基于WGCNA鑒定阿爾茨海默病的衰老關(guān)鍵基因

[摘要]目的采用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（weightedgeneco-expressionnetworkanalysis，WGCNA）方法篩選并鑒定阿爾茨海默病（Alzheimer’sdisease，AD）相關(guān)的衰老基因。方法從GEO數(shù)據(jù)庫中選擇GSE132903作為分析數(shù)據(jù)集，篩選AD差異表達(dá)基因（differentialexpressedgene，DEG），采用火山圖和熱圖進(jìn)行差異基因可視化分析；從MsigDB、AgingAltas、CellAge三個數(shù)據(jù)庫中下載衰老和衰老相關(guān)基因（agingandsenescence-associatedgene，ASAG）；WGCNA篩選與AD臨床特征相關(guān)性最高的基因模塊，并采用基因本體（geneontology，GO）、京都基因與基因組百科全書（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG）對模塊內(nèi)基因進(jìn)行富集分析；取DEG、WGCNA關(guān)鍵模塊基因及ASAG的交集基因得到AD衰老相關(guān)差異表達(dá)基因（ADage-relateddifferentialexpressedgene，ARDEG），使用STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-proteininteraction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析尋找關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因；使用GeneMANIA數(shù)據(jù)庫分析ARDEG的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)和相關(guān)功能；最后將篩選到的關(guān)鍵基因在已知AD患者數(shù)據(jù)庫Alzdata中進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果共篩選出226個DEG，611個ASAG，8個ARDEG。PPI篩選出排名前5位的關(guān)鍵基因分別為SYP、STXBP1、VAMP2、CPLX1和STX1A。Alzdata數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)除海馬區(qū)VAMP2和額葉皮層STXBP1無明顯改變、額葉皮層CPLX1無表達(dá)外，5個關(guān)鍵基因在AD其余腦區(qū)中表達(dá)均下調(diào)，且VAMP2、STXBP1和STX1A已在AD早期出現(xiàn)差異表達(dá)，CPLX1與Tau病理過程有關(guān)，SYP、STXBP1與β-淀粉樣蛋白和Tau病理過程均有關(guān)。結(jié)論SYP、STXBP1、VAMP2、CPLX1和STX1A均為ARDEG，有望成為AD潛在的診斷和治療靶點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞]阿爾茨海默病；加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析；衰老基因；生物信息學(xué)

[中圖分類號]R749.16[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[DOI]10.3969/j.issn.1673-9701.2024.28.004

ScreeningofagingkeygenesinAlzheimer’sdiseasebasedonWGCNA

LIXiaolin1，SUIXin2，MANZiteng1，CHENGTiantian1，SONGJuan1，BAOYanan1，LINYu1，YANGHongyan1

1.SchoolofPharmacyofQiqiharMedicalUniversity，Qiqihar161006，Heilongjiang，China;2.DepartmentofNeurology，theThirdAffiliatedHospitalofQiqiharMedicalUniversity，Qiqihar161000，Heilongjiang，China

[Abstract]ObjectiveUsingtheweightedgeneco-expressionnetworkanalysis（WGCNA）toexplorethekeygenesofagingassociatedwithAlzheimer’sdisease（AD）.MethodsGSE132903wasselectedfromGEOdatabaseastheanalysisdataset.Thedifferentialexpressedgenes（DEGs）ofADwerescreened，andvisualizedwithvolcanoandheatmap.Agingandsenescence-associatedgenes（ASAGs）weredownloadedfromMsigDB，AgingAltasandCellAgedatabases.WGCNAscreenedthegenemoduleswiththehighestcorrelationwithAD，andgenesofkeymodulessubsequentlyperformedwithgeneontology（GO），KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes（KEGG）enrichmentanalysis.ADage-relateddifferentialexpressedgenes（ARDEGs）wereobtainedbytakingintersectiongenesofDEGs，keymodulegenesofWGCNAandASAGs.Protein-proteininteraction（PPI）networkanalysiswasperformedusingtheSTRINGdatabasetofindkeynodegenes.Theco-expressionnetworksandassociatedfunctionsofkeygeneswereanalyzedusingtheGeneMANIAdatabase.ThekeygeneswerevalidatedinAlzdatadatabase.Results226DEGs，606ASAGsand8ARDEGswereobtained.Thetop5keygenesselectedbyPPIwereSYP，STXBP1，VAMP2，CPLX1andSTX1A.Alzdatadatabaseverifiedthattheexpressionsof5keygenesinotherbrainregionsofADweredown-regulated，exceptfornosignificantchangesofVAMP2inhippocampusandSTXBP1infrontalcortex，aswellasnoexpressionofCPLX1infrontalcortex.ThedifferentialexpressionofVAMP2，STXBP1andSTX1AappearedintheearlystageofAD，andCPLX1wasrelatedtothepathologicalprocessofTau.SYPandSTXBP1wererelatedtothepathologicalprocessesofamyloidβ-proteinandTau.ConclusionSYP，STXBP1，VAMP2，CPLX1andSTX1AareARDEGs，whichareexpectedtobepotentialdiagnosticandtherapeutictargetsforAD.

