中國人群33 104 例單基因病攜帶者篩查的多中心研究

摘要：目的 通過大規(guī)模多中心的多種遺傳病攜帶者篩查，調查中國人群單基因病的流行病學特征以及突變譜，為制定適合中國人群的遺傳病預防策略提供依據。方法 本研究在中國的12個臨床中心共招募33 104例受檢者（16 610例女性），基于高通量測序和多種PCR對223個基因的攜帶者狀態(tài)進行檢測。結果 197個常染色體基因的合并攜帶者頻率為55.58%，26個X連鎖基因的合并攜帶者頻率為1.84%。在16 669 例家系中，共檢出874 對（5.24%）高危夫婦。其中常染色體基因高危夫婦584 對（3.50%），X連鎖基因高危夫婦306對（1.84%），16對夫婦同時為常染色體基因和X連鎖基因高危夫婦。最常檢出的常染色體高?；虬℅JB2（常染色體隱性耳聾1A，393 對），HBA1/HBA2（α-地中海貧血，36 對）和PAH（苯丙酮尿癥，14 對），SMN1（脊髓性肌萎縮癥，14對）。最常檢出的X連鎖高危基因包括G6PD（G6PD缺乏癥，236對），DMD（進行性假肥大性肌營養(yǎng)不良，23對）和FMR1（脆性X綜合征，17對）。除外G6PD后的高危夫婦率為3.91%（651/16 669），進一步除外GJB2 c.109Ggt;A位點后，高危夫婦率為1.72%（287/16 669）。理論上嚴重的單基因病出生缺陷的發(fā)病率約為4.35‰（72.5/16 669）。對導致高危夫婦最多的22 個基因進行篩查可檢出95%以上的高危夫婦，對導致高危夫婦最多的54 個基因進行篩查可檢出99%以上的高危夫婦。結論 本研究揭示了我國人群中223種單基因病的攜帶者頻率，為中國人群的攜帶者篩查策略制定和panel設計提供依據。在攜帶者篩查實踐中，針對某些特殊基因或變異位點的遺傳咨詢可能會面臨困難。這些特殊基因或變異需要在檢測前告知受檢夫婦，并在可能的情況下提供不篩查這些基因或變異的選擇。

關鍵詞：攜帶者篩查；單基因病；遺傳咨詢

單基因病是先天性缺陷的主要原因之一，也是影響公共衛(wèi)生的全球性問題［1］。無癥狀的單基因病攜帶者有可能生育患兒。既往研究已發(fā)現7000 余種單基因病［2］，其中有嚴重臨床癥狀的常染色體隱性遺傳病和X連鎖遺傳病約1300余種［3］，有研究顯示嚴重隱性遺傳病的累計發(fā)病率為1/500［4］。攜帶者篩查的目的是在普通人群中識別攜帶致病基因的無癥狀個體，評估其后代患遺傳病的風險，通過進一步的遺傳咨詢和生育指導，避免嚴重遺傳病的發(fā)生［5］。

單基因病的攜帶者頻率是一項重要的流行病學指標，為臨床遺傳咨詢和公共衛(wèi)生決策提供重要依據。最早的遺傳病攜帶者篩查是在德裔猶太人中對Tay-Sachs病進行的篩查，這一實踐正是因為在該人群中發(fā)現了異常高的攜帶者頻率［6］。隨著科技的進步，特別是高通量測序技術的普及和測序成本的降低，攜帶者篩查的目標人群和疾病范圍也相應擴展。美國婦產科醫(yī)師學會（ACOG）和美國醫(yī)學遺傳學和基因組學學會（ACMG）均將攜帶者頻率作為選擇篩查疾病的標準之一，這進一步強調了其在遺傳病預防和管理中的重要性［7， 8］。準確地了解和利用攜帶者頻率數據，對于計算篩查的殘余風險、提供有效的遺傳咨詢以及制定合理的篩查策略都具有至關重要的意義［9， 10］ 。

