UBE2T通過調(diào)節(jié)性T細(xì)胞誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌的放療抵抗

摘要：目的 探索泛素結(jié)合酶2T（UBE2T）對肝細(xì)胞癌放療敏感性的影響及機(jī)制。方法 采用空白對照載體或過表達(dá)UBE2T慢病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠Hepa1-6 肝癌細(xì)胞建立對照組（LV-Control）和過表達(dá)組（LV-UBE2T），qPCR以及Western blotting 檢測上述細(xì)胞UBE2T表達(dá)情況；對兩組細(xì)胞進(jìn)行射線照射（IR）處理，克隆形成實(shí)驗檢測UBE2T過表達(dá)對Hepa1-6肝癌細(xì)胞放療敏感性影響；分別在裸鼠和C57BL/6小鼠皮下注射上述細(xì)胞建立肝癌皮下荷瘤小鼠模型，對皮下瘤予IR處理，建立LV-Control組、LVControl+IR組、LV-UBE2T組和LV-UBE2T+IR組，5～6只/組，觀察皮下瘤生長速度及體積。通過CIBERSORT算法分析肝癌免疫細(xì)胞浸潤情況與UBE2T表達(dá)量的關(guān)系。流式細(xì)胞術(shù)檢測上述4組小鼠的肝癌中CD4+T細(xì)胞以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）浸潤情況。比色法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中葡萄糖及乳酸的含量；癌癥和腫瘤基因圖譜（TCGA）的公共數(shù)據(jù)分析肝癌UBE2T表達(dá)量與糖酵解水平和Tregs 浸潤關(guān)系。Western blotting檢測UBE2T表達(dá)與糖酵解相關(guān)蛋白HK1、LDHA表達(dá)相關(guān)關(guān)系。體外共培養(yǎng)模型聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)以及qPCR驗證UBE2T過表達(dá)肝癌與Tregs 關(guān)系。結(jié)果 qPCR、Western blotting 結(jié)果顯示過表達(dá)組中UBE2T表達(dá)顯著升高（Plt;0.0001）?？寺⌒纬蓪?shí)驗、裸鼠肝癌皮下瘤實(shí)驗顯示UBE2T過表達(dá)導(dǎo)致肝細(xì)胞癌放療抵抗（Plt;0.05），UBE2T導(dǎo)致的放療抵抗在C57BL/6小鼠肝癌皮下瘤模型上更顯著（Plt;0.01）。CIBERSORT分析提示UBE2T高表達(dá)組肝癌中樹突狀細(xì)胞（Plt;0.01）、濾泡輔助性T細(xì)胞（Plt;0.001）、M2型巨噬細(xì)胞（Plt;0.01）、單核細(xì)胞（Plt;0.05）、總體淋巴細(xì)胞（Plt;0.05）以及Tregs（Plt;0.0001）浸潤比例上調(diào)。流式細(xì)胞術(shù)顯示過表達(dá)UBE2T小鼠肝癌免疫微環(huán)境中Tregs數(shù)量上調(diào)（Plt;0.05），IR導(dǎo)致UBE2T組CD4+T 細(xì)胞以及Tregs 浸潤增加（Plt;0.01 或Plt;0.001）。與對照組細(xì)胞培養(yǎng)上清液相比，過表達(dá)UBE2T 組的培養(yǎng)上清液葡萄糖濃度降低（Plt;0.05），乳酸濃度上調(diào)（Plt;0.01）。GSEA分析提示UBE2T高表達(dá)肝癌與糖酵解水平（Plt;0.001）、Tregs浸潤水平呈正相關(guān)（Plt;0.001）。Western blotting 顯示糖酵解相關(guān)蛋白HK1、LDHA表達(dá)水平與UBE2T表達(dá)水平相關(guān)。體外共培養(yǎng)模型顯示UBE2T過表達(dá)肝癌使Tregs細(xì)胞內(nèi)乳酸含量上調(diào)（Plt;0.001），增殖能力增加（Plt;0.05）以及免疫抑制功能上調(diào)（Il-10，Plt;0.05；TGF-β，Plt;0.001）。結(jié)論 UBE2T介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞放療抵抗可能與肝癌細(xì)胞糖酵解水平提高介導(dǎo)的免疫微環(huán)境中Tregs富集相關(guān)。