[Keywords]Alzheimer’sdisease;Weightedgeneco-expressionnetworkanalysis;Aginggene;Bioinformatics

阿爾茨海默病（Alzheimer’sdisease，AD）是一種起病隱匿且進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床上以記憶減退、失語、失認(rèn)為主要特征[1-2]。AD的發(fā)病機(jī)制迄今未明，且患者的病理生理改變早于臨床癥狀出現(xiàn)，現(xiàn)有的治療手段只能延緩AD的進(jìn)程[3]。隨著社會步入老齡化時代，AD的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢，嚴(yán)重影響老年人的身心健康和日常生活質(zhì)量，加重患者及其家庭的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，已成為嚴(yán)重的社會問題，深入研究AD的發(fā)病機(jī)制和治療策略迫在眉睫。衰老是AD的關(guān)鍵危險因素，衰老細(xì)胞在組織中積累，通過釋放炎癥因子，導(dǎo)致與年齡相關(guān)的病理改變。臨床證據(jù)表明，神經(jīng)炎癥在AD患者出現(xiàn)輕度認(rèn)知障礙前即已發(fā)生，說明早期神經(jīng)炎癥可能由大腦中衰老細(xì)胞積累所驅(qū)動；而AD病理改變又促進(jìn)衰老進(jìn)程，進(jìn)一步增加衰老細(xì)胞的負(fù)擔(dān)和衰老大腦中的炎癥。β-淀粉樣蛋白（amyloidβ-protein，Aβ）的積聚和Tau病理驅(qū)動的衰老也是導(dǎo)致AD進(jìn)程加重的原因[4]。因此，抗衰老靶向藥物可預(yù)防或減輕AD的發(fā)生和發(fā)展。本研究采用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（weightedgeneco-expressionnetworkanalysis，WGCNA）篩選與AD相關(guān)的衰老基因，并在AD患者中進(jìn)行驗(yàn)證，尋找AD衰老生物標(biāo)志物，為AD的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。

1資料與方法

1.1數(shù)據(jù)收集和處理

從GEO公共數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中以關(guān)鍵詞“Alzheimer’sdisease”搜索并篩選微列陣數(shù)據(jù)集，本研究選取來源于GPL10558平臺的GSE132903數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，該數(shù)據(jù)集包含AD患者97例和非癡呆對照者98例。

1.2差異表達(dá)基因篩選

使用limmaR包對數(shù)據(jù)集進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化處理，輸出同時滿足|log2foldchange（log2FC）|>1且P<0.05的基因作為差異表達(dá)基因（differentialexpressiongene，DEG）。使用R軟件ggplot2繪制火山圖，ComplexHeatmap工具包繪制熱圖，進(jìn)行可視化分析。

1.3衰老相關(guān)基因篩選

從MsigDB（https：//www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb）、AgingAltas（https//ngdc.cncb.ac.cn/aging/index）、CellAge（https：//genomics.senescence.info/cells/）3個衰老數(shù)據(jù)庫中，依次以“Senescencegene”為關(guān)鍵詞搜索、下載衰老相關(guān)基因集，對3個衰老數(shù)據(jù)庫得到的基因集取并集，重復(fù)的基因只計(jì)一次，最終得到衰老和衰老相關(guān)基因（agingandsenescence-associatedgene，ASAG）合集。