攜帶者篩查已進入多基因同時篩查的擴展性攜帶者篩查時代。然而，盡管單基因病的攜帶者篩查在全球范圍內已經得到了廣泛的關注和實踐，但目前仍缺乏針對中國人群的大規(guī)模、多中心的攜帶者篩查研究。以往的中國人群攜帶者篩查研究往往局限于較少的病種數量，如遺傳性耳聾和地中海貧血，或者僅在中國的局部地區(qū)進行，難以全面反映中國人群中單基因病的流行特征［11-14］。公開的人群頻率數據庫中也缺乏對中國人群的代表性［15］。加之我國人口眾多，經濟發(fā)展不平衡，遺傳咨詢能力不足，如何開展適合國情的攜帶者篩查是一個迫切需要解決的問題。

基于以上背景，在國家重點研發(fā)計劃支持下我們開展了這項包含33 104例中國人群的單基因病攜帶者篩查研究。期望通過這一大規(guī)模、多中心的臨床研究實踐，揭示中國人群中單基因病的流行病學特征以及突變譜；結合實施過程中發(fā)現的問題，為制定適合中國人群的遺傳病預防策略提供科學依據。

1 資料和方法

1.1 受試者招募

2022年7月20日～2023年10月31日，本研究在中國的12 個臨床中心共招募33 104 例受檢者（16 610 例女性）。入組標準：備孕或孕周小于等于13+6周的單胎妊娠的夫妻；簽署書面知情同意書。排除標準：輔助生殖受孕；已經被診斷為單基因疾病患者或攜帶者；在1年內接受過輸血、器官移植或免疫治療。本研究已通過倫理審查委員會審核批準［中國人民解放軍總醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會（倫審第S2021-474-01 號），中南大學醫(yī)學倫理委員會（倫審第202107009號），濟南市婦幼保健院倫理審查委員會（倫研批第2021-1-036），南京市婦幼保健院醫(yī)學倫理委員會（寧婦倫字2021 NFKSL-086號），中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會（2021PS661K），四川大學華西第二醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會（2021 倫審批第155 號）；湖南省婦幼保健院倫理委員會（快202160 號），浙江大學醫(yī)學院附屬婦產科醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會（IRB-20210242-R），安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學研究倫理委員會（倫審-快-PJ2020-06-51）等］。

1.2 篩查疾病的選擇

本研究共對223個基因進行篩查。篩查的疾病根據如下標準選擇：（1）已知攜帶頻率為1/100或更高；（2）具有明確的表型；（3）對生活質量有嚴重不良影響；（4）導致認知或身體損害；（5）需要醫(yī)療或手術干預；（6）生命早期發(fā)??；（7）改變分娩管理以改善新生兒結果，并教育父母了解出生后的特殊護理需求。由于部分基因在中國人群中的攜帶者頻率尚不明確，本研究的疾病列表基于4個來源：（1）文獻研究：一般人群中的高頻變異以及中國或東亞/東南亞人群中的常見變異；（2）Gnomad 數據庫：東亞/東南亞中的高頻LOF變異；（3）其他專業(yè)數據庫，如HGMD、ClinVar和LOVD；（4）本地數據庫。

1.3 文庫制備及高通量測序

本研究使用通用下一代測序文庫制備試劑盒（Biosan Tech）進行DNA文庫制備。使用文庫定量試劑盒（Roche）按照生產商說明對純化的DNA文庫進行定量。本研究使用定制的攜帶者篩查捕獲探針試劑盒（Biosan Tech）。該探針區(qū)域覆蓋了目標基因所有外顯子和已報道的內含子中的致病性（P）/可能致病性（LP）變異。目標區(qū)域包括所有單核苷酸變異（SNV）、10 bp以內的插入/缺失變異，以及部分缺失/重復變異。利用捕獲探針試劑盒，結合目標區(qū)域捕獲和高通量測序方法，在MGI-DNB-T7 測序儀上對樣本進行測序。將獲得的DNA 序列與NCBI 人類參考基因組（hg19/GRCh37）進行比較。檢測到的變異進行了生物信息學分析和致病性解讀，最終報告P和LP變異。此外，X連鎖基因的檢測限于女性受檢者。