關(guān)鍵詞：泛素結(jié)合酶2T；肝細(xì)胞癌；放療抵抗；腫瘤免疫微環(huán)境；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

肝細(xì)胞癌（HCC）是我國常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居惡性腫瘤第6位，死亡率居第2位，嚴(yán)重威脅我國人民生命健康［1］。70%以上肝癌患者確診時已是中晚期，其5年生存率不足15%［2］。近年來，隨著調(diào)強(qiáng)放療、質(zhì)子放療等技術(shù)的不斷發(fā)展及放療劑量分割模式的變化，目前放療在肝癌中得到廣泛應(yīng)用。多項臨床研究表明，無論是在早期還是中晚期肝癌治療，放療均可使肝癌局部控制率得到顯著的提高［3-6］，然而，臨床上仍有30%左右的肝癌患者對放療不敏感［7］。因此，積極尋找介導(dǎo)肝癌放療抵抗的關(guān)鍵靶點(diǎn)尤為重要。

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為放療是通過誘導(dǎo)DNA損傷殺死腫瘤細(xì)胞達(dá)到腫瘤治療目的［8］。近年來研究表明［9， 10］，放療還可以通過激活機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)從而殺傷腫瘤。例如，放療通過增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞抗原呈遞和免疫識別，動員CD8+T 等免疫細(xì)胞攻擊腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而間接殺滅腫瘤［11， 12］。然而放療對于免疫系統(tǒng)激活作用仍十分有限，其原因在于腫瘤細(xì)胞利用其內(nèi)在促癌因子抑制放療的免疫激活作用，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的放療抵抗［13］。

泛素結(jié)合酶2T（UBE2T）是泛素結(jié)合酶（E2）家族的一員，參與將泛素結(jié)合到底物上，并以E2-酶依賴的方式在多種病理過程中發(fā)揮重要作用［14， 15］。Zhu等［16］的研究揭示了UBE2T通過促進(jìn)Akt的K63形式連接的多泛素化來增加嘧啶代謝，從而促進(jìn)HCC的發(fā)展。本課題前期研究中發(fā)現(xiàn)，UBE2T介導(dǎo)的H2AX/γH2AX單泛素化促進(jìn)細(xì)胞周期G2/M檢查點(diǎn)阻滯，為輻射誘導(dǎo)的DNA修復(fù)提供足夠的時間，從而導(dǎo)致HCC的放療抵抗［17］。那么，UBE2T介導(dǎo)的HCC放療抵抗是否與免疫微環(huán)境的改變相關(guān)？目前尚未發(fā)現(xiàn)有文獻(xiàn)報道肝癌中UBE2T與腫瘤免疫微環(huán)境的關(guān)系。因此，本研究擬探索在肝癌細(xì)胞中UBE2T對腫瘤免疫微環(huán)境的影響，從而探討UBE2T通過調(diào)控腫瘤免疫微環(huán)境影響肝癌細(xì)胞的放療敏感性及分子機(jī)制，為提高HCC治療效果提供實(shí)驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

鼠源性肝癌細(xì)胞株Hepa1-6 從中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫購得。胎牛血清（Gibco）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（Gibco）；胰蛋白酶（Gibco）；PerCP/Cyanine5.5 CD45抗體、FITC CD3 抗體、Brilliant Violet 510TM CD4 抗體、APC FoxP3 抗體、PE CD25 抗體 、FITC Ki67 抗體、APC TGF-β抗體（BioLegend）（稀釋比例均為1∶200）；細(xì)胞因子刺激劑（BD）；CD3/CD28 刺激抗體（STEMCELL）；IL-2（Gibco）；小鼠Tregs 分選試劑盒（Biolegend）；2-脫氧-D-葡萄糖（2-DG）（MCE）；流式破膜試劑盒（BD）；葡萄糖檢測試劑盒（Abcam）；乳酸檢測試劑盒（Abcam）；乳酸檢測試劑盒II（Sigma-Aldrich）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠肝癌細(xì)胞培養(yǎng)