1.4WGCNA

利用WGCNA方法選擇適當(dāng)?shù)能涢撝郸聵?gòu)建無標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)，采用動態(tài)剪切樹法進(jìn)行層次聚類；計(jì)算基因顯著性（genesignificance，GS）及模塊顯著性（modulesignificance，MS），選取相關(guān)系數(shù)最高的模塊為關(guān)鍵模塊，模塊中的基因作為候選基因。

1.5AD衰老相關(guān)差異表達(dá)基因的篩選

取DEG、ASAG及WGCNA關(guān)鍵模塊基因的交集基因作為AD衰老相關(guān)差異表達(dá)基因（ADage-relateddifferentialexpressedgene，ARDEG），即AD和衰老共同的差異表達(dá)基因，進(jìn)行后續(xù)分析。

1.6差異基因功能富集分析

利用David數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov）進(jìn)行基因本體（geneontology，GO）功能分析和京都基因與基因組百科全書（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG）通路富集分析。GO分析包括生物過程（biologicalprocess，BP）、細(xì)胞組分（cellularcomponent，CC）和分子功能（molecularfunction，MF）三部分，KEGG主要分析基因相關(guān)的代謝通路。

1.7蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵基因篩選

通過STRING在線分析軟件（http：//www.string-db.org）構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-proteininteraction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscapes軟件中的Cytohubba插件，綜合多種算法篩選出評分較高的ARDEG作為關(guān)鍵基因。GeneMANIA數(shù)據(jù)庫（http：//genemania.org/）分析ARDEG關(guān)鍵基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)和相關(guān)功能。

1.8關(guān)鍵基因在已知AD患者數(shù)據(jù)庫中的驗(yàn)證

為進(jìn)一步驗(yàn)證關(guān)鍵基因在AD中的表達(dá)情況，借助已有的AD患者數(shù)據(jù)庫（www.Alzdata.org）對篩選出的ARDEG關(guān)鍵基因進(jìn)行驗(yàn)證。關(guān)鍵基因表達(dá)改變以log2FC形式展示，P值為調(diào)整后的P值。同時采用趨同功能基因組（convergentfunctionalgenomics，CFG）方法對關(guān)鍵基因進(jìn)行評估，以進(jìn)一步篩選在AD中發(fā)揮關(guān)鍵作用的核心基因。CFG評分范圍0～5分，分值越高說明該基因與AD相關(guān)性越強(qiáng)。

2結(jié)果

2.1DEG篩選結(jié)果

共篩選出226個DEG，其中78個基因表達(dá)上調(diào)，148個基因表達(dá)下調(diào)。圖1為DEG的火山圖和熱圖。

2.2WGCNA分析結(jié)果

根據(jù)無尺度網(wǎng)絡(luò)擬合指數(shù)和平均連接度，計(jì)算并選取相關(guān)系數(shù)為0.87，軟閾值為12，構(gòu)建無尺度網(wǎng)絡(luò)。動態(tài)剪切樹法進(jìn)行基因聚類。通過計(jì)算分析各基因模塊與臨床表型之間的關(guān)系，繪制共表達(dá)模塊與臨床表型的相關(guān)性熱圖，共獲得16個基因共表達(dá)模塊。選擇與AD表型相關(guān)性最強(qiáng)的黑灰色模塊（cor=-0.45，P<0.01）對其進(jìn)行散點(diǎn)圖分析，GS與MS在黑灰色模塊中呈正相關(guān)（r=0.39，P=5.3×10-11）。設(shè)置篩選條件為GS>0.1，MS>0.8，校正后P<0.01，進(jìn)一步篩選黑灰色模塊中的關(guān)鍵樞紐基因。剔除非編碼基因后，共篩選出105個基因作為候選關(guān)鍵基因，見圖2。

A.軟閾值篩選；B.基因聚類；C.生物模塊與臨床表型相關(guān)性分析；D.關(guān)鍵生物模塊特征與模塊基因的相關(guān)性分析

2.3GO和KEGG富集分析結(jié)果

對DEG及WGCNA關(guān)鍵模塊內(nèi)的基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG信號通路富集分析，結(jié)果顯示DEG主要富集在化學(xué)突觸傳遞等生物學(xué)過程、神經(jīng)元投射等細(xì)胞成分、可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著受體（solubleN-ethylmaleimidesensitivefactorattachmentreceptors，SNARE）綁定等分子功能及突觸囊泡周期等信號通路。WGCNA關(guān)鍵模塊基因主要參與突觸囊泡內(nèi)吞等生物學(xué)過程、突觸囊泡膜等細(xì)胞成分、蛋白結(jié)合等分子功能及突觸囊泡周期等信號通路富集，見圖3。