1.4 FMR1基因檢測

使用脆性X綜合征CGG重復數檢測試劑盒（PCR -毛細管電泳法）（Biosan Tech）檢測FMR1相關的脆性X綜合征。該試劑盒通過基因特異性PCR和三重重復引物PCR偶聯(lián)擴增，計算外周血樣本中FMR1基因5'端非編碼區(qū)CGG重復序列的數量和范圍。這項測試僅限于女性受試者。

1.5 F8基因倒位檢測

采用血友病F8 基因檢測試劑盒（PCR -電泳法）（Biosan Tech）。該試劑盒采用LR-PCR結合瓊脂糖凝膠電泳檢測F8基因內含子1和內含子22的倒位。這項測試僅限于女性受試者。

1.6 攜帶者頻率的計算

計算攜帶者頻率時僅考慮P/LP變異的攜帶者，不計入臨床意義不明變異（VUS）的攜帶者。單一受檢者在同一個基因上檢出多個P/LP變異時只計數1次，不會記作多個攜帶者。X連鎖基因的攜帶者頻率僅統(tǒng)計女性受檢者。

1.7 檢測前的遺傳咨詢

宣教擴展性攜帶者篩查的檢測方法、目的、意義以及篩查和診斷流程，并介紹目前的研究項目以及入組后的獲益及風險。

1.8 檢測后的遺傳咨詢

安排專人發(fā)放科研檢測報告并進行遺傳咨詢。疑難病例提交專家組討論，必要時提交項目組建立的多學科會診平臺討論。

2 結果

2.1 總體人群中的攜帶者情況

本研究?？傮w人群中，進行篩查的197 個常染色體基因的合并攜帶者頻率為55.58%（18 399/33 104），26 個X連鎖基因的合并攜帶者頻率為1.84%（306/16610）。在18 527例攜帶者中，12 111例（65.37%）攜帶1個變異，4870 例（26.29%）攜帶2 個變異，1274 例（6.73%）攜帶3 個變異，245 例（1.32%）攜帶4 個變異，54 例（0.28%）攜帶5個及以上變異?？傮w人群中攜帶者頻率最高的基因及對應疾病是GJB2（常染色體隱性耳聾1A，13.31%），顯著高于其它基因；其它攜帶者頻率較高的基因及對應疾病依次為HBA1/HBA2（α-地中海貧血，3.09%），PAH（苯丙酮尿癥，2.79%），ATP7B（肝豆狀核變性，2.75%）和SLC26A4（常染色體隱性耳聾4型，2.62%）。總體人群中共有17個基因的攜帶者頻率大于1/100 34個基因的攜帶者頻率大于1/200（表1）。

2.2 高危夫婦檢出情況

高危夫婦定義為夫妻雙方為同一常染色體基因的攜帶者，或女方為X連鎖基因的攜帶者。圖1顯示了本研究中的家系樣本送檢情況及篩查方案。本研究包含16 669例家系，其中16 435例（98.60%）家系送檢夫妻雙方樣本，234 例（1.40%）家系僅送檢一方樣本。所有家系中共檢出874對（5.24%）高危夫婦。常染色體基因高危夫婦584 對（3.50%），X 連鎖基因高危夫婦306 對（1.84%），16對夫婦同時為常染色體基因和X連鎖基因高危夫婦。除外G6PD后的高危夫婦檢出率為3.91%（651/16 669）。同時，考慮到GJB2 c.109Ggt;A位點相關疾病的表型差異較大，并且其等位基因頻率高達5.24%，進一步除外GJB2 c.109Ggt;A位點后，高危夫婦檢出率為1.72%（287/16 669）。按照單個高風險基因有1/4的概率生育患兒進行估計，兩個基因獨立遺傳時生育患兒的概率為43.75%［（1-3/4×3/4）×100%］，理論上本研究可避免約72.5例遺傳病患兒的出生，嚴重的單基因病出生缺陷的發(fā)病率約為4.35‰（72.5/16 669）。