將鼠源Hepa1-6 細(xì)胞于37 ℃，5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)和傳代。當(dāng)細(xì)胞生長融合度達(dá)到90%以上時，用0.25%的胰蛋白酶消化后傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗。

1.2.2 qPCR

檢測小鼠肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況 Trizol 提取LV-Control 組以及LV-UBE2T 組細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，RT-PCR檢測Ube2t mRNA水平。Ube2t引物序列見前期報道［16］。檢測Tregs Il-10表達(dá)情況 Trizol提取共培養(yǎng)后的Tregs 總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，RTPCR檢測Il-10 mRNA水平，引物序列見表1。

1.2.3 Western blotting

檢測UBE2T、LDHA、HK1蛋白表達(dá) 待細(xì)胞長滿約80% 密度時，PBS 清洗后加入RIPA裂解液，冰上裂解10 min，每5 min劇烈渦旋震蕩1次，12 000 r/min 離心10 min 后吸取上清，加入5×SDS混勻后沸水浴8 min，所得蛋白按照實(shí)驗室先前方法進(jìn)行Western blot實(shí)驗［17］。

1.2.4 克隆形成實(shí)驗

將細(xì)胞（1000/孔）置于6 孔板中，然后用不同劑量的IR（2～8 Gy）處理。細(xì)胞培養(yǎng)14 d，然后用甲醇固定，用結(jié)晶紫染色。具體分析方法參考實(shí)驗室先前方法［17］。

1.2.5 實(shí)驗動物和處理

由南方醫(yī)科大學(xué)動物中心提供C57BL/6小鼠（n=36）以及裸鼠（4～6周齡，n=24），雌性與雄性數(shù)量相等，隨機(jī)平均分為LV-Control、LV-Control+IR、LV-UBE2T和LV-UBE2T+IR組，分別將鼠源性肝癌細(xì)胞Hepa1-6（5×106個）皮下種植在C57BL/6小鼠以及裸鼠的右后背部，計算腫瘤體積：長×寬2/2。當(dāng)腫瘤達(dá)到約300 mm3時進(jìn)行射線照射治療，2 d/次測量腫瘤體積。用于觀察放療療效的目的，將終點(diǎn)指定為開始治療后的第18天。用于流式細(xì)胞術(shù)驗證瘤內(nèi)浸潤免疫細(xì)胞變化的目的，將終點(diǎn)指定為開始治療后的第9天。本研究動物實(shí)驗經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院實(shí)驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（倫理批號：NFYY-2021-1118）。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)分析瘤內(nèi)浸潤免疫細(xì)胞

麻醉后脫臼處死LV-Control、LV-UBE2T、LV-Control+IR 和LVUBE2T+IR組的小鼠，獲取各組中的等體積皮下瘤，經(jīng)酶消化液消化30 min后加入完全培養(yǎng)基重懸，于300 g/min離心5 min收集細(xì)胞。PBS洗滌2次后，細(xì)胞經(jīng)PBS重懸調(diào)整濃度至1～5×106/mL，取100 μL細(xì)胞懸液，加入PerCP/Cyanine5.5 CD45 抗體、FITC CD3 抗體、Brilliant Violet 510TM CD4 抗體、PE CD25 抗體混勻，置于4 ℃條件下避光孵育40 min，PBS洗滌2次后，加入500 μL 1×fixation/permeabilization buffer，置于4 ℃條件下避光孵育40 min，800 μL perm/wash Buffer洗滌兩次后，加入APC FoxP3抗體，置于4 ℃條件下避光孵育40 min，PBS洗滌2次后，置于流式細(xì)胞儀中檢測分析。

