedinthestudyfromSeptember2021toDecember2022atHangzhouHospitalofTraditionalChineseMedicine.Neutrophilcount，lymphocytecount，neutrophil-to-lymphocyteratio（NLR），C-reactiveprotein（CRP），serumamyloidA（SAA），aspartateaminotransferase（AST），lactatedehydrogenase（LDH），creatinekinase（CK），creatinekinase-MB（CKMB），cf-DNA，andNElevelswerecomparedbetweenthetwogroups.Pearsoncorrelationcoefficientswerecalculated，andaheatmapandboxplotweregeneratedusingPythonsoftwaretoanalyzethecorrelationbetweenneutrophilcountandNETsmarkers，inflammatorymarkers，andtissuedamagemarkers.ResultsAfterGloydiusbrevicaudusbiten，Neutrophilcount，NE，cf-DNA，CRP，SAA，NLR，andASTwereelevated，whilelymphocytecountwasdecreased.TherewasageneralpositivecorrelationbetweenNeutrophilcountandNE，aswellascf-DNA/NETsserumlevels.However，therewasnosignificantcorrelationbetweenNeutrophilcountandinflammatorymarkersCRPandSAA.CRPwasstronglypositivelycorrelatedwithSAA，andCKMBwasstronglypositivelycorrelatedwithLDH.CKwashighlypositivelycorrelatedwithNEandSAAwashighlypositivelycorrelatedwithNE.LymphocytecounthadastrongnegativecorrelationwithNLR.ConclusionGloydiusbrevicaudusbitenmayresultinanincreaseinNETslevelsinneutrophils，promotinginflammationexacerbationandtissuedamage.

[Keywords]Gloydiusbrevicaudusbites;Neutrophils;Neutrophilextracellulartrap;SerumamyloidA

蝮蛇作為我國主要蛇種之一，其毒液可直接損害皮膚和肌肉組織細胞，促進多種炎癥因子釋放，從而引起炎癥反應和組織損傷。雖然盡早使用抗蛇毒血清免疫球蛋白中和體內(nèi)游離性蛇毒是國內(nèi)外廣泛認可的唯一特效救治方案[1]。由于抗蛇毒血清對于已與組織結(jié)合的蛇毒無中和效應，蛇毒引起的組織器官損傷無法通過抗蛇毒血清進行治療，并且抗蛇毒血清無法抑制毒蛇咬傷引起的組織破壞[2-3]。前期研究已發(fā)現(xiàn)蝮蛇咬傷后肢體腫脹發(fā)生率高[4]。因此，探索蝮蛇咬傷后肢體腫脹發(fā)生機制，減輕炎癥和外周肌肉組織損傷是蝮蛇咬傷救治面臨的難點。

中性粒細胞是人體免疫系統(tǒng)中的重要成分，其參與了機體的炎癥反應和免疫防御。中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophilextracellulartraps，NETs）是中性粒細胞釋放的一種細胞外結(jié)構(gòu)，通過這種結(jié)構(gòu)中性粒細胞可以俘獲病原微生物并清除?，F(xiàn)有的少量研究表明NETs的這種網(wǎng)狀捕獲結(jié)構(gòu)可能引起毒蛇咬傷后蛇毒毒液在局部的蓄積，從而參與炎癥反應和組織損傷[5-6]。然而，目前對于蝮蛇咬傷后的水平變化和與炎癥及組織損傷相關(guān)性的研究還較少。因此本研究擬通過檢測蝮蛇咬傷后NETs標志物和炎癥損傷標志物血清水平，分析兩者的相關(guān)性，明確NETs對蝮蛇咬傷后炎癥和組織損傷的影響，探討蝮蛇咬傷后肢體腫脹和功能異常中的NETs機制，為蝮蛇咬傷引起炎癥和組織損傷的治療策略提供新思路。

本研究主要檢測蝮蛇咬傷患者外周血中NETs標志物嗜中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophilelastase，NE）以及細胞游離DNA（cellfreeDNA，cf-DNA）濃度，炎癥指標血清淀粉樣蛋白A（serumamyloidA，SAA）和C反應蛋白（C-reactiveprotein，CRP）濃度、中性粒細胞淋巴細胞計數(shù)和比值（neutrophil-to-lymphocyteratio，NLR）等，組織損傷標志物肌酸激酶（creatinekinase，CK）、肌酸肌酶同工酶（creatinekinase-MB，CKMB）、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartictransaminase，AST）和乳酸脫氫酶（lactatedehydrogenase，LDH）濃度，分析NETs在蝮蛇咬傷后的變化和與炎癥反應以及組織損傷標志物之間的相關(guān)性。