本研究共檢出874對高風險夫婦，表2顯示了檢出的高?；虻姆植技袄龜担矙z出高?；?98次。在43 個常染色體基因和13 個X連鎖基因上檢出高危夫婦。最常檢出的常染色體基因包括GJB2（常染色體隱性耳聾1A，393對），HBA1/HBA2（α-地中海貧血，36對）和PAH（苯丙酮尿癥，14對），SMN1（脊髓性肌萎縮癥，14對）。最常檢出的X連鎖基因包括G6PD（G6PD缺乏癥，236對），DMD（進行性假肥大性肌營養(yǎng)不良，23對）和FMR1（脆性X綜合征，17對）。圖2顯示只要對高危夫婦檢出率較高的部分基因進行篩查，即可檢出大部分的高危夫婦。對223個基因中高危率最高的54個基因進行篩查，即可檢出99.02%的高危夫婦。

2.3 檢出的致病性和可能致病性變異

本研究在33 104例受檢者的223個基因進行篩查，共檢出5292種致病性或可能致病性變異，其中3405種（64.34%）變異僅檢出過1次。表3顯示了最常檢出的40個變異位點。檢出次數最多的位點為GJB2 c.109Ggt;A，共檢出3469次，遠高于其它位點。其它檢出次數較多位點包括：GALC c.1901Tgt;C（701次），POLG c.2890Cgt;T（631次），GJB2 c.235del（628次）。

3 討論

本研究是截止目前最大規(guī)模的中國人群攜帶者篩查研究，包含12個臨床中心共計33 104例樣本。本研究中197個常染色體基因的合并攜帶者頻率為55.58%，26個X連鎖基因的合并攜帶者頻率為1.84%。2023年Chen等［13］對300對中國漢族夫婦進行攜帶者篩查，342種疾病的攜帶者頻率為64.83%。2022 年Chau 等［11］對1543例中國南方人群進行315個基因的攜帶者篩查，攜帶者頻率為47.8%，2022年Hu等［16］對1915對中國東部漢族夫婦進行24個基因中的448個致病變異位點篩查，攜帶者頻率為18.5%。攜帶率的不同可能跟篩查的基因數量、采用的檢測技術、篩查人群及變異報告原則等有關。本研究在16 669 例家系中，共檢出874 對（5.24%）高危夫婦。除外GJB2 c.109Ggt;A及G6PD后，有287對（1.72%）高危夫婦需要孕前或產前干預以避免嚴重出生缺陷的發(fā)生。按照單個高風險基因有1/4的概率生育患兒進行估計，理論上本研究可避免約72.5例遺傳病患兒的出生。嚴重的單基因病出生缺陷的發(fā)病率約為4.35‰（72.5/16 669），遠高于唐氏綜合征，由此可以看出在我國開展多個基因的攜帶者篩查對降低遺傳病的首次發(fā)生具有重要意義。

本次篩查研究揭示了中國人群中一些常見的單基因病和變異位點，如GJB2基因相關的常染色體隱性耳聾、HBA1/HBA2基因關聯(lián)的α-地中海貧血，以及GALC基因的克拉伯病等。這些相對常見的遺傳病不僅對患者及其家庭造成深遠影響，也給遺傳咨詢和產前診斷帶來了挑戰(zhàn)。因此，對于這些遺傳病的深入學習和專業(yè)培訓顯得尤為重要。未來的遺傳病攜帶者篩查咨詢工作中，應加強對這些常見基因和變異的認知，提升醫(yī)務人員的遺傳咨詢能力，以確保為受檢者提供準確、全面的遺傳信息和個性化的指導建議。