1.2.7 肝癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液葡萄糖及乳酸檢測

培養(yǎng)72 h 后收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，于800 r/min 離心5 min收集上清。根據(jù)制造商提供的乳酸檢測試劑盒使用說明操作，最后使用酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度值A(chǔ)570 nm，計算各細(xì)胞培養(yǎng)上清液中葡萄糖以及乳酸含量。

1.2.8 CIBERSORT免疫細(xì)胞浸潤相關(guān)性分析

將下載的基因表達(dá)矩陣進(jìn)行歸一化和整理，采用CIBERSORT法分析肝癌中22種免疫細(xì)胞的豐度，再將UBE2T以中位數(shù)分高、低表達(dá)組，分析在肝癌中與22種免疫細(xì)胞的差異，最后將每個免疫細(xì)胞與UBE2T 進(jìn)行相關(guān)性分析［18］。22種免疫細(xì)胞包括：未成熟的B細(xì)胞、記憶B細(xì)胞、漿細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、未成熟的CD4+T細(xì)胞、靜息記憶CD4+T細(xì)胞、活化記憶CD4+T細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、γδT細(xì)胞、靜息NK細(xì)胞、活化NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、M0型巨噬細(xì)胞、M1型巨噬細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞、靜息樹突細(xì)胞、活化樹突細(xì)胞、靜息肥大細(xì)胞、活化肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞。

1.2.9 生物信息學(xué)分析

利用TCGA肝細(xì)胞癌隊列進(jìn)行GSEA分析，以探索UBE2T影響肝細(xì)胞癌的潛在機(jī)制。參考基因集是來自分子特征數(shù)據(jù)庫（MSigDB）中的C2（c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt）。UBE2T的表達(dá)被注釋為高或低的UBE2T表型。隨機(jī)組合次數(shù)設(shè)置為1000次。當(dāng)Plt;0.05，則該基因集被視為顯著富集。

1.2.10 肝癌細(xì)胞與Tregs共培養(yǎng)處理

麻醉后脫臼處死小鼠，將小鼠脾臟制備成單細(xì)胞懸液，根據(jù)小鼠Tregs分選試劑盒說明書分選得到Tregs。體外使用CD3/CD28刺激抗體以及IL-2刺激活化Tregs 3 d，使Tregs達(dá)到實(shí)驗所需數(shù)量。通過使用0.4 μm Transwell板進(jìn)行肝癌細(xì)胞（下室）與Tregs（上室）共培養(yǎng)，并接受IR處理，進(jìn)行IR前2 h將2-DG加入至下室。共培養(yǎng)48 h后收集上室中的Tregs進(jìn)行下一步分析。

1.2.11 Tregs 細(xì)胞內(nèi)乳酸含量檢測

收集共培養(yǎng)后的Tregs，PBS洗滌2次后，根據(jù)制造商提供的乳酸檢測試劑盒II使用說明操作，最后使用酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度值A(chǔ)450 nm，計算各組Tregs細(xì)胞內(nèi)乳酸含量。

1.2.12 流式細(xì)胞術(shù)分析Tregs

收集共培養(yǎng)后的Tregs，PBS洗滌2次后，使用細(xì)胞因子刺激劑于37 ℃孵育4 h。PBS 洗滌2 次后，加入500 μL 1×fixation/permeabilization buffer，置于4 ℃條件下避光孵育40 min，800 μL perm/wash Buffer 洗滌2 次后，加入FITC Ki67抗體或APC TGF-β抗體，置于4 ℃條件下避光孵育40 min，PBS洗滌2次后，置于流式細(xì)胞儀中檢測分析。