1對象與方法

1.1研究對象

選取筆者醫(yī)院皮膚科2021年9月至2022年12月蝮蛇咬傷患者36例為研究對象。納入標準：①符合毒蛇咬傷診斷標準；②患者能夠識別毒蛇種類且與標準江浙蝮蛇圖片比對一致，或患者將毒蛇（活體或死體）帶至門診，經(jīng)首診醫(yī)生辨別為蝮蛇而明確為蝮蛇咬傷，咬傷后未接受任何藥物治療者。排除標準：①患者入院前接受藥物治療者，包括口服、外用和靜脈、肌肉注射藥物等；②近期有急性感染史。蝮蛇咬傷組36例患者中男22例，女14例，年齡8～75歲，平均（53.27±16.34）歲。對照組選擇同期接受健康檢查的志愿者共20名，其中男性11名，女性9名，年齡33～75歲，平均（50.00±14.13）歲?；颊呔浞种椴⑼?。兩組研究對象的性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。本研究經(jīng)筆者醫(yī)院倫理委員會審批通過（倫理審批號：2020KY111）。

1.2檢測方法

蝮蛇咬傷組患者及對照組入組后即刻抽取肘靜脈血液，使用血細胞分析儀和生化分析儀檢測中性粒細胞、淋巴細胞數(shù)、CRP、SAA、AST、LDH、CK、CKMB濃度。

另備份蝮蛇咬傷患者和健康者肘靜脈血離心后取血漿放置于–80℃冰箱中保存。檢測時將100μl血漿樣本與PicoGreen熒光染料混合，避光孵育后采用多功能酶標儀檢測熒光值并繪制標準曲線以此計算標本血漿中cf-DNA/NETs濃度。使用人中性粒細胞彈性蛋白酶ELISA試劑盒檢測NE濃度水平。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析，使用Python3.9軟件和Pandas、Numpy、Plotly等庫進行分析和繪圖，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1外周血中NETs標志物、炎癥標志物和組織損傷標志物水平比較

蝮蛇咬傷患者外周血中NETs標志物NE和cf-DNA、中性粒細胞數(shù)值、CRP、SAA和NLR明顯升高，淋巴細胞數(shù)值與對照組比較顯著降低，AST與對照組比較顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.2外周血中NETs標志物、炎癥標志物和組織損傷標志物水平之間的相關(guān)性

蝮蛇咬傷后中性粒細胞數(shù)值與NE酶、cf-DNA/nets血清含量呈正相關(guān)，而與CRP和SAA無相關(guān)性，而CRP與SAA、CKMB與LDH呈正相關(guān)，CK與NE、SAA與NE之間呈正相關(guān)，淋巴細胞數(shù)與NLR呈負相關(guān)（圖1）。

2.3不同中性粒細胞計數(shù)下蝮蛇咬傷患者上述標志物之間相關(guān)性的變化

以中性粒細胞數(shù)作為分層控制變量，NE與cf-DNA血清含量、淋巴細胞數(shù)與NLR、NE與SAA之間相關(guān)性增強，而SAA與CRP、LDH與CKMB、NE與CK之間相關(guān)性明顯下降。

3討論

全球每年因毒蛇咬傷繼發(fā)嚴重疾病人數(shù)為180萬～270萬，因毒蛇咬傷致死人數(shù)高達約9.5萬，致殘致畸人數(shù)高達30萬[5]。毒蛇咬傷是我國南方地區(qū)夏秋季節(jié)常見的急危重癥，每年毒蛇咬傷達10萬人次，其中73%為中青年；蛇傷致喪失勞動能力者約為25%～30%，蛇傷致殘率可達6.85%，是危害我國農(nóng)民健康的主要災害性疾病之一[6]。