遺傳病攜帶者篩查應包括多少基因一直是研究和爭論的焦點。2017年，美國婦產科醫(yī)師學會（ACOG）提出了攜帶者篩查基因選擇的7項標準，其中攜帶者頻率標準為大于1/100［8］。2021年，美國醫(yī)學遺傳學和基因組學學會（ACMG）指南提出的攜帶者頻率標準為常染色體疾病大于1/200，X連鎖疾病大于1/40 000［7， 10］。然而，雖然將更罕見的疾病納入篩查的收益逐漸遞減，但是并沒有充足的證據來設定一條具體的攜帶者頻率邊界。增加篩查基因的收益相對明確，但是隨之增加的成本卻難以量化而且可變，主要包括變異判讀的人工成本、遺傳咨詢的負擔、產生的意外信息、個體作為特定疾病攜帶者的表型不確定性、焦慮等［17］?？紤]到中國各地區(qū)間人工成本、遺傳咨詢能力、經濟基礎等差異以及不同的個體需求，有必要設計多種的panel以應對不同的情景［18］。本研究為中國人群的攜帶者篩查panel的設計提供了依據，基礎的攜帶者篩查panel可考慮本研究中檢出95%以上高危夫婦的22個基因，更高要求的篩查panel可以考慮99%（54個基因）的累積高危夫婦檢出比。

一些不確定性因素，如疾病的低外顯率和嚴重程度可變的表型等，會給攜帶者篩查的遺傳咨詢帶來一定的困難。盡管ACMG和ACOG指南主要推薦針對那些具有嚴重臨床表現且在生命早期就發(fā)病的疾病進行篩查，然而，由于等位基因異質性的存在，某些疾病可能展現出從輕微到嚴重的連續(xù)表型譜，或可能在個體的不同生命周期階段出現發(fā)病情況。在本研究隊列中，兩個常見的變異是GJB2 c.109Ggt;A非截斷變異（NT）和GJB2 c.235delC截斷變異（T），攜帶率分別為10.48%和1.90%。這兩個變異被ClinGen變異解釋專家組歸類為致病性［19］。基于截斷和非截斷變異的不同等位基因組合，可以觀察到不同程度的聽力損失。NT/NT基因型中53%的個體會出現輕度聽力損失，13%的人有嚴重的聽力損失；T/NT基因型中29%～37%的個體會出現輕度聽力損失，24%～30%的人會出現嚴重的聽力損失；T/T基因型有0～3%出現輕度表型，59%～64%出現嚴重聽力損失［20］。這樣的結果會給臨床咨詢帶來巨大困難，造成不當引產，本研究經討論后不在孕期夫婦中報告GJB2 c.109Ggt;A位點。此種處理方式必須在檢測前后咨詢時充分告知受檢夫婦，以免后代出現嚴重表型帶來醫(yī)療風險。本隊列中GALC基因的c.1901Tgt;C變異位點的檢出頻率位列第二，其攜帶率為2.12%。半乳糖神經酰胺酶活性缺乏可引起克拉伯病。大多數的克拉伯病患者在1 歲以前發(fā)病，首先表現為極度易激惹、痙攣和發(fā)育遲緩。嬰兒發(fā)病的克拉伯病的特征是最初幾個月發(fā)育正常，隨后迅速出現嚴重的神經功能惡化，平均死亡年齡為24月（8月～9歲）［21］。晚發(fā)性克拉伯病的臨床表現和病程變化更大。GALC c.1901Tgt;C位點與晚發(fā)型克拉伯病相關［22-25］。c.1901Tgt;G突變患者的發(fā)病年齡從8個月到51歲不等［26］。嬰兒期發(fā)病的變異幾乎沒有酶活性，而晚發(fā)型的酶活性為正常的4%～20%［24］，但是酶活性與表型之間并沒有明確對應的關系。除GJB2和GALC外，在其它基因上可能還存在類似的變異位點需要挖掘并予以關注。上述的特殊變異位點使得攜帶者篩查的遺傳咨詢和臨床決策更加困難。理想情況下，這些表型預測困難的變異位點應當在檢測前的遺傳咨詢中充分告知夫婦，并提供不篩查這些位點的選項。然而在大規(guī)模人口篩查及有限的遺傳咨詢能力的情況下，檢測項目很難根據個人意愿進行調整，因此攜帶者篩查后的咨詢需要針對具體的基因及變異針對性的咨詢，以免引起不當的終止妊娠。