1.2.13 統(tǒng)計學(xué)分析

運(yùn)用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗進(jìn)行兩組間均數(shù)比較；采用單因素方差分析進(jìn)行多組間均數(shù)比較；Plt;0.05（雙側(cè)）為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有實(shí)驗都獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 UBE2T導(dǎo)致肝癌細(xì)胞放療抵抗

qPCR 及Western blot 結(jié)果顯示，與對照組相比，LV-UBE2T 肝癌細(xì)胞中的UBE2T 表達(dá)量在mRNA水平以及蛋白水平都顯著上調(diào)（圖1A、B）。單克隆形成實(shí)驗表明過表達(dá)UBE2T可使小鼠肝癌細(xì)胞在接受放療后的存活比例升高（圖1C、D）。同時，我們對裸鼠以及C57BL/6 小鼠的皮下瘤進(jìn)行3 次劑量為6Gy 的射線照射，并在放療開始的第18天結(jié)束觀察（圖1E）。在無射線照射的情況下，LV-UBE2T組的裸鼠皮下瘤體積顯著高于LV-Control組（Plt;0.01）；而射線照射對LV-Control組的皮下瘤的抑制作用顯著優(yōu)于LV-UBE2T組中的皮下瘤（Plt;0.05，圖1F、G）。而在免疫正常的C57BL/6小鼠中，過表達(dá)UBE2T可促進(jìn)小鼠皮下瘤增殖（Plt;0.01），而接受放療后，LV-Control組的皮下瘤生長可以顯著被抑制，而LV-UBE2T組中的皮下瘤則無法被抑制（Plt;0.01，圖1H～J）。

2.2 UBE2T 表達(dá)量與肝癌中免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性分析。

CIBERSORT 分析結(jié)果顯示，在肝癌中的UBE2T表達(dá)水平與多種腫瘤浸潤免疫細(xì)胞顯著相關(guān)，其中樹突狀細(xì)胞（Plt;0.01），輔助性T細(xì)胞（Plt;0.001），總體淋巴細(xì)胞（Plt;0.05），調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Tregs）（Plt;0.0001）在UBE2T高表達(dá)的肝癌中浸潤顯著增加（圖2A～C、G、I）。而M2 型巨噬細(xì)胞（Plt;0.01）以及單核細(xì)胞（Plt;0.05）則在UBE2T高表達(dá)的肝癌中浸潤減少（圖2E、F）。M1型巨噬細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞/Tregs的比例在兩組間無顯著差異（圖2D、H、J）。

2.3 UBE2T促進(jìn)Tregs在肝癌中的浸潤

對C57BL/6小鼠肝癌皮下瘤進(jìn)行3次6Gy的射線照射，之后收集皮下瘤進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測（圖3A）。結(jié)果顯示，無射線照射的兩組皮下瘤中CD4+/CD3+的比例無顯著差異，但Tregs的數(shù)量在LV-UBE2T組皮下瘤中顯著增加（Plt;0.05，圖3B～E）。而在接受射線照射后的皮下瘤中，CD4+/CD3+的比例（Plt;0.01）和Tregs 的數(shù)量（Plt;0.001）在LV-UBE2T組中均顯著增多（圖3B～E）。

2.4 UBE2T提高肝癌細(xì)胞糖酵解水平

與LV-Control組相比，LV-UBE2T組中的肝癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的葡萄糖濃度顯著降低（Plt;0.05），而乳酸濃度顯著增高（Plt;0.01），在接受放療后，LV-UBE2T組上清液中的葡萄糖濃度降低以及乳酸濃度增高更為顯著（葡萄糖，Plt;0.001；乳酸，Plt;0.0001）（圖4A、B）。同時，基因富集分析結(jié)果顯示UBE2T表達(dá)量與糖酵解以及Tregs 相關(guān)表達(dá)基因高度正相關(guān)（Plt;0.0001，圖4C～E）。Western blotting結(jié)果顯示，敲低肝癌細(xì)胞中的UBE2T后，與糖酵解相關(guān)的蛋白HK1以及LDHA表達(dá)水平下降，而過表達(dá)UBE2T后，HK1 以及LDHA表達(dá)增加（圖4F～G）。