2.4ARDEG的篩選及鑒定結(jié)果

從MsigDB、AgingAltas、CellAge三個衰老數(shù)據(jù)庫中檢索ASAG，取并集，共得到611個ASAG。對DEG、ASAG及WGCNA關(guān)鍵模塊基因取交集，得到8個ARDEG，分別為SYP、VAMP2、STXBP1、CPLX1、STX1A、PTPRN、NRGN和CKMT1A，見圖4。

A.DEG的GO富集分析；B.DEG的KEGG通路富集分析；

C.WGCNA關(guān)鍵模塊基因的GO富集分析；D.WGCNA關(guān)鍵模塊基因的KEGG通路富集分析

2.5PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵基因篩選結(jié)果

通過STRING在線分析軟件構(gòu)建ARDEG的PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖5A。除去一個孤立的節(jié)點(diǎn)（CKMT1A），采用Cytohubba插件，使用最大集團(tuán)中心性、最大相鄰成分、節(jié)點(diǎn)連接度和邊緣滲濾分量等算法篩選出評分較高的前5位關(guān)鍵基因，分別為SYP、STXBP1、VAMP2、CPLX1和STX1A。通過GeneMANIA數(shù)據(jù)庫構(gòu)建關(guān)鍵基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，篩選出與關(guān)鍵基因存在相互作用的基因20個，見圖5B。

2.6關(guān)鍵基因驗(yàn)證

將篩選到的關(guān)鍵基因輸入Alzdata數(shù)據(jù)庫進(jìn)行驗(yàn)證，除VAMP2在海馬區(qū)、STXBP1在額葉皮層無明顯改變和CPLX1在額葉皮層無表達(dá)外，5個關(guān)鍵基因在AD其余腦區(qū)中表達(dá)均下調(diào)，見圖6。CFG評分由高到低分別為：STXBP1（4分）、VAMP2（3分）、CPLX1（3分）、SYP（1分）、STX1A（1分）。其中STXBP1、VAMP2、STX1A在AD早期已存在差異表達(dá)，CPLX1與Tau蛋白有關(guān)，STXBP1、SYP與Aβ和Tau形成均具有相關(guān)性，見表1。

3討論

本研究通過WGCNA對GSE132903數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，篩選出與AD臨床特征高度相關(guān)的黑灰色模塊，進(jìn)一步將該模塊內(nèi)的基因與AD的DEG、ASAG取交集，得到8個ARDEG，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，最終篩選出排名前5位的關(guān)鍵基因：SYP、STXBP1、VAMP2、CPLX1和STX1A。

SYP（synaptophysin，突觸生長蛋白）是一種鈣結(jié)合糖蛋白，廣泛分布于神經(jīng)突觸前膜的囊泡膜，釋放Ca2+依賴性神經(jīng)遞質(zhì)，參與突觸小泡的進(jìn)入和再循環(huán)，是突觸前末梢的特異性標(biāo)志蛋白[5]。SYP表達(dá)水平可反映突觸的密度、分布面積和功能狀態(tài)，從而反映突觸的可塑性[6]。SYP被天冬酰胺內(nèi)肽酶剪切后，可影響突觸囊泡的再循環(huán)，導(dǎo)致突觸功能障礙和認(rèn)知障礙，促進(jìn)AD發(fā)病[7]。研究發(fā)現(xiàn)AD模型小鼠腦組織及AD患者腦海馬區(qū)域的SYP表達(dá)均下調(diào)[5，8]；臨床尸檢已證實(shí)AD患者前額葉和海馬等腦區(qū)SYP表達(dá)下調(diào)，且其表達(dá)水平與臨床癥狀呈負(fù)相關(guān)[9]。突觸蛋白丟失是散發(fā)性AD的早期發(fā)病機(jī)制之一[10]。本研究發(fā)現(xiàn)SYP在AD患者各腦區(qū)表達(dá)顯著下調(diào)，與上述研究結(jié)果一致，提示SYP可能通過影響突觸可塑性參與AD的發(fā)生發(fā)展，可成為AD潛在的治療靶點(diǎn)。