本研究將G6PD列入篩查，其在本隊列的攜帶率高達1.42%。雖然G6PD缺乏癥的患者大多數無癥狀，并且可能終生都不知道自己的疾病狀態(tài)［27］，但G6PD缺乏癥可在新生兒中引起嚴重的間接高膽紅素血癥，可能導致核黃疸［28］。在受影響的新生兒中盡早診斷G6PD缺乏癥可能有助于降低嚴重高膽紅素血癥、核黃疸的風險和減少輸血的需要［29］。目前攜帶著篩查采用兩種篩查方法，一種是基于測序的篩查，即本研究所采用的方法，另一種方法是基于基因分型的篩查，即僅篩查已知致病的變異。兩種方法各有利弊，前者可檢測目標范圍內的所有變異，其中僅小部分是致病性和疑似致病性變異。這種方法可以發(fā)現更多罕見致病變異的攜帶者，但是檢出的臨床意義不明的變異也會給致病性判讀和臨床咨詢帶來困難。許多實驗室僅報告P/LP變異，但是在夫妻一方為攜帶者的情況下，也可以考慮報告另一方同一基因內的VUS變異［7］。后者是定向篩查，篩查的結果是確定的。例如Hu等［16］基于毛細管電泳的多重PCR技術在中國東部人群中對24個基因中的448個致病變異進行檢測，與測序為基礎的攜帶者篩查相比，該方法成本低廉且結果易于解釋，更適合遺傳咨詢能力較弱的機構或地區(qū)，然而該方法無法檢出不常見的致病變異的攜帶者。此次大規(guī)模多中心的多基因篩查研究，為選擇中國人群的熱點突變提供了依據，未來可針對不同的受眾設計不同的層級的篩查方案。

本項研究也存在一定的局限性。首先，盡管本研究對223個基因進行了篩查，但仍有可能遺漏了一些未引起重視但具有較高攜帶頻率的基因。其次，本研究在招募受檢者時未限定地區(qū)和民族，故未區(qū)分不同地區(qū)或民族間的攜帶頻率差異，這通常會導致按照哈迪-溫伯格平衡估計的高危夫婦率比真實觀察到的偏低。為了更準確地評估遺傳病風險，未來的研究應更加關注地區(qū)差異，并在篩查策略中充分考慮這些差異。最后，對于一些特殊基因的檢測存在困難。這主要是由于特殊的變異類型和檢測技術的局限性所致，例如CPY21A2、SMN1 等。大規(guī)模的基因轉換可能會導致功能性的CYP21A2 序列被其同源假基因CYP21A1P片段替換，而假基因CYP21A1P 上存在多個有害變異［30］。SMN1exon7 缺失占其所有致病變異的95%～98%，序列突變占2%～5%［31， 32］，加之SMN1的序列分析無法確定變異來源于SMN1 還是SMN2，因此對SMN1 的篩查僅限于對exon7缺失的檢測。SMN1 exon7缺失的篩查可能存在假陰性，因為大約5%～8% 的人群染色體上有兩個SMN1拷貝在一條染色體上，在另一條染色體上存在缺失，稱為［2+0］基因型［33］。錯誤的致病性判讀也可能導致一些真正的致病變異被遺漏。陰性結果并不能保證受檢者不會生育患兒，攜帶者篩查呈陰性仍存在殘余風險［34］。

綜上所述，本研究不僅揭示了我國人群中單基因病的流行病學特征，更重要的是為制定適合中國人群的單基因病預防策略提供了依據。未來，隨著技術的不斷進步和數據的不斷積累，有望進一步優(yōu)化和完善篩查策略，大大降低我國嚴重遺傳病的首次發(fā)生。

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（編輯：經 媛）

基金項目：國家重點研發(fā)計劃（2021YFC1005303）；軍隊后勤科研項目計劃生育專項課題（23JSZ17）