2.5 過表達(dá)UBE2T肝癌擴(kuò)增激活Tregs

將Tregs 與LV-Control 或LV-UBE2T 肝癌細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)并接受IR處理，同時加入或不加入糖酵解抑制劑2-DG（圖5A）。結(jié)果顯示，與LV-Control肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)的Tregs相比，與LV-UBE2T肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)的Tregs 細(xì)胞內(nèi)乳酸含量顯著升高（Plt;0.0001），而加入2-DG則會使其含量下降（Plt;0.01，圖5B）。同時，與LVControl共培養(yǎng)組相比，與LV-UBE2T肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)的Tregs增殖能力顯著上調(diào)（Plt;0.05），而同時加入2-DG時Tregs增殖能力則被抑制（Plt;0.01，圖5C～D）。qPCR以及流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與LV-Control 共培養(yǎng)組相比，LV-UBE2T 共培養(yǎng)組中Tregs Il-10 表達(dá)水平以及TGF-β含量顯著上調(diào)（Il-10，Plt;0.05；TGF-β，Plt;0.001），而在LV-UBE2T肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)同時加入2-DG組中的Tregs Il-10表達(dá)水平以及TGF-β含量相較于LV-UBE2T共培養(yǎng)組則顯著下調(diào)（Il-10，Plt;0.01；TGF-β，Plt;0.01，圖5E～G）。

3 討論

根據(jù)一項全球分析，肝癌新病例和相關(guān)死亡率預(yù)計將急劇上升，據(jù)預(yù)測，到2040年預(yù)計有130萬人死于肝癌［19］。面對如此嚴(yán)峻的患病形勢，對肝癌進(jìn)行深度探究以尋求提高肝癌患者預(yù)后的突破口尤為重要。多項研究表明，在卵巢癌、肺癌、乳腺癌和肝癌等惡性腫瘤中觀察到UBE2T的異常表達(dá)情況［16， 20-23］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)UBE2T在肝癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，且與肝癌患者預(yù)后不良顯著相關(guān)，提示UBE2T在肝癌的發(fā)生和發(fā)展過程中可能扮演著癌基因的角色［16］。本研究運(yùn)用克隆形成實(shí)驗、小鼠皮下瘤模型、CIBERSORT免疫浸潤分析、體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗驗證以及GSEA富集分析，分析了肝癌細(xì)胞中UBE2T的異常表達(dá)對肝癌放療敏感性的調(diào)控作用和分子機(jī)制，結(jié)果顯示UBE2T在肝癌中高表達(dá)會導(dǎo)致肝癌放療抵抗。

放療是一種常見的癌癥治療方法，利用高能量的電離輻射（如X射線、γ射線或質(zhì)子束）照射腫瘤組織，通過造成腫瘤細(xì)胞DNA損傷、引起腫瘤細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯、微血管損傷等機(jī)制阻止腫瘤增殖［24-26］。然而，肝癌的形成和進(jìn)展涉及眾多因素的錯綜復(fù)雜過程，因此放療的成效亦受多方面因素的影響［27］。Fang等［28］研究報道葡萄糖和心磷脂合成代謝的整合可通過調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞中細(xì)胞色素c的分泌來介導(dǎo)放療抵抗。Hong等［29］研究報道人解螺旋酶蛋白（RECQL4）修復(fù)放療過程中腫瘤細(xì)胞釋放的雙鏈DNA，抑制樹突狀細(xì)胞（DC）的cGASSTING信號通路，阻止放療誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)有效激活，導(dǎo)致肝癌放療抵抗。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，在免疫系統(tǒng)正常的C57BL/6小鼠以及缺乏成熟T淋巴細(xì)胞的裸鼠中UBE2T高表達(dá)均能導(dǎo)致肝癌放療抵抗，且該放療抵抗特性在免疫系統(tǒng)正常的C57BL/6小鼠中更為顯著。UBE2T在裸鼠中能導(dǎo)致放療抵抗的現(xiàn)象與本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)以及Yin 等在非小細(xì)胞肺癌上的研究結(jié)果一致［17， 30］。而在本次研究中UBE2T高表達(dá)肝癌的放療抵抗特性在免疫系統(tǒng)正常小鼠上更顯著的新發(fā)現(xiàn)提示了UBE2T所介導(dǎo)的肝癌放療抵抗與腫瘤免疫微環(huán)境（TIME）關(guān)系密切。