蝮蛇屬于混合毒類蛇，蛇毒成分主要為出血毒素、凝血毒素、細胞毒素、肌肉毒素和少量的神經(jīng)毒素，咬傷后主要表現(xiàn)為局部肢體腫脹，而皮膚創(chuàng)面壞死和內(nèi)臟主要器官的損害發(fā)生率不高。蝮蛇咬傷引起的感染和炎癥反應以及蛇毒對機體組織的破壞在臨床上主要表現(xiàn)為中性粒細胞和常規(guī)的炎癥標志物如CRP等以及組織損傷標志物CK等升高。此外，NLR是中性粒細胞與淋巴細胞數(shù)量之比，越來越多研究中被用作炎癥狀態(tài)的評估指標。但在毒蛇咬傷中NLR的研究還太少，有限的臨床研究發(fā)現(xiàn)毒蛇咬傷后隨著NLR升高其并發(fā)癥發(fā)生風險增加，因此可以作為預測臨床結(jié)局的重要指標[7]。SAA是一種急性相蛋白，在炎癥反應中迅速升高。與目前廣泛使用的C反應蛋白相比，SAA通常是一種更敏感的炎癥標志物[8]。

NETS在2004年被Brinkmann等[9]發(fā)現(xiàn)，是一種中性粒細胞有別于傳統(tǒng)凋亡和壞死的胞外捕獲和殺滅病原體的方式，又稱為NETs的形成（NETosis）。在該種方式中，中性粒細胞可以在一定刺激條件下被激活，經(jīng)歷細胞核脫顆粒、染色質(zhì)去凝集、核膜脫離、顆粒膜解體、核質(zhì)與胞質(zhì)混合，最后在細胞膜破裂后釋放出上述混合物構(gòu)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)以吸附和殺滅各種病原微生物[10]。該網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)成分主要為DNA和抗微生物蛋白及蛋白酶類，后者主要為中性粒細胞彈性蛋白酶NE和組蛋白。

NETs含量與功能變化主要依靠對NETs主要成分和形成關(guān)鍵蛋白進行測定，包括cfDNA/NETs和中性粒細胞彈性蛋白酶NE。Meta分析提示NETs形成的過程可以造成節(jié)肢動物毒液在咬傷部位積聚，導致明顯的局部壞死，推測可能是蜘蛛、蝎子、蜈蚣等咬傷引起局部組織損傷的最主要途徑之一[11]。而動物實驗發(fā)現(xiàn)蛇毒可引起小鼠鼠尾微血管血栓，而通過抑制NETs形成關(guān)鍵酶可以減少蛇毒毒液積聚和血栓形成，推測引起毒素局部積聚的主要機制與NETs產(chǎn)生的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)阻塞局部微血管、阻止毒液進入循環(huán)有關(guān)。這種局部毒素持續(xù)聚積，可降解細胞外基質(zhì)包括結(jié)構(gòu)蛋白（膠原蛋白、層黏連蛋白和纖維黏連蛋白分子）和結(jié)構(gòu)糖胺聚糖透明質(zhì)酸，細胞外基質(zhì)完整性的喪失會破壞組織和血管基底膜的穩(wěn)定性，從而引發(fā)局部組織持續(xù)性腫脹和功能異常[12]。

本研究中蝮蛇咬傷后患者外周靜脈血中性粒細胞數(shù)明顯上升，NETs的標志物NE和cf-DNA水平表達增高，并且炎癥相關(guān)標志物CRP、SAA和NLR同時上升，組織損傷標志物AST升高。而通過相關(guān)性分析表明蝮蛇咬傷后NETs標志物與上述炎癥和組織損傷標志物之間有相關(guān)性，且相關(guān)性受中性粒細胞計數(shù)影響，有基于此本研究認為NETs參與了蝮蛇咬傷后炎癥反應和組織損傷。因此，筆者推測在蝮蛇咬傷的治療中，積極抑制NETs的形成對于減輕蝮蛇蛇毒引起的肢體腫脹具有可行性。由于本研究僅通過檢測蝮蛇咬傷后部分炎癥和組織損傷標志物的外周血清水平，初步分析出NETs和炎癥及組織損傷之間的關(guān)系，受臨床樣本量不足的限制，本次研究存在一定局限，后期還將通過臨床大樣本量觀察和動物模型及細胞分子水平對其存在的機制進行更深入研究，以期為蝮蛇咬傷的治療提供更優(yōu)化的方案。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2024–04–25）

（修回日期：2024–05–12）