STXBP1（syntaxin-bindingprotein1，突觸結(jié)合蛋白1）可與突觸素1的N端結(jié)合，促進(jìn)整合膜蛋白受體復(fù)合物的形成和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)STXBP1缺失可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄和翻譯的廣泛失調(diào)，影響突觸的發(fā)育，進(jìn)而使神經(jīng)元細(xì)胞在突觸形成前的未成熟階段死亡[13]。STXBP1在大鼠大腦中形成淀粉樣原纖維聚集體，并在大鼠腦和細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中表現(xiàn)出淀粉樣蛋白特性，參與淀粉樣蛋白聚集[14]。本研究發(fā)現(xiàn)STXBP1在AD早期已出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)，且與Aβ及Tau形成密切相關(guān)，提示STXBP1可作為AD診斷和治療的靶點(diǎn)。

VAMP2（vesicle-associatedmembraneprotein2，囊泡相關(guān)膜蛋白2）是SNARE復(fù)合體的重要組成部分，分布于囊泡膜上，參與神經(jīng)遞質(zhì)釋放[15]。VAMP2可作為輕度認(rèn)知障礙患者向AD轉(zhuǎn)變的標(biāo)志物[16]。研究發(fā)現(xiàn)散發(fā)性AD患者早期腦脊液中VAMP2水平降低[17]。糖原合酶激酶3是一種在神經(jīng)元的發(fā)育和成熟過程中非常重要的蛋白激酶。研究發(fā)現(xiàn)糖原合酶激酶3的激活可抑制VAMP2順向軸突轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致VAMP2在胞體的聚集和軸突遠(yuǎn)端含量的降低，進(jìn)一步加劇軸突轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，影響突觸可塑性[18]。本研究發(fā)現(xiàn)VAMP2在AD患者各腦區(qū)表達(dá)下調(diào)，且在AD早期就已經(jīng)出現(xiàn)，提示VAMP2可作為AD認(rèn)知功能下降的標(biāo)志物，進(jìn)行早期篩查。

CPLX1（complexin-1，復(fù)合素1）是突觸前結(jié)構(gòu)中重要的神經(jīng)遞質(zhì)釋放調(diào)節(jié)蛋白，可與鈣感受器一起調(diào)控鈣依賴性神經(jīng)遞質(zhì)的快速釋放，加速突觸囊泡胞吐作用[19]。補(bǔ)益脾胃的方藥可提高SAMP8小鼠海馬CPLX1水平，調(diào)節(jié)突觸功能，促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)釋放，改善小鼠學(xué)習(xí)記憶能力[20]。逍遙散可通過上調(diào)CPLX1改善大鼠的焦慮抑郁癥狀，說明CPLX1可能是藥物發(fā)揮抗焦慮抑郁作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)[21]。AD患者常伴焦慮、失眠、抑郁等癥狀；本研究發(fā)現(xiàn)CPLX1在AD患者腦區(qū)下調(diào)，提示可通過上調(diào)CPLX1水平緩解AD患者的失眠、抑郁等精神狀況。

STX1A（syntaxin-1A，突觸融合蛋白-1A）是突觸蛋白家族的一種突觸前質(zhì)膜蛋白，與其他蛋白共同組成SNARE復(fù)合物，對調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的突觸前釋放至關(guān)重要[22]。STX1A位于突觸前膜的囊泡里，是重要的離子通道調(diào)節(jié)蛋白，可調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，影響大腦神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育[23]。研究發(fā)現(xiàn)STX1A基因敲除小鼠表現(xiàn)出異常行為，可能與破壞5-羥色胺能神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)[24]。STX1A基因變異與兒童多動癥易感性有關(guān)[25]。STX1A與AD相關(guān)的研究較少，本研究發(fā)現(xiàn)STX1A在AD早期各腦區(qū)中的表達(dá)水平下調(diào)，提示STX1A可作為AD早期檢測的生物標(biāo)志物。

綜上，本研究通過WGCNA分析得到5個AD與衰老共同的關(guān)鍵基因SYP、STXBP1、VAMP2、CPLX1和STX1A，均在突觸通路上富集，具有成為AD早期診斷和治療靶點(diǎn)的潛力，值得進(jìn)一步深入研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2024–06–16）

（修回日期：2024–09–08）