在本研究設(shè)計中，我們選擇了2個關(guān)鍵的終點(diǎn)。第一個是觀察小鼠皮下瘤生長體積變化的終點(diǎn)。根據(jù)我們課題組之前使用UBE2T肝癌細(xì)胞系構(gòu)建小鼠皮下瘤的經(jīng)驗，以及在研究設(shè)計過程中對觀察終點(diǎn)的預(yù)實(shí)驗探索，我們發(fā)現(xiàn)在開始放療后的第18天，各組皮下瘤體積之間已經(jīng)出現(xiàn)顯著差異，并且符合實(shí)驗動物倫理標(biāo)準(zhǔn)。因此，我們將小鼠皮下瘤生長體積的觀察終點(diǎn)定為開始放療后的第18天。另一個是檢測免疫細(xì)胞在腫瘤組織內(nèi)的浸潤情況的終點(diǎn)。Zhang 等［31］通過多時間點(diǎn)的單細(xì)胞測序發(fā)現(xiàn)，在小鼠結(jié)束放療后的第4天，TIME處于相對穩(wěn)定的免疫反應(yīng)階段。結(jié)束放療后4 d再進(jìn)行檢測可允許足夠的時間讓免疫細(xì)胞對放療引起的腫瘤抗原釋放做出反應(yīng)。因此，綜合考慮以上因素，我們將檢測終點(diǎn)定于開始放療后的第9 天（即結(jié)束放療后的第4天），以準(zhǔn)確評估Tregs對UBE2T高表達(dá)肝癌放療抵抗性的調(diào)控作用。

TIME是指存在于腫瘤組織周圍的免疫細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、血管及其相關(guān)因子等組成的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)，與腫瘤的進(jìn)展與治療抵抗息息相關(guān)［32］。Song等［33］研究報道泛素連接酶UBR5 可通過CCL2/CSF-1 的旁分泌途徑募集腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)免疫抑制從而導(dǎo)致卵巢癌發(fā)展。de Galarreta等［34］研究報道肝癌細(xì)胞CTNNB1突變可下調(diào)CCL5的表達(dá)并影響DC募集，從而促進(jìn)肝癌的免疫逃逸以及免疫治療抵抗。目前尚未有關(guān)于UBE2T在肝癌中調(diào)控免疫細(xì)胞的報道。本研究中，在不接受放療的情況下，相比起LV-Control組，我們發(fā)現(xiàn)LV-UBE2T組肝癌細(xì)胞所處的TIME中，CD4+T細(xì)胞的比例無顯著差異，但浸潤的Tregs 實(shí)際數(shù)量顯著增加。Tregs是一群以CD4+CD25+Foxp3+為典型標(biāo)志物的免疫抑制細(xì)胞亞群，在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫平衡和防止免疫系統(tǒng)過度活化中發(fā)揮重要的作用［35-37］。在TIME 中累積的Tregs不僅可以通過分泌TGF-β、IL-10等抑制性細(xì)胞因子阻礙有效的抗腫瘤免疫，還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)來抑制CD8+T細(xì)胞遷移至TIME，抑制細(xì)胞毒性T細(xì)胞的功能，導(dǎo)致免疫逃逸［38-40］。本研究中，在接受放療后，LV-UBE2T 組瘤內(nèi)浸潤的CD4+T 細(xì)胞的比例以及Tregs的實(shí)際數(shù)量均高于LV-Control組。早期有研究表明，由于Tregs對射線的敏感性低于其他淋巴細(xì)胞類型，射線在殺死癌細(xì)胞以外可以殺死其余淋巴細(xì)胞，而Tregs在TIME中仍持續(xù)存在［41］。這提示了UBE2T高表達(dá)的肝癌在接受放療后，會形成抑制性更強(qiáng)的TIME。因此我們推測，UBE2T 高表達(dá)的肝癌會引起Tregs 富集，在接受放療后，非但沒有激活腫瘤免疫微環(huán)境，而是加劇了Tregs富集程度，阻礙了抗腫瘤免疫反應(yīng)的有效激活，最終導(dǎo)致肝癌進(jìn)展。

目前僅有少數(shù)文獻(xiàn)報道腫瘤中UBE2T的表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系。郭康等［42］研究報道在乳腺癌中UBE2T 表達(dá)與常見的體液免疫B細(xì)胞的浸潤呈正相關(guān)，與腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞浸潤呈負(fù)相關(guān)。而于運(yùn)亮等［43］研究報道在胰腺癌患者中UBE2T與巨噬細(xì)胞浸潤亦呈負(fù)相關(guān)。本研究分析結(jié)果提示在肝癌中UBE2T表達(dá)與DC、濾泡輔助性T 細(xì)胞、M2 型巨噬細(xì)胞以及Tregs浸潤呈正相關(guān)。由此可見，UBE2T在不同的癌癥類型中與免疫細(xì)胞浸潤相關(guān)關(guān)系存在差異，提示UBE2T在不同癌癥類型中發(fā)揮作用的機(jī)制不相同。

Tregs在腫瘤中富集的原因是多方面的，例如腫瘤細(xì)胞釋放趨化因子CCL22和CCL17吸引Tregs遷移到腫瘤部位；腫瘤細(xì)胞分泌的生長因子如TGF-β能夠促進(jìn)Tregs的生存、增殖和活化；腫瘤微環(huán)境的缺氧和代謝產(chǎn)物，如乳酸和酸化微環(huán)境，也能夠促進(jìn)Tregs的增殖和功能［40］。在有氧狀態(tài)下，腫瘤細(xì)胞仍會優(yōu)先選擇糖酵解，而不是選擇能夠高效產(chǎn)能的氧化磷酸化以提供腫瘤細(xì)胞所需能量，這種現(xiàn)象稱之為“Warburg效應(yīng)”，即有氧糖酵解［44-46］。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)UBE2T的肝癌細(xì)胞上清液中葡萄糖含量下降，乳酸含量升高，即肝癌細(xì)胞糖酵解水平提高。并且GSEA 富集分析提示UBE2T高表達(dá)肝癌與糖酵解相關(guān)基因集以及Tregs相關(guān)表達(dá)基因集高度正相關(guān)。已有研究報道顯示，低葡萄糖、高乳酸、低氧的環(huán)境不適合效應(yīng)T 細(xì)胞的生存，CD8+T 細(xì)胞難以發(fā)揮功能，導(dǎo)致抗腫瘤免疫反應(yīng)下降［47-49］。但是Tregs卻可以在如此苛刻的TIME中大量浸潤并實(shí)現(xiàn)免疫抑制功能，其原因在于Tregs能夠攝取乳酸維持三羧酸循環(huán)，為Tregs的增殖提供能量以及維持免疫抑制活性［50-52］。因此，UBE2T高表達(dá)肝癌細(xì)胞糖酵解水平提高，TIME中乳酸含量上升，塑造了一個適合Tregs生存的環(huán)境。

綜上所述，UBE2T高表達(dá)可導(dǎo)致肝癌免疫微環(huán)境中Tregs富集以及肝癌細(xì)胞產(chǎn)生放療抵抗，其放療抵抗特性可能是由于UBE2T通過提高肝癌細(xì)胞糖酵解水平，使腫瘤免疫微環(huán)境中乳酸增加，有利于Tregs的增殖以及維持其免疫抑制功能，使放療不能有效激活抗腫瘤免疫，但其具體分子機(jī)制仍有待更深入的探索。

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（編輯：經(jīng) 媛）

基金項目：國家自然科學(xué)基金（82373318，82073343） ；廣東省自然科學(xué)基金（2023A1515010608）